Deoxyribonucleoside Triphosphate Pool Imbalances In Vivo Are Associated with an Increased Retroviral Mutation Rate

John G. Julias; Vinay K. Pathak

doi:10.1128/jvi.72.10.7941-7949.1998

《维罗尔杂志》。1998年10月；72(10): 7941–7949.

数字对象标识：10.1128/jvi.72.10.7941-7949.1998年

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PMID：9733832

体内脱氧核糖核苷三磷酸池失衡与逆转录病毒突变率增加相关

约翰·G·朱利亚斯^†和维奈·K·巴萨克^*

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摘要

脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）库失衡与体外反转录反应中的错误整合和过度突变率增加有关。然而，体内dNTP池失衡对逆转录准确性的影响尚不清楚。我们试图确定体内dNTP池失衡对逆转录病毒突变率的影响，并验证我们的假设，即3′-叠氮-3′-脱氧胸腺嘧啶（AZT）通过诱导dNTP库失衡增加逆转录病毒的突变率。用胸苷、羟基脲（HU）或AZT处理D17细胞，并测量其对体内dNTP池的影响。胸苷和HU处理引起了显著的dNTP池失衡。相反，AZT处理对dNTP池的影响很小。还测定了胸腺嘧啶核苷和HU治疗引起的体内dNTP池失衡对逆转录病毒突变率的影响。基于脾坏死病毒（SNV）和小鼠白血病病毒（MLV）的逆转录病毒载体表达lacZ公司采用突变报告基因。失活突变的频率lacZ公司基因在单个复制周期中提供了逆转录病毒突变率的测量。用500μM胸腺嘧啶核苷处理D17靶细胞，SNV和MLV突变频率分别增加4.7倍和4倍。用2 mM HU处理D17靶细胞，SNV和MLV突变频率分别增加2.1倍和2.7倍。这些结果表明，dNTP池失衡与体内逆转录病毒突变率增加相关，但AZT治疗通过不涉及dNTP库改变的机制导致逆转录病毒变异率增加。

在逆转录病毒种群中发现的高水平遗传变异是通过突变、重组和选择产生的(20,33,34,41——44,46). 高水平逆转录病毒变异的临床显著后果包括出现对抗逆转录病毒药物耐药的病毒变体(7,8,17,29,30,45,52,54,57)，细胞向性改变(38)以及病毒发病机制的调节(19,22,61). 逆转录酶（RT）逆转录过程中的高错误率是逆转录病毒基因组突变的重要来源(33,34,41——44,46). RT缺乏校对活动，并且假设它们是进化选择的，与模板的亲和力较低(56). 因此，逆转录的准确性完全取决于核苷酸在并入新生DNA之前的区分。宿主细胞DNA聚合酶还通过每个细胞周期复制前病毒；然而，哺乳动物DNA聚合酶的错误率远低于逆转录病毒的错误率，并且它们对逆转录病毒种群的变异没有显著贡献(14). RNA聚合酶II转录前病毒以产生下一代的基因组RNA，并可能显著促进逆转录病毒变异。尚未测量RNA聚合酶II的错误率；然而，我们最近的研究结果表明，逆转录病毒基因组中至少有三分之一的突变发生在依赖于DNA的逆转录DNA合成阶段(27). 逆转录病毒的高重组率使这些突变迅速分类，从而进一步增加逆转录病毒群体的变异。因此，突变和重组过程在逆转录病毒群体中产生变异中起着重要作用(20,33,34,41——44,46).

许多RTs的误差率已在体内测量，误差范围为0.3×10⁻⁵至3×10⁻⁵突变/bp/复制周期(33,34,41——44,58). 以往的研究表明，用核苷类似物5-氮杂胞苷[4-氨基-1-β-核糖呋喃氧基-5-三嗪-2（1H）one]和3′-叠氮-3′-脱氧胸腺嘧啶（AZT）处理靶细胞可进一步提高逆转录病毒的突变率(25,44). 我们假设这些核苷酸类似物通过改变细胞内脱氧核苷三磷酸（dNTPs）的水平或相对浓度来增加逆转录病毒突变率(25,44). 细胞内dNTP水平和相对浓度可能会影响RT突变率和逆转录期间出现的突变谱。研究表明，dNTP池中的变化会影响体外RT错误率(1,23,48)并被认为是体外逆转录病毒G-to-a超突变的可能机制(35,37,59). 然而，dNTP池失衡对体内逆转录病毒突变率和突变谱的影响尚不清楚。

dNTP池失衡对真核生物基因组复制保真度和突变的影响已被广泛研究(28,31,36,47). 核苷酸库失衡对细胞具有诱变性，可能是通过干扰调节dNTP库的细胞路径而引起的。这些途径包括细胞核糖核苷酸还原酶，这种酶负责合成dNDP和调节dNTP池(5,31,47). 抑制与核苷酸合成有关的各种其他酶反应（例如胸苷激酶）也可能导致dNTP池失衡(31,47). 此外，dNTP池失衡也可能导致宿主细胞基因组DNA修复减少和染色体断裂频率增加(31,47).

