《维罗尔杂志》。1998年10月；72(10): 7960–7971.
E1B 55-Kilodalton相关蛋白：一种具有RNA-结合活性的细胞蛋白，与腺病毒和细胞mRNA的核质转运有关
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斯特凡·加布勒
德国雷根斯堡大学医学与卫生研究所，D-93053，1和新泽西州普林斯顿大学分子生物学系霍华德·休斯医学研究所08544-10142
霍尔格·舒特
德国雷根斯堡大学医学与卫生研究所，D-93053，1和新泽西州普林斯顿大学分子生物学系霍华德·休斯医学研究所08544-10142
彼得·格罗伊特
德国雷根斯堡大学医学与卫生研究所，D-93053，1和新泽西州普林斯顿大学分子生物学系霍华德·休斯医学研究所08544-10142
汉斯·沃尔夫
德国雷根斯堡大学医学与卫生研究所，D-93053，1和新泽西州普林斯顿大学分子生物学系霍华德·休斯医学研究所08544-10142
托马斯·申克
德国雷根斯堡大学医学与卫生研究所，D-93053，1和新泽西州普林斯顿大学分子生物学系霍华德·休斯医学研究所08544-10142
托马斯·多布纳
德国雷根斯堡D-93053雷根斯堡大学医学与卫生研究所，1和新泽西州普林斯顿大学分子生物学系霍华德·休斯医学研究所08544-10142
德国雷根斯堡D-93053雷根斯堡大学医学与卫生研究所，1和新泽西州普林斯顿大学分子生物学系霍华德·休斯医学研究所08544-10142
收稿日期：1998年3月12日；1998年7月1日接受。
摘要
腺病毒5型（Ad5）早期1B 55-kDa蛋白（E1B-55kDa）是一种多功能磷酸蛋白，可调节溶血感染细胞中病毒DNA复制和核质RNA转运。此外，E1B-55kDa与E1A蛋白一起提供啮齿动物细胞完全致癌转化所需的功能。利用远西部技术，我们分离出编码E1B-55kDa相关蛋白（E1B-AP）的人类基因。E1B-AP5基因编码异质核核糖核蛋白（hnRNP）家族的一种新的核RNA-结合蛋白，该蛋白与hnRNP-U/SAF-a高度相关。免疫沉淀实验表明，在腺病毒感染细胞中，与E1B-AP5形成复合物需要55-kDa多肽中两个不同的片段，这两个片段部分重叠了负责p53结合的区域，并且这种蛋白相互作用受到腺病毒E4orf6蛋白的调节。E1B-AP5的表达可有效干扰Ad5 E1A/E1B介导的大鼠原代细胞转化。此外，E1B-AP5在Ad感染的细胞中的稳定表达克服了E1B依赖性对细胞质宿主mRNA积累的抑制。这些数据表明，E1B-AP5可能在RNA转运中发挥作用，并且该功能受感染细胞中E1B-55kDa的调节。
根据惯例，腺病毒（Ad）的复制周期分为两个阶段，这两个阶段由病毒DNA复制的开始分开（参考文献综述66). 在感染的晚期，由于宿主细胞mRNA的翻译阻断，细胞蛋白质合成被阻断（参考文献综述80). 此外，尽管核不断合成和加工，但大多数细胞mRNA未能在细胞质中积累(4). 相反，晚期病毒mRNA选择性地输出到细胞质，并在感染后的晚期有效翻译(1,5). 这种对细胞基因表达的严重抑制似乎是由在翻译和核质mRNA转运水平上运作的病毒蛋白介导的(2,54,79).
病毒mRNA在感染后期的选择性积累由一种蛋白质复合物介导，该复合物包括Ad早期1B 55-kDa（E1B-55kDa）和E4orf6蛋白(8,29,63). E1B-E4蛋白复合物似乎在转录和处理后，但在mRNA通过核孔移位之前调节病毒和细胞mRNA的转运(41). 免疫荧光和免疫电镜研究表明，这两种蛋白都位于核病毒包涵体内部和周围(52)被认为是病毒转录和/或复制的位点(34,55). 这一观察结果与E1B-E4蛋白复合体在核内步骤调节RNA代谢的观点一致，可能是通过促进成熟病毒mRNA向核孔复合体的移动(11,40,50). 选择性转运不依赖于单个mRNA的身份。从重组病毒染色体转录的细胞mRNA在感染后很晚被转运到细胞质，即使在内源性细胞转录物仅限于细胞核的时候(20,30).
奥内尔斯和申克(52)提出了一种模型，通过该模型，E1B-E4蛋白复合物促进病毒mRNA的运输和积累，同时阻断大多数宿主mRNA的相同过程。根据他们的提议，E1B-E4复合物将mRNAs核质转运所需的细胞因子从宿主细胞转录和加工位点重新定位到病毒复制/转录中心。该模型与细胞剪接因子和异质核核糖核蛋白颗粒（hnRNP）蛋白在感染后期重新分布到病毒RNA转录和DNA积累位点的观察结果一致(34). 此外，Ad12-转化细胞的亚细胞分离表明，E1B-54kDa存在于细胞核中的高分子量复合物中，表明54-kDa蛋白与一种或多种细胞成分相关(28). 观察到Ad5 E1B-55kDa介导的病毒mRNA的积累依赖于不同病毒mRNA中的残余剪接位点，这表明参与异质核RNA加工的核蛋白可能是E1B-55kDa蛋白的靶点(11,40). E4orf6和E4orf 3蛋白也有类似的功能，独立于E1B-55kDa(51). 这两种蛋白质似乎都编码在裂解病毒感染期间有效的三方前导剪接所需的冗余功能(50,51). 这些观察结果表明，E1B-55kDa和E4区的两种蛋白质调节mRNA形成的一般途径。Ad5 E1B-55kDa而非E4orf6干扰mRNA输出的证据酿酒酵母(42)表明病毒mRNA选择性转运所需的晚期功能主要编码在55kDa多肽中。然而，E1B-E4蛋白复合物调节mRNA转运的分子机制以及假定转运因子的特性尚不清楚。
我们已经鉴定出一种新的蛋白质，称为E1B-相关蛋白（E1B-AP5），在体内外与E1B-55kDa特异结合。E1B-AP5是hnRNP蛋白家族的一个核RNA-结合蛋白，与hnRNP-U/SAF-a高度相关。E1B-55kDa/E1B-AP5蛋白相互作用由55-kDa多肽中的两个片段介导，这两个片段部分重叠了负责p53结合的区域。在没有E4orf6蛋白的情况下，更多的E1B-55kDa可以与E1B-AP5结合，这表明E4蛋白调节复合物的形成。在Ad5 E1A/E1B介导的转化分析中，E1B-AP5的表达导致转化细胞的数量显著减少。此外，我们证明E1B-AP5的稳定表达克服了E1B-55kDa依赖性阻断Ad感染细胞中宿主细胞mRNA输出。我们的数据表明，E1B-AP5可能在核质mRNA转运中发挥重要作用，并且至少是E1B-55kDa在晚期感染细胞中选择性积累mRNA的细胞蛋白之一。
材料和方法
的生成32P-标记GST融合蛋白和文库筛选。
野生型Ad5 E1B-55kDa表达的pGEX构建物是通过替换p11/55.X的5′-非翻译区（Ad5核苷酸[nt]1974至2018）制成的(62)带有序列为5′-GATCCATGGAGCGAAGAAAACCATCTGAGCGGGGGTAC-3′和5′-CCCCC GCTCAGATGGTTCTCCGCTCCATG-3′的寡核苷酸，由巴姆HI和千磅一、该构建物的DNA序列得到了确认。添加后巴姆钝化的HI连接体Xba公司I位点位于p11/55.BX，2088-bp巴姆HI片段插入巴姆pGEX-2Tk聚链接体的HI位点(35).
