《维罗尔杂志》。1998年10月；72(10): 7934–7940.
在脑中广泛表达的孤儿七跨膜结构域受体作为人类免疫缺陷病毒1型和猿猴免疫缺陷病毒的共同受体
,1 ,1 ,1 ,1 ,2 ,三 ,三 ,4 ,4 ,4 ,2 ,4 ,4和1中，*
艾美·L·爱丁格
病理学和检验医学系，1内科（肺和危重病护理科），2和神经内科，三宾夕法尼亚大学，费城，宾夕法尼亚州19104，加利福尼亚州里士满，Berlex Biosciences，免疫学系，948044
特雷弗·L·霍夫曼
病理学和检验医学系，1内科（肺和危重病护理科），2和神经内科，三宾夕法尼亚大学，费城，宾夕法尼亚州19104，加利福尼亚州里士满，Berlex Biosciences，免疫学系，948044
马修·沙伦
病理学和检验医学系，1内科（肺和危重病护理科），2和神经内科，三宾夕法尼亚大学，费城，宾夕法尼亚州19104，加利福尼亚州里士满，Berlex Biosciences，免疫学系，948044
班奥·李
病理学和检验医学系，1内科（肺和危重病护理科），2和神经内科，三宾夕法尼亚大学，费城，宾夕法尼亚州19104，加利福尼亚州里士满，Berlex Biosciences，免疫学系，948044
延吉易
病理学和检验医学系，1内科（肺和危重病护理科），2和神经内科，三宾夕法尼亚大学，费城，宾夕法尼亚州19104，加利福尼亚州里士满，Berlex Biosciences，免疫学系，948044
Wonkyu Choe先生
病理学和实验医学系，1医学部（肺科和重症监护科），2和神经内科，三宾夕法尼亚大学，费城，宾夕法尼亚州19104，加利福尼亚州里士满，Berlex Biosciences，免疫学系，948044
丹尼斯·L·科尔森
病理学和检验医学系，1内科（肺和危重病护理科），2和神经内科，三宾夕法尼亚大学，费城，宾夕法尼亚州19104，加利福尼亚州里士满，Berlex Biosciences，免疫学系，948044
布兰卡·米特罗维奇
病理学和检验医学系，1内科（肺和危重病护理科），2和神经内科，三宾夕法尼亚大学，费城，宾夕法尼亚州19104，加利福尼亚州里士满，Berlex Biosciences，免疫学系，948044
周以勤
病理学和检验医学系，1内科（肺和危重病护理科），2和神经内科，三宾夕法尼亚大学，费城，宾夕法尼亚州19104，加利福尼亚州里士满，Berlex Biosciences，免疫学系，948044
Daryl Faulds公司
病理学和检验医学系，1内科（肺和危重病护理科），2和神经内科，三宾夕法尼亚大学，费城，宾夕法尼亚州19104，加利福尼亚州里士满，Berlex Biosciences，免疫学系，948044
罗纳德·G·科尔曼
病理学和检验医学系，1内科（肺和危重病护理科），2和神经内科，三宾夕法尼亚大学，费城，宾夕法尼亚州19104，加利福尼亚州里士满，Berlex Biosciences，免疫学系，948044
约瑟夫·海塞尔盖塞
病理学和检验医学系，1内科（肺和危重病护理科），2和神经内科，三宾夕法尼亚大学，费城，宾夕法尼亚州19104，以及加利福尼亚州里士满Berlex生物科学免疫学系948044
理查德·霍鲁克
病理学和检验医学系，1内科（肺和危重病护理科），2和神经内科，三宾夕法尼亚大学，费城，宾夕法尼亚州19104，加利福尼亚州里士满，Berlex Biosciences，免疫学系，948044
罗伯特·多姆斯
病理学和检验医学系，1内科（肺和危重病护理科），2和神经内科，三宾夕法尼亚大学，费城，宾夕法尼亚州19104，加利福尼亚州里士满，Berlex Biosciences，免疫学系，948044
病理学和检验医学系，1内科（肺和危重病护理科），2和神经内科，三宾夕法尼亚大学，费城，宾夕法尼亚州19104，加利福尼亚州里士满，Berlex Biosciences，免疫学系，948044
1998年2月25日收到；1998年6月22日接受。
摘要