已有大量文献证明，用胸腺嘧啶核苷或羟基脲（HU）处理哺乳动物细胞可以改变细胞内的dNTP池(10,12,47,53,62). 此外，HU治疗与其他抗病毒核苷类似物联合使用，目前正在努力控制HIV-1的复制(2,13,32). 微量到毫摩尔量的胸腺嘧啶核苷已被证明可使对2,6-二氨基嘌呤和6-硫代鸟嘌呤耐药的突变株的频率分别增加三倍和四倍(62). 突变频率的增加是由于处理细胞中的dNTP池失衡所致，这最终源于核糖核苷酸还原酶反馈调节的调节(5). HU治疗通过抑制核糖核苷酸还原酶改变dNTP池，导致所有dNTP耗竭，其中dATP池的减少最为显著。HU还可能通过诱导dNTP池的总体减少影响DNA修复，这反过来导致对紫外线照射和其他诱变剂的敏感性增加(53,62). HU诱导的dNTP池失衡已被证明抑制逆转录病毒复制(10,32). 此外，HU增强了几种双脱氧核苷类似物的抗病毒作用(12). 在其他研究中，dNTP池已被证明影响逆转录病毒复制(15,37,55). 使用胸苷和胞苷调节dNTP池可以限制或增强逆转录病毒复制(37). 然而，dNTP池失衡对体内逆转录病毒突变的影响尚未明确。

为了确定dNTP池失衡对体内逆转录病毒突变率的影响，我们检测了HU、胸苷或AZT处理D17细胞对体内dNTP库的影响。我们还检测了D17靶细胞的胸腺嘧啶和HU治疗对脾坏死病毒（SNV）和小鼠白血病病毒（MLV）突变率的影响。结果表明，胸苷和HU治疗均导致dNTP池失衡，这与逆转录病毒突变率增加有关。

材料和方法

逆转录病毒载体。

先前描述了使用标准技术构建基于SNV的逆转录病毒载体pLW-1和基于MLV的逆序病毒载体pGA-1(25,50). 在本报告中，pLW-1和pGA-1指质粒，而LW-1与GA-1指从这些质粒衍生的病毒。基于SNV的载体pLW-1表达细菌β-半乳糖苷酶基因(lacZ公司)并表达潮霉素B磷酸转移酶基因(湿度计)来自内部核糖体进入位点（IRES）(6,16,21). 基于MLV的载体pGA-1表达lacZ公司和一个新霉素磷酸转移酶基因(新)来自IRES(24).

细胞、转染和感染。

D17和C3A2细胞（从美国典型培养物保藏中心获得）保存在补充有6%小牛血清（HyClone Laboratories）、青霉素（50U/ml；Gibco）和链霉素（50μg/ml；Gibco）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；ICN）中。D17是一种可以感染SNV的狗骨肉瘤细胞系。C3A2是一种D17-衍生的网织内皮增生病病毒辅助系，可用于包装SNV(60). Hygromycin B（Calbiochem）以最终浓度120μg/ml（0.23 mM）存在于C3A2和D17细胞的培养基中。感染LW-1的C3A2衍生辅助细胞克隆在存在多克隆抗SNV抗体的情况下进行繁殖。这些抗体以前曾被用于抑制SNV再感染(25,27,42——44). PG13和PA317细胞（美国型培养物收集）是基于MLV的辅助细胞系(39,40). PG13和PA317细胞保存在补充有10%小牛血清、青霉素（50 U/ml）和链霉素（50μg/ml）的DMEM中。在PG13和PA317细胞培养基中，G418的最终浓度分别为600μg/ml（0.79 mM）和400μg/ml（0.53 mM）。

产生LW-1和GA-1病毒的辅助细胞克隆分别通过感染C3A2和PG13细胞获得，感染的多重性较低（<0.00005）。因此，获得含有一种以上前病毒的细胞克隆的概率小于0.0005。

使用前面描述的二甲基亚砜-聚醚法转染细胞(26). D17细胞以2×10的密度进行电镀⁵细胞在直径为60mm的板上。20小时后，如前所述，细胞在Polybrene（50μg/ml[最终浓度]）存在下感染1.0 ml病毒(20). 使用1 ml病毒进行LW-1或GA-1病毒感染1 h。20小时后，将转染或感染的细胞保存在含有G418或潮霉素的培养基上。

LW-1-或GA-1-感染细胞的β-半乳糖苷酶活性染色。

用5-溴-4-氯-3-吲哚-β对感染LW-1或GA-1的细胞进行染色-d日-在选择后14天，使用上述方案启动吡喃半乳糖苷（X-Gal）(三). 简单地说，选择感染LW-1或GA-1的细胞进行耐药性检测，并在室温下将其固定在1 ml 0.05%戊二醛（Sigma）磷酸盐缓冲盐水中10分钟。用4 ml等分磷酸盐缓冲盐水冲洗细胞三次：一次冲洗1 min，一次冲洗10 min，一个冲洗1 min。在去除最终冲洗液后，用1.25 ml含有20 mM K的溶液冲洗细胞_三铁（CN）₆（西格玛），20 mM K₄铁（CN）₆（西格玛），1.5 mM氯化镁₂（Fisher）和每毫升1毫克X-Gal（American Bioninorganics，Inc.）添加到平板中。然后用Parafilm密封平板，并在37°C下孵育24小时。蓝色和白色菌落的数量通过在放大倍数为×40的光学显微镜下观察细胞来确定。

从D17细胞中提取dNTP。

从密度为2×10的D17细胞中提取dNTPs池⁵每个60-mm直径的培养皿中的细胞数（约2×10⁶总计）。20小时后，用含有2 mM HU（西格玛）、500μM胸腺嘧啶核苷（西格马）或0.1μM AZT（西格曼）的培养基（含有6%小牛血清、青霉素和链霉素的DMEM）替换培养基。在孵育4、10或24小时后，按照前述方法采集、计数和提取细胞(51). 简单地说，将细胞重新悬浮在150μl 0.4 N高氯酸（Aldrich）中，在冰上培养20分钟，并在4°C下离心2分钟。上清液用1体积的0.5 N三辛胺（Sigma）在氟利昂（Aldric）中中和4分钟，并于4°C离心3分钟。将所得三相的上水相转移到另一管中，在干燥的冰乙醇浴中快速冷冻，并储存在−80°C。为了确保dNTP的有效回收，将50μl Tris-EDTA（pH 7.5）添加到剩余的两相中，将其混合，然后在4°C下再次离心3分钟。将重新提取样品的上水相转移到另一管中，并在干燥的冰乙醇浴中快速冷冻。将每个样品的两种提取物合并，并通过先前描述的酶分析测定dNTP的量(50).