谷胱甘肽的制备与纯化S公司-转移酶（GST）和GST融合蛋白如前所述(62). 为了生成放射性标记的GSTE1B-55kDa融合蛋白，我们使用了Kaelin等人（(35). 简言之，在1×HMK缓冲液（20 mM三氯化钠[pH7.5]、100 mM氯化钠、12 mM氯化镁）中平衡结合到谷胱甘肽-脑葡萄糖珠的GSTE1B-55kDa2). 融合蛋白在1×HMK缓冲液中标记30分钟，温度为30°C，其中250 U为环AMP依赖性蛋白激酶（Sigma）催化亚基，250μCi为[γ]-32P] ATP（5000 Ci/mmol；Amersham）。通过添加HMK停止缓冲液（10 mM磷酸钠[pH8.0]，10 mM焦磷酸钠，10 mM-EDTA，1 mg牛血清白蛋白/ml）终止反应。通过抽吸去除上清液，并使用5珠体积的NETN（20 mM三氯化钠[pH8.0]、100 mM氯化钠、1 mM EDTA、0.5%非奈特P-40[NP-40]）清洗Sepharose五次。将标记的GST融合蛋白在3粒体积的50 mM还原型谷胱甘肽–100 mM三氯化钠（pH 8.0）–120 mM氯化钠中在持续搅拌下洗脱30分钟。
表达式库屏幕的执行如前所述(35). 总计2×106筛选HeLa cDNA文库（Clontech）的重组噬菌体。进行了三轮筛选以获得纯噬菌体种群。从感兴趣的克隆中制备DNA，并用生态RI获得cDNA插入物，随后将其亚克隆到pBKRSV（Stratagene）中进行DNA测序。
为了分离E1B-AP5重叠cDNA克隆，用HeLa cDNA文库重新筛选32如前所述，来自E1B-AP5/2的P标记DNA片段和来自克隆E1B-AP3/3的3′限制性片段(14). 将阳性克隆进行斑块纯化，并通过亚克隆到pBKRSV和DNA测序进行分析。
同源搜索。
GenBank和SwissProt数据库中的同源搜索和比对是通过使用INDY工作站（Silicon Graphics）上的Genetics Computer Group FASTA程序（8.1版）和国家生物技术信息中心数据库中的BLAST同源查找程序远程进行的。通过使用蛋白质位点和模式的Prosite字典中的FIND PATTERN程序来分析蛋白质基序和模式。
RNA和蛋白质分析。
总RNA和细胞质RNA的分离方法以及Northern杂交分析已在前面描述过(13,46). 从不同细胞系中分离出的总RNA是雷利（雷根斯堡大学）慷慨捐赠的。人β-肌动蛋白基因片段(46)标记为[α-32P] dCTP并用作细胞探针DNA。病毒L3和L5/E4 cDNA被用作病毒探针DNA(29).
为了产生E1B-AP5特异性免疫抗原，用引物fw（5′-GCGCGGATCCGGATCGCGGATGGATGGTGCCGCGTCTGAAGGTGACGG-3′）和rev（5′-GCGCGCGTCGACCTACTGTGTACTGCCACCCTGTTGTGTGTG-3′）通过PCR产生了一个2570bp的片段，该片段对应于E1B-AP5cDNA中的nt 174和2744，引物引入了巴姆5′端的HI站点和萨尔I分别位于3′端。该片段被插入巴姆HI和萨尔pGEX-5X1（Pharmacia）的I位点生成pGEXE1B-AP5。GST融合蛋白在大肠杆菌DH5α，亲和纯化，用于免疫雌性新西兰白兔（查尔斯河）。在第四次增强后14天收集血清，产生E1B-AP5多克隆抗体。我们的研究中也使用了单克隆抗体：2A6(65)和9C10（癌基因科学）针对E1B-55kDa、RSA3(44)针对E4orf6蛋白B6(58)对E2A-72kDa蛋白具有特异性；12CA5（Boehringer）对HA表位具有特异性。
用于蛋白质的蛋白质印迹或免疫沉淀分析(62)，在每个90 mM直径的培养皿中，在裂解缓冲液（50 mM三氯化钠[pH8.0]，5 mM EDTA，150 mM氯化钠，0.15%NP-40，0.05 mM苯甲基磺酰氟）中制备全细胞提取物。在冰上放置1小时后，对裂解液进行超声波处理，并以10000×克温度为4°C。如有必要，用50μCi的[35S] 提取液制备前，蛋氨酸（Amersham）每90mm平板。电泳后，通过放射自显影或增强化学发光（Amersham）检测蛋白质。通过使用Analyze Particles程序（NIH Image 1.52）从TIFF文件中对蛋白质进行定量。
间接免疫荧光。