CD4和适当的辅受体对于人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）和大多数HIV-2株感染细胞都是必要的。趋化因子受体CCR5和CXCR4是主要的HIV-1辅受体，尽管一些病毒株也可以利用CCR3等替代辅受体感染细胞。相反，大多数（如果不是全部）猴免疫缺陷病毒（SIV）株使用CCR5作为共受体，许多SIV株可以独立于CD4使用CCR5。此外，还鉴定出了几种可作为HIV-1和SIV共受体的孤儿七跨膜受体。在这里，我们报道了APJ，一种与血管紧张素受体家族同源的孤儿七跨膜结构域受体，对许多HIV-1和SIV毒株起协同受体的作用。APJ在人脑和NT2N神经元中广泛表达。逆转录-PCR也在CD4阳性T细胞系C8166中检测到APJ转录物，但在外周血白细胞、小胶质细胞、植物血凝素（PHA）或PHA/白细胞介素-2刺激的外周血单核细胞、单核细胞或单核细胞衍生的巨噬细胞中未检测到。APJ在中枢神经系统中广泛分布，再加上一些HIV-1毒株将其用作辅受体，表明它可能在神经发生中起作用。
人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）进入细胞涉及病毒包膜（Env）蛋白与CD4的结合，然后与几个共受体中的一个相互作用（参考文献综述5,8,22、和47). Env与适当的辅受体结合被认为会触发Env的构象变化，从而介导病毒膜与宿主细胞膜之间的融合。主要的HIV-1共受体是趋化因子受体CCR5和CXCR4，因为迄今为止检测的所有HIV-1毒株都使用其中一种或两种分子作为第二受体(21). CCR5支持R5（嗜巨噬细胞[M-tropic]）病毒株的感染，而CXCR4支持X4（嗜T细胞[T-tropic]]）病毒分离物的感染(1,6,11,19,27,28,34). R5X4（双向）病毒Env蛋白可与CD4结合使用CCR5或CXCR4进入细胞。HIV-1菌株对CCR5和CXCR4的不同利用，加上它们在CD4阳性细胞中的表达模式，在很大程度上解释了病毒在进入水平上的嗜性。
除CCR5和CXCR4外，许多其他趋化因子和孤儿七跨膜结构域受体已被证明在体外可作为一种或多种病毒株的辅助受体(11,20,27,32,38,41,57,60,62). 一般来说，这些替代共受体支持病毒感染的效率低于CCR5或CXCR4。然而，替代性共受体的使用可能有助于解释HIV-1在体内的向性和发病机制的某些方面。例如，神经系统疾病是HIV-1感染的一种严重且相对频繁的后果，小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）病毒感染的主要靶点(4,66,70). 小胶质细胞同时表达CCR3和CCR5，有人认为病毒株利用CCR3可能与神经营养不良有关(37)尽管并非所有能感染小胶质细胞的病毒株都能使用CCR3作为辅助受体(67). CCR3或其他替代共受体在体内的使用是否重要尚在积极研究中。
在这里，我们展示了一种孤儿七跨膜受体APJ(50)作为一些HIV-1和猴免疫缺陷病毒（SIV）毒株的共同受体。APJ是一些X4和R5X4病毒株的共受体，而两个R5分离株使用APJ的效率稍低。一些SIV株也能够使用APJ作为共受体。我们证实APJ在人脑中广泛表达(45)并发现其在NT2N神经元中表达，NT2N是人类神经元的一种广泛使用的模型。此外，我们在C8166细胞中检测到APJ转录物，但在其他T细胞系或外周血白细胞（PBL）、小胶质细胞、外周血单核细胞（PBMCs）、单核细胞或巨噬细胞中未检测到。许多病毒株对APJ的使用及其在中枢神经系统中的表达表明，利用该受体有可能影响病毒神经病变。
材料和方法
细胞-细胞报告基因融合试验。
该分析在别处有详细描述(49,59). 简言之，通过用编码T7聚合酶（vTF1.1）的重组痘苗病毒感染鹌鹑QT6细胞，然后在T7启动子的控制下转染携带感兴趣包膜基因的质粒，制备效应细胞。Env构建的SIVmac251、SIVmac239、SIVmic316、SIVmc316mut（包含与SIVmac316相关的两个氨基酸替换：321 P→S和325 M→I）、DH12、RF、BK132、ADA、JR-FL、IIIB和HIV-2/ST通过重组痘苗病毒而非转染引入效应细胞。在巨细胞病毒（CMV）启动子和荧光素酶（T7启动子控制）的控制下，通过瞬时转染编码CD4和相关共受体的质粒制备QT6靶细胞。转染后第二天将效应细胞和靶细胞混合，并通过测量混合后7至8小时细胞裂解液中的荧光素酶活性来量化细胞-细胞融合。
病毒感染。