结果

逆转录病毒载体和实验方案。

先前描述的体内试验用于确定HU和胸苷对逆转录病毒突变频率的影响(25). 该测定使用了基于SNV的载体（LW-1）和基于MLV的载体（GA-1）（图。（图1A），1A），两者都表达了lacZ公司来自病毒长末端重复序列（LTR）启动子的基因。这个lacZ公司基因是突变的报告者。LW-1载体表达湿度计，GA-1载体表达新(16,24).

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图1

快速体内试验，以确定HU和胸苷对逆转录病毒突变率的影响。（A）基于SNV的逆转录病毒载体LW-1和基于MLV的逆序病毒载体GA-1。LW-1包含LTR和顺式-SNV的动作元件（显示为白色方框）。LW-1转录大肠杆菌lacZ和湿度计来自LTR发起人湿度计该基因是从脑心肌炎病毒的IRES中表达的。GA-1包含LTR和顺式-MLV的动作元素（显示为黑框）。GA-1转录lacZ公司和新来自LTR发起人新由IRES表示。（B）实验方案。通过将LW-1或GA-1质粒DNA转染到辅助细胞中、收集病毒并感染新鲜辅助细胞（LW-1为C3A2，GA-1为PG13），生成产生LW-1和GA-1的辅助细胞克隆（LW-2为C3A2）。对感染LW-1或GA-1的细胞进行药物筛选后，分离并扩大单个菌落。感染的D17靶细胞用HU或胸腺嘧啶核苷处理4小时，然后感染病毒1小时。感染后，D17目标细胞在添加HU或胸苷的培养基中保存24小时。在选择潮霉素或G418感染细胞后，用X-Gal对耐药菌落进行染色，并分析β-半乳糖苷酶的表达。测定蓝色（野生型）和白色（突变型）菌落的数量，并根据白色菌落与总菌落（蓝色加白色）的比率计算正向突变频率。

首先用pLW-1转染C3A2辅助细胞，建立产生LW-1的辅助细胞克隆。从这些辅助细胞中提取病毒并用于感染新鲜C3A2辅助细胞（图。（图1B）。1B） ●●●●。尽管在C3A2细胞感染期间，重叠感染干扰将病毒滴度降低了100倍，但仍有可能获得对潮霉素耐药的细胞克隆。选择潮霉素后，分离单个耐药细胞克隆，并在抗SNV抗体的存在下进行扩增，以抑制病毒产生细胞的再感染。通过感染将LW-1载体导入辅助细胞，以避免转染过程中可能发生的任何突变。此外，辅助细胞克隆用X-Gal染色，以验证lacZ公司该基因具有功能活性（数据未显示）。

使用类似的程序建立产生GA-1的辅助细胞克隆。首先，用pGA-1转染PA317辅助细胞。从PA317辅助细胞中收获病毒，并用于感染PG13辅助细胞（图。（图1B）。1B） ●●●●。在对G418抗性进行筛选后，分离并扩增单个细胞克隆。PG13细胞用长臂猿白血病病毒包膜包裹载体RNA。由于PG13细胞来源于小鼠成纤维细胞，而小鼠细胞不表达长臂猿白血病病毒包膜的受体，因此病毒产生细胞不能自我再感染(40).

接下来，通过从产生LW-1或GA-1的辅助细胞克隆中捕获病毒并感染D17靶细胞，进行一个逆转录病毒复制周期（图。（图1B）。1B） ●●●●。HU或胸腺嘧啶核苷处理对逆转录病毒突变率的影响是通过将D17靶细胞维持在添加不同浓度HU或胸苷的培养基中来确定的。感染前和感染后分别用含药物培养基处理靶细胞4h和20h。在感染前4小时开始药物治疗，以确保在感染时，即启动逆转录时，dNTP池发生改变。我们预计大多数逆转录在感染后6小时完成；因此，在感染后将靶细胞保存在含药物的培养基中20小时，可以确保在病毒复制过程中dNTP池不平衡。

感染细胞药物选择后形成的D17细胞集落用X-Gal染色。含有表型野生型的细胞克隆lacZ公司染色为蓝色，而含有灭活的细胞克隆lacZ公司没有染色，呈现白色。染色后24小时测定蓝色和白色菌落的数量。突变频率计算为白色菌落数与菌落总数的比率。

HU处理增加SNV和MLV突变频率并降低病毒滴度。

为了确定HU对SNV突变频率的影响，从C3A2辅助细胞克隆中获取LW-1病毒，并在没有HU或存在不同浓度HU的情况下感染D17靶细胞。检测的HU浓度范围是基于先前的研究和治疗对病毒滴度影响的经验观察(53). 通过X-Gal染色对潮霉素耐药细胞集落进行突变频率测定。从三个C3A2辅助细胞克隆获得的病毒感染结果如表所示表1。1用0.5至2.0 mM HU处理D17细胞以浓度依赖性方式增加SNV突变频率，突变频率最多增加2.1倍。用不同浓度的HU处理D17细胞也能以浓度依赖的方式降低病毒滴度。在检测的最高HU浓度下，病毒滴度相对于对照病毒滴度降低到7%。这一发现表明，显著影响SNV病毒滴度的HU浓度也导致突变频率显著增加，具有统计学意义。