将生长在玻璃盖玻片上的Ad5和模拟感染细胞在磷酸盐缓冲液（PBS）中洗涤两次，然后用4%多聚甲醛在CSK缓冲液{100 mM KCl、300 mM蔗糖、3 mM MgCl中培养固定2，1 mM EGTA[乙二醇双（β-氨基乙醚）-N个,N个,N个’，N个'-四乙酸]，10 mM管道[哌嗪-N个,N个′-双（2-乙磺酸）；pH 6.8]，1.5 mM苯甲基磺酰氟}，在室温下保持10分钟。将细胞在室温下用0.5%Triton X-100在CSK缓冲液中透化15分钟。细胞在含有0.1%吐温20的PBS中清洗三次，并在室温下在封闭缓冲液（0.5%封闭试剂，10 mM三氯化钠[pH7.5]，150 mM氯化钠）中培养30分钟。样品与一级抗体在室温下孵育1小时，用PBS–0.1%吐温20洗涤三次，然后用10μg小鼠或兔免疫球蛋白g（Dako）特异性荧光素或Cy3-结合羊抗体孵育1h。在PBS中洗涤五次后，将样品固定在每毫升含有0.5μg 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的PBS甘油中，并通过使用落射荧光照明在Leitz AristoplanPhotomicroscope上观察。
体外结合试验。
按照制造商的规定，在一个耦合转录翻译系统（TnT；Promega）中用1μg DNA、40μCi[35S] 蛋氨酸（1000 Ci/mmol；Amersham）和T7或T3 RNA聚合酶。为了进行体外结合，将5μl网织物裂解物添加到含有20μl纯化GST融合蛋白的200μl结合缓冲液（50 mM三氯化钠[pH8.0]、5 mM EDTA、150 mM氯化钠、0.15%NP-40、1 mM二硫苏糖醇、0.05 mM苯甲基磺酰氟）中，并在4°C下旋转1 h。在进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和放射自显影之前，用1ml结合缓冲液将基质冲洗五次。
RNA和ssDNA-结合分析。
如前所述，基本上进行了体外翻译的E1B-AP5与核糖核苷酸均聚物和单链DNA（ssDNA）的结合(37). 简言之，通过体外翻译产生放射性标记的E1B-AP5蛋白，并与3μg相应的核糖核苷酸均聚物（Pharmacia）和ssDNA-琼脂糖（GIBCO）在250μl DA250缓冲液（10 mM HEPES/NaOH[pH7.9]、250 mM NaCl、1.5 mM MgCl）中孵育2)在4°C下保持1小时。将与琼脂糖珠结合的E1B-AP5蛋白在含有0.25、0.5或1 M NaCl的DA缓冲液中洗涤五次，并通过SDS-PAGE进行分析，然后进行放射自显影。
细胞和病毒。
所有细胞系在添加10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle's培养基中作为单层培养物生长。为了产生表达表位标记的E1B-AP5的稳定细胞系，将8μg的pSVfluE1B-AP6与1.5μg的p Babe-puro共同转染(47)进入H1299细胞(45)通过磷酸钙共沉淀，在含有0.5μg嘌呤霉素（Sigma）/ml的培养基中分离稳定的转染子（H12-AP5细胞）巴姆HI（高）-萨尔我将pGEXE1B-AP5片段化为pAS2（由S.Elledge善意提供）。然后将E1B-AP5 cDNA从pAS2融合到HA标签，插入生态RI和萨尔pSVK3（Pharmacia）的I位点。
H5型重量在这些研究中，300人作为野生型Ad5亲本。使用了以下变异病毒：H5数字图书馆338在位于nt 2805和3329之间的E1B编码区中携带524 bp缺失(54). E1B-55kDa基因中的连接子插入突变H17、A143、H180、H224、A262、R309、H326、H354、S380、R443和F484已在前面描述过(76). 含有这些突变的突变体是Ad2和Ad5的重组体，首先用一个字母表示插入处的限制位点，然后用一个数字表示4个氨基酸插入处或之前的氨基酸残基。突变型H5在里面3328（+）产生一种E1B蛋白，在Ile-438和Trp-439之间含有11-氨基酸（aa）插入物(72). 在E1B突变型H5中下午490A/491A，Ser-490和Ser-491的密码子已更改为丙氨酸密码子(72). H5型数字图书馆355在nt2331和2346之间的E4orf6基因中包含一个14-bp的缺失(29)并且不表达E4orf6蛋白(29); H5型数字图书馆341在E4orf3基因中包含一个1-bp的缺失，并且确实表达E4orf 3蛋白(64). Ad5野生型病毒在A549细胞上繁殖(21)或H1299电池(45). E1B和E4突变病毒在293细胞上繁殖(25)或W162电池(73)分别是。通过氯化铯平衡密度离心纯化的病毒用于所有感染。
如前所述，通过PCR测定Ad-DNA复制(62).