表1

HU后处理对细胞失活的影响lacZ公司LW-1感染细胞中的基因

HU浓度（mM）	LW-1克隆	菌落数量		相对病毒滴度^一	突变频率^b条	相对突变频率^c（c）
HU浓度（mM）	LW-1克隆	总计	突变体	相对病毒滴度^一	突变频率^b条	相对突变频率^c（c）
0	第5C1页	3,451	233		0.07
	第4c3页	612	31		0.05
	第3C2页	855	56		0.07
	总计	4,918	320	1	0.07	1
0.50	第5页第1页	1,316	138		0.10
	P4C3页	206	14		0.07
	总计	1,522	152	0.50	0.10	1^d日
0.75	第5C1页	884	100		0.11
	P4C3页	178	17		0.10
	总计	1,062	117	0.35	0.11	1.6^d日
1	第5C1页	588	84		0.14
	P4C3页	996	86		0.09
	总计	1,584	170	0.20	0.11	1.6^d日
2	第5C1页	938	144		0.15
	P4C3页	406	47		0.12
	第3C2页	444	73		0.16
	总计	1788年	264	0.07	0.15	2.1^d日

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^一通过连续稀释和感染测定每个实验组的病毒滴度。相对病毒滴度表示治疗组的病毒滴度与未治疗组病毒滴度的比率。未治疗组的病毒滴度为1.2×10⁵CFU/毫升

^b条突变菌落与总菌落的比率。

^c（c）治疗组突变频率与对照组突变频率之比。

^d日使用两个样本比较未治疗组和治疗组的突变频率t吨测试。用0.5 mM HU处理后，突变频率没有显著差异(P（P）=0.11），但在0.75 mM HU治疗后显著增加(P（P）<0.05），1.0 mM HU(P（P）<0.05）和2 mM HU(P（P）< 0.002).

HU处理对MLV突变频率的影响也在使用三个PG13辅助细胞克隆的试验中测定（表（表2）。2). 与SNV获得的结果类似，发现用不同浓度的HU处理靶细胞以浓度依赖性的方式增加了MLV突变频率，用2.0 mM HU处理后最大增加了2.7倍。与对照病毒滴度相比，用最高浓度的HU进行治疗也能将病毒滴度降低至3%。这一发现表明，显著影响MLV病毒滴度的HU浓度也增加了MLV突变频率。

表2

HU后处理对细胞失活的影响lacZ公司GA-1感染细胞中的基因

HU浓度（mM）	GA-1克隆	菌落数量		相对病毒滴度^一	突变频率^b条	相对突变频率^c（c）
HU浓度（mM）	GA-1克隆	总计	突变体	相对病毒滴度^一	突变频率^b条	相对突变频率^c（c）
0	14	1291个	82		0.06
	33	703	39		0.06
	22	560	28		0.05
	总计	2,554	149	1	0.06	1
0.50	14	1,385	176		0.13
	33	471	33		0.07
	总计	1,856	209	0.3	0.11	1^d日
0.75	14	232	32		0.14
	33	534	53		0.10
	总计	766	85	0.3	0.11	1.8^d日
1	14	1,643	299		0.18
	33	264	34		0.13
	总计	1,907	333	0.10	0.17	2.8^d日
2	14	227	46		0.20
	33	284	41		0.14
	22	322	43		0.13
	总计	833	130	0.03	0.16	2.7^d日

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^一通过连续稀释和感染测定每个实验组的病毒滴度。相对病毒滴度表示治疗组的病毒滴度与未治疗组病毒滴度的比率。未治疗组的病毒滴度为1.6×10⁴CFU/毫升

^b条突变菌落占菌落总数的比率。

^c（c）治疗组突变频率与对照组突变频率之比。

^d日使用两个样本比较未治疗组和治疗组的突变频率t吨测试。用0.50 mM HU处理后，突变频率没有显著差异(P（P）=0.07），但0.75 mM HU处理后差异显著(P（P）<0.01），1.0 mM HU(P（P）<0.007）和2.0 mM HU(P（P）< 0.005).

HU可能通过杀死靶细胞来降低病毒滴度。为了确定HU治疗对靶细胞是否有毒，2×10⁵每个治疗组将D17细胞接种在四个小碟上。24h后，用含HU的培养基替换细胞培养基；24h后取细胞，用台盼蓝排斥法测定活细胞数。结果表明，与未经处理的对照组相比，0.5、1.0和2.0 mM HU处理的活细胞分数分别减少了11、39和68%（数据未显示）。这些观察结果表明，HU治疗所观察到的适度细胞毒性作用并不能解释病毒滴度的严重降低。

胸苷增加SNV和MLV突变频率。

同样的试验用于测定胸腺嘧啶核苷对SNV突变频率的影响。检测的胸苷浓度范围基于先前的研究和治疗对病毒滴度影响的经验观察(37). 通过X-Gal染色测定潮霉素抗性菌落的突变频率。从两个C3A2辅助细胞克隆获得的结果如表所示表3。三用从P3C2克隆获得的病毒进行了两个独立的实验。胸腺嘧啶对靶细胞的治疗导致SNV突变频率的浓度依赖性增加，在500μM胸腺嘧啶治疗后最大增加4.7倍。与HU处理的结果相比，胸苷处理对病毒滴度的影响很小；测试的最高浓度胸苷使病毒滴度相对于对照病毒滴度降低到30%。这一发现表明，对病毒滴度影响不大的胸苷浓度对突变频率有实质性影响。

表3

胸腺嘧啶核苷对细胞失活率的影响lacZ公司LW-1感染细胞中的基因

Thy浓度（μM）	LW-1克隆	菌落数量		相对病毒滴度^一	突变频率^b条	相对突变频率^c（c）
Thy浓度（μM）	LW-1克隆	总计	突变体	相对病毒滴度^一	突变频率^b条	相对突变频率^c（c）
0	第3C2页	261	16		0.06
	P4C3页	656	40		0.06
	第3C2-2页	489	29		0.06
	总计	1,406	85	1	0.06	1
10	第3C2页	210	21	0.8	0.10	1.6^d日
50	第3C2页	300	31		0.10
	P4C3页	639	95		0.15
	第3C2-2页	133	14		0.11
	总计	1,072	140	0.9	0.13	2.2^d日
100	第3C2页	296	40		0.14
	P4C3页	652	119		0.18
	第3C2-2页	571	94		0.16
	总计	1,519	253	0.7	0.17	2.8^d日
500	第3C2页	146	51		0.35
	P4C3页	170	61		0.36
	第3C2-2页	429	98		0.23
	总计	745	210	0.3	0.28	4.7^d日

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^一通过连续稀释和感染测定每个实验组的病毒滴度。相对病毒滴度表示治疗组的病毒滴度与未治疗组病毒滴度的比率。未治疗组的病毒滴度为1.7×10⁵CFU/毫升

^b条突变菌落与总菌落的比例。

^c（c）治疗组突变频率与对照组突变频率之比。

^d日使用两个样本比较未治疗组和治疗组的突变频率t吨测试。用10μM胸苷处理后，突变频率有显著差异(P（P）<0.03），50μM胸腺嘧啶核苷(P（P）<0.008），100μM胸苷(P（P）<0.0005）和500μM胸腺嘧啶核苷(P（P）< 0.002).

胸苷治疗对MLV突变频率有类似的影响。三个PG13细胞克隆的结果如表所示表4。4MLV突变频率以浓度依赖的方式增加，用500μM胸腺嘧啶核苷处理后最大增加四倍。胸苷治疗对MLV滴度的影响也很小；检测到的最高浓度的胸腺嘧啶核苷只将病毒滴度降低到对照病毒滴度的34%。这一结果表明，对病毒滴度影响不大的胸苷处理对MLV突变频率有实质性影响。

表4

胸腺嘧啶核苷对细胞失活率的影响lacZ公司GA-1感染细胞中的基因

Thy浓度（μM）	GA-1克隆	菌落数量		相对病毒滴度^一	突变频率^b条	相对突变频率^c（c）
Thy浓度（μM）	GA-1克隆	总计	突变体	相对病毒滴度^一	突变频率^b条	相对突变频率^c（c）
0	33	417	25		0.06
	14	496	29		0.06
	22	629	29		0.05
	总计	1,542	83	1	0.05	1
50	33	403	29		0.07
	14	526	37		0.07
	22	443	34		0.08
	总计	1,372	100	1	0.07	1.4^d日
100	33	600	66		0.11
	14	385	46		0.12
	22	552	56		0.10
	总计	1,537	168	0.85	0.11	2.2^d日
500	33	223	40		0.18
	14	339	69		0.20
	22	210	43		0.20
	总计	772	152	0.34	0.20	4^d日

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^一通过连续稀释和感染测定每个实验组的病毒滴度。相对病毒滴度表示治疗组的病毒滴度与未治疗组病毒滴度的比率。未治疗组的病毒滴度为1.4×10⁴CFU/毫升

^b条突变菌落占菌落总数的比率。

^c（c）治疗组突变频率与对照组突变频率之比。

^d日使用两个样本比较未治疗组和治疗组的突变频率t吨测试。经50μM胸腺嘧啶核苷处理后，突变频率有显著差异(P（P）<0.02），100μM胸腺嘧啶(P（P）<0.001）和500μM胸苷(P（P）< 0.00005).

为了确定胸苷治疗是否对靶细胞有毒性，2×10⁵每个处理组将D17细胞接种在四个直径为60mm的培养皿上。24h后，用含胸腺嘧啶的培养基替换细胞培养基；24h后，收集细胞，用台盼蓝排斥法测定活细胞数。结果表明，与未经处理的对照组相比，用100μM和500μM胸腺嘧啶核苷处理的活细胞相对数量分别减少了16%和40%（数据未显示）。因此，胸腺嘧啶核苷治疗的细胞毒性作用可能导致病毒滴度适度降低三倍。

HU和胸苷处理改变D17细胞内的细胞内dNTP浓度。

我们之前观察到，用0.1μM AZT处理D17靶细胞使SNV突变率增加了7倍(25). 为了验证HU、胸腺嘧啶核苷和AZT处理通过诱导dNTP池失衡增加逆转录病毒突变率的假设，测量了用2 mM HU、500μM胸腺嘧啶核苷类或0.1μM AZT治疗的D17细胞的dNTP库。约2×10⁶D17细胞用不加药物的培养基或500μM胸腺嘧啶核苷、2 mM HU或0.1μM AZT处理。在没有或存在药物的情况下培养4、10或24小时后，通过胰酶消化法收集细胞并离心，然后按照前面所述提取其dNTP（参考文献50材料和方法）。dNTP池通过使用前面描述的酶分析进行测量(51). 选择孵化的长度来代表感染方案中的不同阶段。测量4小时时间点，以确定在感染前D17细胞暴露于药物4小时后是否诱导dNTP池失衡。该时间点用于确定病毒感染时dNTP池是否发生改变。10小时的时间点对应于感染后6小时；之所以选择这个时间点，是因为大多数逆转录预计将在此阶段完成(49,63). 选择24小时的时间点来确定更长时间的药物治疗是否会进一步影响逆转录病毒复制、逆转录病毒突变率或细胞dNTP池。