结果
为了分离编码能与E1B-55kDa特异相互作用的细胞蛋白的cDNA，我们筛选了2×106带有放射性标记GSTE1B-55kDa蛋白的HeLa细胞λgt11表达库的重组噬菌体。共有12个克隆编码融合蛋白，这些融合蛋白与32鉴定出具有高亲和力的P-GSTE1B-55kDa。根据序列分析，这些蛋白分为五类，被称为E1B-相关蛋白E1B-AP1至E1B-AP5。在本研究中，我们重点关注E1B-AP5克隆家族。其余E1B-相关蛋白的特征将在其他地方描述。
E1B-AP5是hnRNP家族的新成员。
几个E1B-AP5 cDNA片段被组装成3513 bp的连续片段（图。A） ●●●●。E1B-AP5 cDNA序列分析显示，从nt174到2742有一个很大的开放阅读框（图。B） ●●●●。所提出的起始密码子处于有利的起始环境中(38)预测的蛋白质含有856个氨基酸残基，分子量为95805Da，pI为6.5。
E1B-AP5 cDNA图谱、核苷酸序列和预测氨基酸序列。（A） 用[γ-32P] 来自λgt11 HeLa cDNA表达库的ATP标记GSTE1B-55kDa蛋白探针。用E1B-AP5/2重新筛选，然后用E1B-AP5/3的3′端的一个片段从同一文库中分离出E1B-AP3/3到E1B-AP7/7的cDNA克隆。顶部的黑色粗条表示E1B-AP5的2568-bp开放式阅读框。细条分别表示5′和3′未翻译序列。一些独特的限制性内切酶的位置显示在条形图上方。（B） 通过在pBKRSV中组装E1B-AP5/6和E1B-AP7/7的限制性片段，生成完整的E1B-AP5 cDNA序列。通过序列衍生寡核苷酸引物，对每条cDNA克隆进行两次测序。预测的氨基酸序列显示在单字母代码中。
通过使用FASTA和BLAST同源性查找器将E1B-AP5开放阅读框的预测氨基酸序列与蛋白质数据库进行比较，发现E1B-AP五的三个区域与之前报道的蛋白质序列高度相关（图。A） ●●●●。该序列中最显著的相似性是与人类120kDa hnRNP-U/SAF-A蛋白(37). 这种蛋白质有两种亚型(18)据报道，这两种药物都能结合同聚RNA(37)和脊椎动物支架连接区DNA元件(17). 亚型1的预测蛋白质序列在aa198和598之间E1B-AP5区域的400-aa范围内是56%相同的（图。B） ●●●●。E1B-AP5与hnRNP-U/SAF-A的第二亚型无关2+-结合基序（残基547到550），两者都是鸟嘌呤核苷酸结合所必需的(7). 值得注意的是，这些基序在E1B-AP5中以相同的顺序排列在一个配置中，与来自几个物种的小GTP-结合蛋白Ran中的序列具有可比的间距（122-aa重叠中22%的同源性）。E1B-AP5羧基末端部分的第二个区域（残基612到666）包含紧密间隔的RGG重复序列（图。C） ●●●●。RGG盒基序参与RNA结合(37)并存在于许多病毒和细胞蛋白中，在RNA代谢中可能发挥作用（参考文献综述9). 最后，在预测的E1B-AP5序列的羧基末端有第三个与RNA-结合蛋白hnRNP-G的氨基末端相似的区域（280-aa重叠中有23%的相同性）(69)（图。A） ●●●●。该蛋白是核糖核酸体的组成部分，可能通过一个RNP共识RNA-结合域与RNA结合。E1B-AP5的羧基末端255-aa结构域富含脯氨酸、谷氨酰胺和酪氨酸残基。基于与hnRNP-U/SAF-A、hnRNP-G和其他hnRNP蛋白质（例如A1、K和L）的显著序列相似性（数据未显示），我们认为E1B-AP5是hnRNP蛋白家族的成员。
与hnRNP-U/SAF-A、hnRNP-G和Ran的序列同源性。（A） 在E1B-AP5的预测氨基酸序列中已鉴定的区域如下所示，其沿着E1B-AP5多肽的相对位置（开放框）。指出了NTP结合共识序列（NTP）、RGG盒（RGG）和富含谷氨酰胺、脯氨酸和酪氨酸区域（富含Q、P和Y）在羧基末端的位置。（B） E1B-AP5和hnRNP-U/SAF-A相关序列的直接序列比较。hnRNP-U/SAF-A序列中的破折号是E1B-AP五中相同的氨基酸，圆点表示hnRNP-U/SAF_A序列比对中的空白。（C） E1B-AP5与几种蛋白质的RGG盒结构域的比对。hnRNP-U/SAF-A、hnRNP-A1、核仁蛋白、纤维蛋白和EWS1的一致序列源自参考文献中列出的序列9.
E1B-AP5 mRNA和蛋白表达分析。
为了确定E1B-AP5 mRNA的大小和组织分布，对多种人类组织和细胞系进行了Northern blot分析，并将E1B-AP五编码序列中的1.6-kb片段作为探针（图。A） ●●●●。在所有检测的RNA制剂中检测到约3.2和3.8 kb的两条带。用279-bp探针探测HeLa细胞总RNA德拉来自未翻译区最末端3′端的I限制性片段仅检测到3.8kb mRNA（数据未显示），表明这两个mRNA的3′未翻译区长度不同。
E1B-AP5 mRNA和蛋白表达分析。（A） Northern印迹分析。从所示人类组织和细胞系中分离出的总RNA的20μg部分通过含有甲醛的1.2%琼脂糖凝胶进行电泳，转移到硝化纤维过滤器中，并与α-32P] 来自E1B-AP5/5的dCTP标记的E1B-AP5编码序列探针。（单核细胞、单核细胞；巨噬细胞、巨噬细胞；淋巴细胞、纤维蛋白、成纤维细胞；HepG2、肝细胞；HaCAT、角质形成细胞；MelIm、黑色素瘤）。显示了18S和28S rRNA的位置。在转移到硝化纤维过滤器之前，通过用溴化乙锭染色RNA来测定RNA负载量。（B） E1B-AP5和hnRNP-U/SAF-A蛋白的免疫沉淀。通过体外翻译产生放射性标记的E1B-AP5（通道1至3）和hnRNP-U/SAF-A（通道4至6）蛋白，并用抗E1B-AP6抗血清（α-E1B-AP5；通道2和5）和匹配的免疫前血清（通道3和6）进行免疫沉淀。沉淀物通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。指定为“输入”的泳道接受相同量的体外翻译蛋白，添加到每个免疫沉淀反应混合物中。标记的位置已指示。（C） E1B-AP5蛋白表达的Western blot分析。制备总细胞提取物，并进行SDS-PAGE，转移到硝化纤维过滤器中，并用兔抗E1B-AP5抗血清进行探测。标记的位置显示在右侧。（D） 间接免疫荧光分析。用兔抗E1B-AP5抗血清（α-E1B-AP5）和荧光素结合羊抗兔抗体检测A549细胞。放大倍数，×100。