将D17细胞在补充有2 mM HU的培养基中培养4、10或24小时后，测量细胞内dNTP浓度。2 mM HU处理对D17细胞中dNTP含量的影响如图所示（图。（图2A）。2A） ●●●●。HU处理4h后，dATP浓度降至对照组的21%(P（P）< 0.02). 与对照组相比，HU治疗后dCTP和dGTP浓度没有改变(P（P）=0.5和P（P）分别为0.3）。与对照组相比，dTTP浓度适度降低至46%(P（P）< 0.02). HU处理10小时后，dATP浓度相对于对照组降低至14%(P（P）< 0.0004). dCTP、dGTP和dTTP浓度适度降低至68%(P（P）< 0.03), 61% (P（P）<0.01）和54%(P（P）<0.01）。治疗24小时后，dATP浓度相对于对照组降低至12%(P（P）< 0.03). dCTP、dGTP和dTTP浓度适度降低至63%(P（P）<0.04），44%(P（P）<0.04）和36%(P（P）<0.007）。

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图2

2 mM HU（A）、500μM胸腺嘧啶核苷（B）和0.1μM AZT（C）对D17细胞中dNTP池的影响。按照材料和方法中的描述提取dNTP池，并使用之前描述的酶分析法进行测定。每次测量时间（虚线）时，对照组的数值均归一化为100%。对4小时和24小时的测量进行了两次独立实验，对10小时的测量执行了三次独立实验。平均值的标准误差由数值框上方和下方的误差条显示。dNTP的绝对水平（皮摩尔/10⁶细胞）未经处理的对照组在4h测量时如下：dATP，19±2；dCTP，43±3.5；dGTP，15±2；dTTP为134±10。在10小时测量时，数值如下：dATP，29±2.7；dCTP，40±1；dGTP，18±2；dTTP为97±10。在24小时测量时，数值如下：dATP，26±1；dCTP，41±3；dGTP，18±2；和dTTP，103±5。

这些结果表明，HU在处理4h后影响细胞内dNTPs的细胞内浓度，表明在感染和开始逆转录时，细胞内dNT的浓度发生了改变。治疗10小时后，dNTPs的浓度进一步改变，并且这种改变在24小时治疗期间持续存在；因此，HU处理在逆转录发生的整个时间段内影响dNTPs的细胞内浓度。

D17细胞在添加500μM胸腺嘧啶核苷的培养基中培养4、10和24小时后，也测量了细胞内dNTP的浓度。500μM胸苷处理对D17细胞中dNTP浓度的影响如图所示（图。（图2B）。2B） ●●●●。胸腺嘧啶核苷治疗4h后，dGTP和dTTP浓度增加至386%(P（P）<0.02）和172%(P（P）<0.03）。胸腺嘧啶核苷治疗后的dCTP浓度适度降低至65%(P（P）< 0.03). 相对于对照组，dATP浓度没有显著影响(P（P）= 0.23). 胸腺嘧啶核苷治疗10小时后，dGTP和dTTP浓度增加至489%(P（P） < 0.00002）和283%(P（P）<0.0001）。与对照组相比，dATP池适度减少至79%(P（P）<0.05），而dCTP池降低到对照水平的33%(P（P）< 0.00004). 用500μM胸腺嘧啶核苷处理24小时后，dTTP和dGTP浓度显著增加至922%(P（P）<0.002）和751%(P（P）<0.005）。24小时后，dATP浓度增加到对照水平的185%(P（P）<0.007），而dCTP浓度降低至对照水平的56%(P（P）< 0.05). 结果表明，胸腺嘧啶核苷诱导了dNTPs水平的广泛变化，导致dGTP和dTTP浓度急剧增加，dATP浓度略有增加，dCTP浓度略有下降。用胸腺嘧啶核苷治疗4小时后，dNTP浓度也发生了变化，这表明在感染和开始逆转录时dNTP的浓度发生了变化。dNTP浓度在治疗的24小时内持续变化。这些结果表明，在逆转录发生的整个时间段内，用胸腺嘧啶核苷处理靶细胞会导致dNTP浓度的变化。

AZT治疗不会改变D17细胞内的细胞内dNTP浓度。

显示了0.1μM AZT处理对细胞内dNTP浓度的影响（图。（图2C）。2C） ●●●●。治疗4小时和10小时后，与对照组相比，未观察到dNTP浓度的变化(P（P）> 0.1). 治疗24小时后，dTTP浓度适度降低至对照水平的65%(P（P）<0.01）；然而，未观察到dNTP浓度的其他变化(P（P）> 0.5).

由于AZT并入新生DNA可能会导致链终止，可以想象，一些提取样品中存在的AZT三磷酸会影响酶法测定的细胞内dNTP浓度。由于用于测量dCTP、dGTP和dATP浓度的模板不包含胸苷的任何掺入位点，因此AZT的存在预计不会影响这些dNTP的测量浓度。为了确定AZT是否影响dTTP浓度测量，如前所述进行分析，以确定是否需要调整测量的dTTP含量(11). 首先，测量AZT处理的细胞中提取的dTTP；接下来，将已知量的dTTP添加到样品中，并再次测量dTTP浓度。由于向样品中添加dTTP导致测量的dTTP浓度增加，因此我们得出结论，样品中存在AZT三磷酸盐不会影响dTTP池的测量（数据未显示）。综上所述，结果表明，0.1μM AZT处理对D17细胞中的dNTP池没有显著影响。

HU和胸苷处理影响细胞内dNTP池的平衡。

我们假设，除了dNTP水平的改变外，特定对dNTP比率的不平衡可能会影响RT的保真度。为了验证这个假设，我们分析了所有六个可能的dNTP对的dNTPpool不平衡（图。（图3）。三). 计算单个dNTP的比率，以确定用HU、胸腺嘧啶核苷或AZT治疗10小时后引起的特定池失衡。

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图3

HU、胸苷和AZT对dNTP池失衡的影响。用2 mM HU、500μM胸腺嘧啶核苷和0.1μM AZT处理10 h后，显示了四种dNTP水平的比率。比率值显示在年轴，具体的dNTP比率显示在x个轴。