为了在体内鉴定E1B-AP5基因编码的蛋白，针对GSTE1B-AP5融合蛋白制备了多克隆兔抗E1B-AP五抗血清。为了排除抗E1B-AP5抗血清与高度相关的120-kDa hnRNP-U/SAF-A蛋白交叉反应的可能性，我们使用抗E1B-AP5抗血清对体外翻译的E1B-AP五和hnRNP-U/SAF-A-蛋白进行了免疫沉淀实验（图。B） ●●●●。只有在体外翻译的E1B-AP5蛋白才能与抗血清有效沉淀，而用放射性标记的hnRNP-U/SAF-A或匹配的免疫前血清检测不到反应性。
用不同细胞系的全细胞提取物进行免疫印迹分析表明，E1B-AP5蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以120 kDa的表观分子量迁移（图。C） 与95.8 kDa的计算分子量不同。较低的迁移率很可能是由于翻译后修饰；人类细胞中cDNA克隆表达的表位标记的E1B-AP5蛋白相对于标记蛋白也以约120kDa的速度迁移（见图。A） ●●●●。
稳定表达的fluE1B-AP5对病毒DNA合成和宿主细胞关闭的影响。（A） fluE1B-AP5在H12-AP5/7细胞中的表达。从H1299细胞（1区）和耐嘌呤霉素细胞克隆H12-AP/5（2区）、H12-AP5/7（3区）和H12-AP8/8（4区）制备全细胞提取物，进行SDS-PAGE，并用单克隆抗体（MAb）12CA5进行免疫印迹分析。所有通道中额外的快速迁移带是由于细胞蛋白与单克隆抗体12CA5的交叉反应。用12CA5和荧光素结合羊抗兔抗体间接检测H12-AP5/7细胞的免疫荧光。放大倍数，×100。（B） 病毒DNA合成分析。H12-AP5/5或H12-AP7/7细胞被感染重量300个病毒，感染力为每细胞200个PFU。在感染后的指定时间点（hr p.i.）采集细胞，并通过PCR测定病毒DNA合成。DNA产物经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色。（C） 纤维（IV）和肌动蛋白稳态水平分析。细胞被感染重量300病毒，并标有[35S] 感染后5、10、15、20、25和30小时蛋氨酸维持1小时。总计2×105通过SDS-PAGE对每个时间点的三氯乙酸可捕集物计数进行分级，并通过放射自显影术对蛋白质进行可视化。分子质量标记显示在左侧。右边列出了与细胞肌动蛋白和几种病毒多肽相对应的条带。纤维（IV）和肌动蛋白的水平按照描述进行量化，并绘制成时间函数。对相同的总细胞提取物进行Western blot分析后，定量E1B-AP5蛋白的稳态水平（数据未显示）。
通过使用E1B-AP5特异性兔抗血清进行间接免疫荧光分析以确定H1299细胞中内源性E1B-AP5蛋白的细胞内定位（图。D） ●●●●。E1B-AP5蛋白的大部分定位于细胞核，但不包括在这些细胞的核仁中。此外，胞浆中的弱染色表明E1B-AP5的一小部分可能定位在细胞质中。使用匹配的免疫前血清时未检测到特定信号（数据未显示）。
E1B-AP5在体内外与E1B-55kDa结合。
为了进一步证实E1B-AP5与E1B-55kDa的关联，进行了两个不同的蛋白结合实验。首先，裂解物由大肠杆菌利用野生型E1B-55kDa和人类野生型p53产生GST融合蛋白(33)或仅GST。在体外结合试验中测试了这些融合蛋白的捕获能力[35S] 蛋氨酸标记的E1B-AP5蛋白，通过体外翻译制备（图。A） ●●●●。在体外翻译的hnRNP-U/SAF-A和人RCC1被用作阴性对照。与免疫印迹分析的数据一致（图。C） ，在体外翻译的E1B-AP5在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以120 kDa的分子量迁移（图。A） ●●●●。体外结合研究证实，只有E1B-AP5与GSTE1B-55kDa特异结合（图。A） 而与体外翻译的人RCC1或hnRNP-U/SAF-A无明显结合（图。A） ●●●●。
E1B-AP5与E1B-55kDa的体内外关联。（A） E1B-AP5在体外与E1B-55kDa结合。体外翻译[35S] 蛋氨酸标记的RCC1（通道1）、E1B-AP5（通道2）和hnRNP-U/SAF-A（通道3）蛋白与GSTE1B-55kDa、GST-p53或GST单独孵育，与洗涤珠结合的蛋白通过SDS-PAGE分离并通过放射自显影术显示。分子质量标记在左边以千道尔顿表示。（B） E1B-55kDa在体内与E1B-AP5结合。通过磷酸钙共沉淀法，将生长在直径90mm培养皿上的次级分流293细胞转染到表达表位标记的E1B-AP5的质粒pSVfluE1B-AP5。转染后36小时，制备全细胞提取物。如图所示，将ATP或GTP添加至最终浓度100μM，并用单克隆抗体（MAb）12CA5对提取物进行免疫沉淀，然后进行免疫印迹。用抗55-kDa大鼠单克隆抗体9C10检测E1B-55kDa。通道5和通道6被指定为“输入”，接受添加到每个免疫沉淀反应混合物中的总细胞提取物量的1/20。
在第二次蛋白质相互作用分析中，我们使用免疫沉淀-免疫球试验联合检测了E1B-55kDa/E1B-AP5在体内的相互作用（图。B） ●●●●。表达高水平E1B-55kDa蛋白的人293细胞被表达表位标记的E1B-AP5的质粒pSVfluE1B-AP5.转染。制备全细胞提取物并用单克隆抗体12CA5进行免疫沉淀(49). 预测的E1B-AP5氨基酸序列中存在保守的三磷酸核苷（NTP）结合基序，这促使我们评估ATP或GTP是否影响E1B-AP5~E1B-55kDa的结合。然后用抗55-kDa大鼠单克隆抗体9C10进行免疫印迹分析。E1B-55kDa蛋白与E1B-AP5共沉淀（图。B、 泳道2），而在未转染的293细胞中未检测到结合（泳道1）。添加ATP或GTP（车道3和4）对E1B-55kDa结合没有影响。总之，这些实验证明E1B-55kDa在体内外与E1B-AP5特异性结合。
E1B-AP5的RNA结合特性。
与RNA-结合蛋白hnRNP-U/SAF-A和hnRNP-G惊人的序列相似性，以及预测的E1B-AP5氨基酸序列中存在几个高度保守的RGG-盒，促使我们研究E1B-AP五蛋白的核酸结合特性。为了测试RNA和ssDNA结合，通过体外翻译产生的放射性标记E1B-AP5蛋白与核糖核苷酸均聚物和ssDNA-琼脂糖珠在0.25到1 M NaCl的盐浓度范围内反应（图。A） ●●●●。E1B-AP5蛋白与poly（G）的抗盐性最高，与poly。还检测到与ssDNA的结合（图。B） ●●●●。这些结果与hnRNP-U/SAF-A蛋白的核酸结合特性相同，该蛋白通过RGG盒结构域优先与poly（G）结合(37).
E1B-AP5与核糖核苷酸均聚物和ssDNA结合。（A） E1B-AP5与核糖核苷酸均聚物结合的定量。如文中所述，在指定的NaCl浓度下，输入E1B-AP5与RNA结合的百分比被测定。给出了三个独立实验的平均值。（B） E1B-AP5与ssDNA结合的定量。测定了输入E1B-AP5在指定NaCl浓度下与ssDNA结合的百分比。给出了三个独立实验的平均值。
在Ad感染的细胞中与E1B-AP5相互作用所需的E1B-55kDa中的结构域。
先前的工作已经证明E1B-55kDa多肽包含两个部分重叠的区域，它们介导与p53和E4orf6的相互作用(36,62)（图。A） ●●●●。为了确定E1B-55kDa蛋白中与E1B-AP5相互作用所需的结构域，我们使用了一系列病毒（图。A） 编码55-kDa蛋白的基因发生不同突变(62,72,76). 制备Ad感染的MCF-7细胞的提取物，并通过免疫印迹分析这两种蛋白的表达水平（图。B） ●●●●。不同突变病毒E1B-AP5和E1B-55kDa的稳态水平不同。感染突变株A262、R309和H326的细胞在感染40小时后，E1B-55kDa蛋白含量非常低，甚至无法检测到。然后对相同的提取物进行免疫沉淀和免疫印迹（图。C） 每个样本的蛋白质量通过密度测定法确定为野生型病毒中蛋白质的百分比（数据未显示）。E1B-55kDa中的几个突变改变了其与E1B-AP5蛋白相互作用的能力。正如预期的那样，没有E1B-55kDa蛋白从数字图书馆338个感染提取物。aa 224和443的插入以及490和491的点突变显示与E1B-AP5的结合降低，而氨基末端区域（aa 17和143）的插入对相互作用没有显著影响。H354-和H354-中共沉淀E1B-55kDa的还原在里面3328（+）-感染细胞最可能是由于Ad蛋白表达减少（图。B、 车道10和12）。相反，在aa 180、aa 262至326、aa 380和aa 484插入强烈干扰E1B-AP5蛋白的结合。262至326个突变也会干扰p53和E4orf6的结合(36,62)以及E1B-55kDa参与报告结构转录抑制的明显独特功能(77). 这些突变可能会破坏Ad蛋白的三级结构，从而导致完全失活的无功能多肽。然而，这一结果表明，55kDa多肽的三个区域是与E1B-AP5蛋白结合所必需的，并且p53和E1B-AP5在E1B-55kDa的氨基末端区域共享至少一个结合结构域，因为180位的突变也干扰p53的结合(75).
突变型和野生型病毒感染MCF-7细胞中E1B-55kDa/E1B-AP5蛋白相互作用的分析。（A） E1B-55kDa突变位点。顶部的粗黑条代表55-kDa多肽的496个残基。数字496表示最后一个氨基酸。插入突变和点突变下午490安/491安(下午490/1）在E1B-55kDa多肽的相对位置如下所示。中的删除数字图书馆338用细条表示。p53和E4orf6相互作用域（灰框）根据它们在E1B蛋白下方55-kDa多肽上的位置显示，由Yew等人定义(75)和Rubenwolf等人(62)分别是。（B） E1B-55kDa和E1B-AP5病毒感染细胞的表达。将用于共免疫沉淀实验的含有40μg蛋白质的全细胞提取物进行PAGE，然后用抗E1B-55kDa（2A6）杂交瘤上清液和抗E1B-AP5抗血清进行蛋白质印迹。（C） E1B-55kDa的免疫共沉淀。与E1B-AP5蛋白结合的E1B-55kDa与来自相同全细胞提取物的抗E1B-AP五兔抗血清共沉淀，在SDS–10%聚丙烯酰胺凝胶上溶解，并用2A6抗55-kDa单克隆抗体进行Western免疫印迹分析。
此外，在没有E4orf6的情况下，E1B-55kDa与E1B-AP5共沉淀的量显著增加数字图书馆355个感染细胞（图。C、 车道17）。在三个单独的实验中重现了这种效果，E4orf3突变病毒没有观察到这种效果数字图书馆341.这一观察结果强烈表明，E1B-55kDa相关蛋白E4orf6可能调节生产性感染细胞中E1B-55kDa/E1B-AP5的相互作用。
E1B-AP5的稳定表达阻止了宿主细胞mRNA输出的关闭。
上述实验的结果，加上我们发现E1B-AP5与hnRNP蛋白家族成员高度相关，表明E1B-AP五可能在核mRNA代谢中发挥一定作用。在过去几年中，E1B-55kDa与E4orf6蛋白复合物调节核质mRNA转运已得到充分证实(8,29). 此外，有人提出，病毒蛋白复合物通过结合并重新定位mRNA从宿主转录和加工位点向病毒复制中心输出所需的核宿主因子，同时抑制细胞并激活病毒mRNA转运(52,54). 因此，如果E1B-AP5是受E1B-55kDa调节的这些宿主因子之一，并且如果病毒mRNA的促进输出是由于对E1B-AP五功能的竞争，则该蛋白的过度表达应至少部分干扰Ad诱导的细胞mRNA细胞质积累阻滞。
为了验证这一预测，我们构建了一个表达表位标记的E1B-AP5蛋白的细胞系。通过共转染将质粒pSVfluE1B-AP5和pBabe-puro同时导入H1299细胞。分离出耐药克隆，并通过Western blot分析和间接免疫荧光检测外源fluE1B-AP5蛋白的表达（图。A） ●●●●。细胞克隆H12-AP5/7表达高水平的fluE1B-AP5蛋白，并用于进一步分析。耐药细胞克隆H12-AP5/5不表达fluE1B-AP5，用作对照细胞系。用单克隆抗体12CA5对H12-AP5/7细胞进行间接免疫荧光分析，证实fluE1B-AP5蛋白的主要核染色（图。A） 而H12-AP5/5细胞和相同抗体未获得特异性信号（数据未显示）。