HU治疗10小时后，dATP/dGTP、dATP/dTTP和dATP/d CTP池比率出现严重失衡。未治疗对照组的dATP/dGTP池比率为1.61，而HU治疗后为0.36（对照组的22%）。同样，未治疗对照组的dATP/dTTP池比率为0.24，但HU治疗后为0.06（对照组的25%），未治疗组的dATP/dCTP池比率是0.73，而HU治疗之后为0.15（控制组的21%）。因此，由于HU治疗，这些dNTP池比率显著改变了四到五倍。相反，在dCTP/dTP、dCTP/dGTP和dCTP/dTP比率中仅观察到不到两倍的适度变化。dCTP/dTTP比值增加到对照的127%，dCTP/d GTP比值增加至对照的110%，dGTP/d TTP比值提高到对照的113%。

胸腺嘧啶核苷治疗对dNTP池失衡的影响也如图所示。图3。三胸腺嘧啶处理引起dATP/dGTP、dCTP/dTP、dATP/dTP、dCTP/dGTP和dATP/dCTP池比率的2至14倍的剧烈失衡。未治疗对照组的dATP/dGTP池比率为1.61，而胸腺嘧啶核苷治疗后为0.26（对照组的16%）。未经治疗的对照组的dCTP/dTTP池比率为0.33，但在胸腺嘧啶核苷治疗后为0.04（对照组的12%）。未治疗对照组的dATP/dTTP池比率为0.24，而胸腺嘧啶核苷治疗后为0.07（对照组的29%）。未经治疗的对照组的dCTP/dGTP池比率为2.22，而胸腺嘧啶核苷治疗后为0.15（对照组的7%）。最后，未治疗对照组的dATP/dCTP池比率为0.73，胸腺嘧啶核苷治疗后为1.77（对照组的242%）。相比之下，dGTP/dTTP比率适度（不到两倍）增加到对照组的173%。

AZT处理对dNTP池失衡的影响也如图所示。图3。三.AZT处理对所有六个dNTP池比率的影响很小。dATP/dGTP和dATP/dCTP池比率分别适度降低（不到两倍）至对照比率的89%和77%。此外，与对照组相比，dCTP/dTTP、dATP/dTTP、dCTP/d GTP和dGTP/d TTP池比率分别适度增加（不到两倍）至142、108、115和120%。

讨论

体内dNTP池失衡与逆转录病毒突变率增加有关。

这里描述的实验表明，体内dNTP池中的变化与逆转录病毒突变率的增加有关。HU和胸苷治疗导致体内dNTP库发生非常不同的改变，但这两种治疗都与逆转录病毒基因组突变率增加有关。

胸苷治疗导致D17细胞的dNTP池显著失衡，SNV和MLV突变率分别增加4.7倍和4倍。胸腺嘧啶诱导的dNTP池失衡是由于dGTP和dTTP池的扩大和dCTP池的减少所致。胸腺嘧啶核苷治疗24小时后，dATP、dGTP和dTTP池继续扩大。这些结果与高水平dTTP存在时核糖核苷酸还原酶调节的预期结果一致(61).

HU治疗导致了较小范围的池失衡，仅使SNV和MLV突变率分别增加了2.1倍和2.7倍。尽管所有dNTP的浓度都降低了，但dATP的浓度却降低到了最大程度。已知dATP与核糖核苷酸还原酶结合，并刺激NDP转化为dNDP。一种可能性是，dATP池的耗尽导致核糖核苷酸还原酶的刺激减少，进而导致其他dNTP池的减少。

值得注意的是，胸腺嘧啶和HU处理对细胞内dNTPs池有非常不同的影响。尽管这些改变在质量和数量上都不同，但两种治疗都导致逆转录病毒突变率增加。观察到的dNTP池比率变化可用于预测将增加的替代突变的性质。例如，由于胸腺嘧啶核苷治疗使C-T比率降低了八倍，预计C-T转换率将增加。对其他dNTP池失衡的类似分析表明，HU治疗将增加A-G、A-T和A-C替代率。胸腺嘧啶核苷治疗引起的dNTP池失衡预计会增加A-到-G、C-到-T、A-到T、C-至-G、C-到-A和T-到G替换的比率。也可以想象，dNTP池的整体耗尽可能导致聚合速率的降低；聚合速率降低可能会促进RT与模板的分离，导致涉及模板切换事件（缺失、插入缺失和重复）的突变增加。需要进行更多的研究来确定这两种dNTP池失衡诱导的突变的性质。

HU和胸苷治疗也导致病毒滴度降低。病毒滴度的降低不能用选择性标记基因突变和失活率的增加来解释。基于可选择标记基因的大小（～1 kb）和约2×10的突变率⁻⁵/bp／复制周期，估计大约2%的可选择标记基因将因突变而失活(27,41——43). 即使逆转录病毒突变率增加五倍，也会导致病毒滴度相对于对照病毒滴度降低至仅90%。由于我们观察到HU治疗后病毒滴度降低至7%，胸腺嘧啶核苷治疗后降至34%，因此我们得出结论，该治疗通过另一种机制抑制逆转录病毒复制。HU治疗对病毒滴度的影响可能更大，因为它导致所有dNTP池的严重消耗，而胸苷治疗只导致dCTP池的消耗。因此，我们假设HU处理后dNTP库的耗尽可能会干扰有效的逆转录，导致病毒滴度降低。胸腺嘧啶核苷治疗后病毒滴度降低至34%可能是由于治疗后观察到的对靶细胞的细胞毒性所致。

AZT治疗通过不涉及dNTP池改变的机制增加逆转录病毒突变率。

AZT处理D17细胞对dNTP池没有显著影响。AZT在某些细胞系中诱导的dNTP池失衡的浓度比这些研究中使用的浓度大得多（>100倍）(9). 然而，AZT并不影响外周血单个核细胞中的dNTP池(10)AZT也不影响许多细胞系中的dNTP池(18).