为了探讨fluE1B-AP5表达对病毒生命周期的生理影响，我们首先比较了H12-AP5/5细胞和H12-AP7/7细胞中病毒DNA的复制（图。B） ●●●●。虽然两种细胞系中病毒DNA合成的速度相似，但在H12-AP5/7细胞中复制的开始延迟了几个小时。这种延迟在两个单独的实验中重现，但这种影响的重要性尚不清楚。突变病毒也有类似的作用数字图书馆355和数字图书馆338，分别不表达功能性E4orf6和E1B-55kDa蛋白(29,54). The ability of重量然后，通过分析合成的病毒纤维（IV）、细胞肌动蛋白和E1B-AP5蛋白的数量，评估300种病毒，以表达晚期病毒多肽并在没有或存在fluE1B-AP五的情况下有效地关闭宿主蛋白合成（图。C） ●●●●。纤维（IV）蛋白在感染后20至25小时在两种细胞系中积累到丰富的水平，而肌动蛋白水平从感染后20小时开始在H12-AP5/5和H12-AP7/7细胞中持续下降。然而，相比之下，E1B-AP5蛋白的稳态水平在两种细胞系中的裂解病毒感染期间保持不变（图。C） ●●●●。
接下来，我们测试了过表达的fluE1B-AP5对病毒晚期（L3-外显子和L5-fiber）和细胞β-actin和E1B-AP5mRNA细胞质积累的影响重量通过Northern blot分析（图。). 在感染后20至25小时，β-肌动蛋白和E1B-AP5 mRNA的核输出在H12-AP5/5细胞中被有效阻断，而这些mRNA在相同时间点在H12-AP5/7细胞中以接近正常的速率输出。病毒晚期L3和L5 mRNA在20小时左右出现在细胞质中，并在感染后30小时在两种细胞系中积累到较高水平（图。A） 尽管在H12-AP5/7细胞中，L3-外显子和L5-fiber mRNA在细胞质中的积累速率略高于对照细胞（图。B） ●●●●。因此，高水平的fluE1B-AP5蛋白干扰了病毒诱导的细胞质β-actin和E1B-AP5mRNA积累的阻滞，同时增强了L3和L5 mRNA向细胞质的输出。这些结果以及上述结果表明，过度表达的E1B-AP5并未抑制细胞质中β-actin mRNA的病毒依赖性翻译阻断，因为受感染的H12-AP5/7细胞中的肌动蛋白水平显著降低（图。C） ●●●●。令人惊讶的是，尽管E1B-AP5 mRNAs的核输出在H12-AP5/5细胞中被有效阻断，但在感染后期E1B-AP5protein的水平没有显著变化。该观察结果表明E1B-AP5蛋白具有相当长的半衰期，或者与p53类似，在Ad感染细胞中代谢稳定。
稳定表达的fluE1B-AP5对小鼠胞质mRNA积累的影响重量300个感染细胞。（A） 感染H12-AP5/5和H12-AP7/7细胞中β-actin、E1B-AP5、L3和L5 mRNA物种的Northern blot分析。在感染后的指定时间点制备细胞质RNA（hr p.i.）。将等量的这些RNA进行电泳，转移到硝化纤维素膜上，并与[α-32P] dCTP标记的β-actin、E1B-AP5、L3和L5 DNA探针。与病毒和细胞mRNA相对应的条带显示在左侧。（B） β-肌动蛋白、E1B-AP5、L3和L5 mRNA的水平按照描述进行量化，并绘制成时间函数。给出了三个独立实验的平均值和标准偏差。
E1B-AP5干扰Ad5-E1介导的原代大鼠细胞的转化。
E1B-55kDa通过结合并阻断p53介导的转录激活，与E1A协同转化原代细胞(75). 由于p53和E1B-AP5似乎与55-kDa多肽中的同一区域相互作用，我们测试了E1B-AP五表达对Ad5 E1A和E1B蛋白介导的大鼠原代细胞转化的影响。用表达E1A和E1B癌基因以及人野生型p53或表位标记的E1B-AP5的质粒转染原代幼鼠肾（BRK）细胞（图。). 与之前的观察一致，野生型p53抑制癌基因介导的病灶形成(16,19)p53和Ad5 E1蛋白的共表达使转化细胞的数量减少了近60%。值得注意的是，在转化混合物中加入pSVfluE1B-AP5后，致密病灶以浓度依赖的方式减少了70-80%。因此，E1B-AP5和p53一样，在组织培养中转染原代细胞时，有效干扰Ad E1A和E1B蛋白诱导肿瘤转化灶的能力。这种影响不是由于E1B-AP5表达的毒性作用，因为高水平的E1B-AP6蛋白并没有降低在嘌呤霉素选择下瞬时转染H1299细胞的电镀效率（数据未显示）。根据我们的数据，E1B-AP5可能通过与p53竞争E1B-55kDa的相互作用并从Ad蛋白中释放p53来调节E1介导的转化过程。
E1B-AP5抑制Ad5 E1A/E1B介导的病灶形成。用指定数量的质粒（每3×10微克DNA）转染原代BRK细胞6单元格）。聚焦活性以E1A加E1B活性的百分比表示。在四个独立实验中，pXC15的平均致密病灶数为128个。
讨论
在本报告中，我们描述了一种编码蛋白质E1B-AP5的cDNA的分离，该蛋白质与Ad E1B-55kDa癌蛋白发生物理相互作用。E1B-AP5与hnRNP家族的成员有关。这些丰富的前mRNA结合蛋白参与了mRNA加工的多个步骤，似乎在RNA的定位和转运中起着重要作用（参考文献综述15). E1B-AP5的预测蛋白序列与hnRNP-U/SAF-A蛋白最显著的相似性（图。)，包括一个酸性氨基末端区域，E1B-AP5中部的一个假定的鸟嘌呤核苷酸结合位点，以及靠近其羧基末端的紧密间隔的RGG重复序列。然而，E1B-AP5和hnRNP-U/SAF-A在其大多数氨基和羧基末端区域存在显著差异，这可能表明这两种蛋白质在RNA代谢中具有不同的功能。此外，E1B-AP5的一级结构与其他hnRNP（包括A1、G、K和L）的同源性更有限。E1B-AP五蛋白中的RGG盒结构域可能对其RNA-结合活性有贡献（参考文献综述9). 在hnRNP-U/SAF-A中，RGG盒结构域对RNA结合是绝对必要的(37). 其他研究表明，该基序是RNA结合蛋白Nlp3的核靶向所必需的，Nlp3是mRNA输出的重要介质酿酒酵母(39). 根据这些序列相似性，我们认为E1B-AP5是hnRNP家族的一个新成员。
鉴于E1B-55kDa在晚期病毒mRNA转运中的作用，我们发现它与可能参与RNA代谢的宿主因子相关，这很有趣。我们的结果表明，E1B-AP5提供了核质mRNA转换所需的功能，包括mRNA处理和/或mRNA转运。E1B-AP5主要定位于细胞核（图。)，它与E1B-55kDa蛋白特异性结合（图。和)以及调节E1B-AP5与E1B-55kDa结合的相同区域（图。)被发现是主机单元关闭的绝对必要条件(76). 更重要的是，高水平的E1B-AP5蛋白刺激晚期病毒转录物的输出，同时阻止宿主细胞mRNA输出的关闭（图。). 这些数据与E1B-55kDa蛋白通过结合mRNA输出所必需的核宿主因子促进病毒转录物的细胞质积累的假设相一致(52). 早期研究表明，E1B-55kDa在RNA分子剪接和聚腺苷化后发挥其后期作用(41,54). 在缺乏E1B-55kDa多肽的情况下，晚期病毒转录物不能有效地退出核基质部分，并且不能在核下游小室中积累(41). 因此，E1B-AP5可能促进成熟转录物从核基质释放或移动到核孔，这似乎是晚期病毒信使核糖核酸转运的限速步骤(41). 此外，E4orf6蛋白含有类似于Rev的核输出信号，它在细胞核和细胞质之间穿梭(12). 因此，如果E1B-AP5在病毒mRNA和E1B-55kDa/E4orf6复合物之间架起桥梁，它可以作为一个适配器，将新合成的mRNA连接到活性核质穿梭机制。
大量证据表明，细胞DNA复制、转录、RNA加工和RNA转运与核内结构有关（参考文献综述70). 有趣的是，有报道称E1B-AP5相关蛋白hnRNP-U/SAF-A可能在染色体DNA的组织中起作用，并与其他hnRNP蛋白一起参与核结构的形成和维持(17,22,61). 考虑到E1B-AP5在Ad感染过程中的类似功能，人们可能推测该蛋白是核隔室的一个组成部分，可介导mRNA转运到细胞质和/或有利于病毒DNA复制。随着病毒DNA复制的开始，转录活性病毒染色体的数量迅速增加，定植于转运门控的核微环境，并通过依赖E1B/E1B-AP5蛋白相互作用的机制促进晚期病毒mRNA的输出。这种机制将与以下观点相一致，即在感染细胞中观察到的转运选择性是由于病毒染色体在感染后期对门控细胞转录和/或转运单位的置换所致(74). 因此，正如我们观察到的那样，高水平的E1B-AP5将有效地干扰这些专业舱室的拟议竞争（图。). 此外，该假设还可以解释Ad感染后期激活细胞基因的mRNA输出与转录耦合，并依赖功能性E1B-55kDa蛋白的表达(32,74). 由于E1B-55kDa存在于几个核内定位(52,68)，我们认为55-kDa E1B蛋白通过与E1B-AP5结合而占据剩余或新建立的门控环境。显然，这种相互作用可以调节这些细胞mRNA分子的输出。
E1B-AP5包含两个与细胞蛋白相似的额外区域，可能将其功能与转录后调节、信号转导途径和细胞原癌基因联系起来。E1B-AP5的羧基末端区域与hnRNP-G具有显著的序列相似性，包含类似Src同源3（SH3）结构域潜在结合位点的聚集脯氨酸残基(10). 该结构域包含大约60个氨基酸，存在于一大类蛋白质中，包括细胞骨架元件和信号蛋白(三). 我们注意到，推测的RNA-结合蛋白G3BP与E1B-AP5类似，包含SH3配体基序PXXP(78)（E1B-AP5残基698至701和708至711）与p21的SH3结构域结合ras（拉斯维加斯）GTPase激活蛋白(53). 此外，hnRNP-K已被证明与细胞原癌基因c的SH3结构域结合-型钢混凝土和p95变风量(31,71)表明这两种蛋白可能在mRNA生物发生的调控中发挥作用。此外，E1B-AP5的中心区域与核G蛋白Ran中的鸟嘌呤核苷酸结合基序显示出实质性同源性，Ran是核进出口过程的重要调节器（参考文献综述24). 这强烈暗示E1B-AP5是一种鸟嘌呤核苷酸结合蛋白，但我们还没有数据证明这种情况。显然，这种活性可能会调节E1B-AP5的功能。如果E1B-AP5的两种活性都得到证实，E1B-AP五的功能可能与介导蛋白质-蛋白质关联和可逆GTP结合的蛋白质有关，并与Src同源性2（SH2）结构域一起调节细胞质和/或核信号以及细胞周期进展(59).
在过去的几年里，人们已经很好地确定，多功能E1B-55kDa蛋白在溶血感染细胞中提供了额外的重要功能，这些功能可能与抑制mRNA转运无关。研究表明E1B-55kDa直接抑制宿主蛋白质合成(1)并阻断E1A诱导的细胞肿瘤抑制蛋白p53与E4orf6结合的蓄积(27,56). 此外，p53/E1B-55kDa复合物与病毒复制有关(60)抑制p53介导的G1生长停滞或凋亡(57,67,75). 此外，最近研究表明，Ad蛋白通过独立于p53的机制缓解细胞周期的生长限制(23). 后一项观察强烈表明，E1B-55kDa通过与其他细胞蛋白（如p53）相互作用来调节细胞周期进程，从而减轻了病毒复制的生长限制。如果细胞周期依赖性病毒复制与E1B-AP5功能相关，则很容易推测E1B-55kDa通过与E1B-AP5结合来调节细胞周期调节，至少部分如此。事实上，这种活性也可以解释转化分析中转化细胞的减少（图。). 另一方面，因为p53和E1B-AP5在E1B-55kDa上共享至少一个结合区域（图。)，E1B-AP5也有可能通过与p53竞争与E1B-55kDa的相互作用来减少转化体的数量。
E1B-AP5功能的另一个有趣的选择是它参与细胞周期调节和mRNA处理，包括mRNA转运。基于E1B-55kDa在裂解感染和Ad诱导的转化中的多重功能，因此研究E1B-AP5是否与这两个调控过程相关将非常重要。在这种情况下，正如Bischoff等人最近提出的那样，分析E1B-AP5对E1B突变病毒在肿瘤治疗中的作用将是有趣的(6).
致谢
我们非常感谢文中提到的捐献试剂的人，感谢A.Richter提供质粒pSAF-A，感谢J.Köstler进行DNA测序。
S.G.得到了德意志大学Onkologie研究生项目的支持。T.S.实验室的工作得到了国家癌症研究所的支持（CA41086拨款）。T.S.是美国癌症学会教授，霍华德·休斯医学研究所研究员。T.D.得到了德国海德堡AIDS-Stipendien项目DKFZ Infektionsforschung的资助。
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