之前，我们证明用AZT处理D17靶细胞可使SNV突变频率增加10倍，MLV突变频率提高2倍。基于这些结果和以前的报告表明AZT会导致dNTP池失衡，我们先前假设AZT通过诱导dNTP库失衡增加逆转录病毒突变率(25). 这项研究的结果强烈表明，这一假设是不正确的。本文报道的结果表明，将SNV突变率提高7倍的AZT浓度对细胞内dNTP池几乎没有影响。相反，HU和胸苷处理对细胞内dNTP池的影响更大，SNV突变率的增加程度低于AZT处理。最后，HU和胸腺嘧啶核苷处理使SNV和MLV的突变率增加到相似的程度，而AZT处理则使SNV突变率增加了10倍，远大于MLV突变率（2倍）。总之，这些结果有力地表明，除了dNTP池的改变之外，还有一种机制导致AZT治疗后逆转录病毒突变率的增加。

突变特异性和逆转录病毒突变率可能因细胞类型而异。

为了确定突变特异性是否与自然dNTP池失衡相关，我们将D17细胞中的dNTP库失衡与逆转录病毒复制期间诱导的突变特异性进行了比较(25,27,42——44). 以前使用基于SNV的逆转录病毒穿梭载体BK-2在D17细胞中测定逆转录病毒突变率(25,27). 在这些实验中，G-to-A转换是主要的替代突变，占替代突变的60%（63个中的38个）(25,27). D17细胞中dNTP池的测量确定了D17细胞的自然池不对称性。dTTP池（97±10 pmol/10⁶10小时时的细胞）大于dCTP池（40±1 pmol/10⁶细胞）和dATP池（29±2.7 pmol/10⁶细胞）大于dGTP池（18±1.5 pmol/10⁶单元格）。这种自然库的不平衡可能会影响替代突变的突变特异性，导致大多数替代突变是G-to-A转换。自然池失衡作为复制保真度和特异性的决定因素的作用在使用lacZ公司α在噬菌体复制中的报告(64). 这些结果表明，细胞内dNTP浓度可能会影响逆转录病毒复制期间的特异性以及过渡突变率。

基于体外和体内数据，dNTP池的总体大小以及自然池的不平衡可能会影响突变率和光谱。因此，如果水平或自然池失衡不同，不同细胞系的突变率可能会不同。同样，细胞系的突变率可能与体内靶细胞的突变率不同，这取决于dNTP池的水平和不对称性。最后，细胞的激活状态会影响dNTP的水平(10); 因此，增殖细胞和静止细胞之间的逆转录病毒突变率可能不同。

dNTP池失衡影响病毒滴度。

这些实验描述了dNTP池失衡对一轮逆转录病毒复制中逆转录病毒滴度的影响。以前的研究表明，HU抑制培养物中HIV-1的复制(12,32); 然而，这种抑制作用是在HU治疗几天后测量的，在此期间发生了多轮逆转录病毒复制。我们的实验表明，在一个复制周期内抑制病毒滴度，这表明2 mM HU分别使MLV和SNV的病毒滴度降低了97%和93%。类似地，胸腺嘧啶治疗已被证明能抑制细胞培养中逆转录病毒的复制(62). 胸苷诱导的抑制作用的定量显示，用500μM胸苷处理细胞可将基于MLV和SNV的载体的病毒滴度降至对照的34%。

细胞内dNTP池可能影响逆转录病毒突变的频率和谱。

这些结果表明，逆转录病毒感染靶细胞中的dNTP池可能是逆转录病毒复制保真度的关键决定因素。根据先前的研究，与其他突变率相比，胸腺嘧啶治疗更有可能增加替代突变和G-to-A超突变的发生率(28,43,59). 某些核苷酸与其他核苷酸错误结合的可能性取决于错误结合的稳定性以及聚合酶延长错误结合并完成DNA合成的能力。特定错位形成的概率可能由dNTP的相对水平决定；因此，替换突变的谱和速率预计会受到细胞中dNTP池失衡的影响。涉及初级模板滑移的移码突变和涉及RT的模板切换的缺失突变可能是由于RT的进化选择低加工性所致(56). 然而，可以想象，dNTP底物水平的降低会促进RT的暂停，这将增加RT与模板的分离速度。如果是这样，那么模板分离率的增加可能导致涉及模板切换事件的突变增加（缺失、插入缺失和重复[33,34,41——44]).

抗病毒治疗的意义。

结果表明，诱导dNTP池改变会增加体内逆转录病毒突变率。这些结果也证实了先前的研究表明，减少dNTP池对病毒复制具有抑制作用(10). 这项研究的结果表明，对HU患者的治疗可能会导致HIV-1基因组突变率的增加，这反过来可能会促进耐药性的发展并逃避宿主免疫反应。然而，逆转录病毒突变率的改变是否会对HIV-1人群的变异程度产生影响仍有争议(4). 根据一个数学模型，假设病毒选择性生长优势的微小变化对种群变异的影响大于病毒突变率的巨大变化。需要进一步研究以确定逆转录病毒突变率在耐药性和发病机制发展中的作用。

致谢

感谢Jeffery Anderson、Benjamin Beasley、Que Dang、Krista Delviks、Elias Halvas、Wei-Shau Hu、Carey Hwang、Evguenia Svarovskaia、Yegor Voronin和Wen-hui Zhang对手稿的批判性阅读。我们特别感谢胡伟绍在整个项目过程中提供了宝贵的智力投入和讨论。

这项工作得到了美国国立卫生研究院公共卫生服务拨款CA58875的支持。

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文章来自病毒学杂志由以下人员提供美国微生物学会（ASM）