采用两种不同的检测方法评估APJ支持病毒感染的能力。荧光素酶报告病毒通过转染293T细胞和指示的Env构建物以及NL4-3荧光素素酶病毒主干（pNL-Luc-E−R（右）−) (9,13). 由于合并效率低，我们使用89.6-VSV代替野生型89.6 Env。由John K.Rose（耶鲁大学）善意提供的89.6-VSV Env含有水疱性口炎病毒G蛋白细胞质域，取代了正常的89.6 Env细胞质域并导致更有效的假型形成。感染的靶细胞为293T、U87、鹌鹑QT6或通过磷酸钙转染引入CD4和共受体的猫CCCS细胞。感染是在含有DEAE-右旋糖酐（8μg/ml）或Polybrene（4μg/ml，用于U87细胞）的培养基中进行的。感染后3至4天，用0.5%Nonide P-40在磷酸盐缓冲盐水中再次悬浮，对细胞进行裂解，并检测荧光素酶活性。用于测量病毒感染的第二种实验方法涉及基于PCR的进入分析。在这些实验中，使用50 ng经DNA酶处理的无细胞病毒p24感染稳定表达人CD4并瞬时表达所需辅受体的QT6细胞。2天后，对细胞进行清洗和裂解，使用引物LTR-plus和LTR-minus（5′-ACAGAGCTAGTACCAGTGAGCC-3′和5′-CACACTACTTGAAGCACTCA-3′）通过PCR检测HIV-1特异性长末端重复序列（LTR）。产品通过2%琼脂糖凝胶电泳分离，转移至Hybond N+（Amersham），并使用3′-末端标记生物素试剂盒（杜邦；探针5′-ATCTACAAGGGACTTTCCCGC-3′）检测，然后暴露。
原电池。
使用Ficoll-Hypaque从正常志愿者的血液中分离出人类PBMC，通过连续贴附塑料去除单核细胞，用植物血凝素（PHA-L；5μg/ml；Sigma）刺激3天，然后用白细胞介素-2（IL-2；20 U/ml；Boehringer Mannheim Biochemicals，Indianapolis）再悬浮。在PHA刺激3天后和IL-2刺激1周后提取RNA。如前所述，通过选择性粘附明胶和塑料，从PBMC中纯化单核细胞，然后在培养基中保持，以便分化为单核细胞衍生的巨噬细胞（MDM）(12). 在纯化后立即从未分化的单核细胞中提取RNA，并在培养1周后从MDM中提取RNA。Francisco Gonzalez Scarano提供了来自新鲜人脑组织的脑源性小胶质细胞和少突胶质细胞，这些细胞是从耐药癫痫患者的颞叶切除中获得的，并按照其他地方的描述进行了制备(68). 如前所述，通过维甲酸暴露，NTera 2人类畸胎瘤细胞生长并分化为有丝分裂后神经元（NT2N）(54). 分化培养物含有>95%的有丝分裂后神经元，剩余未分化细胞≤5%。
逆转录聚合酶链反应。
分离总细胞RNA，5×106至10×106将细胞重新悬浮在1ml Trizol（GIBCO-BRL）中，并按照制造商的建议进行处理。然后，在37°C下，在5mM氯化镁存在下，每10μg RNA用1μl（10至50U）DNase（不含RNase；Boehringer Mannheim）处理总RNA 30分钟2，随后在65°C下在5 mM EDTA存在下灭活10分钟；根据260 nm处的光密度计算RNA浓度。Titan逆转录（RT）-PCR系统（Boehringer Mannheim）用于评估RNA表达模式。使用特异的上游5′-TACACAGACTGGAATATCCTCG-3′和下游5′-TGCACCTTAGTGGTGTCTCC-3′引物，扩增产物为481 bp。为了控制DNA样本与基因组DNA的污染，尽管用DNase进行了处理，但所有RNA样本也用Titan混合酶进行了扩增，其中RT而非PCR活性在95°C下处理10分钟后被破坏（发现该灭活方案消除了扩增RNA而非DNA模板的能力）。在每个RT-PCR中，将从U87-APJ稳定转染细胞中分离的RNA作为阳性RNA对照，将质粒DNA作为第二个阳性对照。参考文献中描述了β-肌动蛋白引物62.
从NT2N神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞裂解物（106细胞）。将RNA制剂悬浮在Tris-EDTA（1 M Tris-HCl[pH8.0]，1 M EDTA）中，并在室温下用无RNase DNase I处理，以在每毫升200 U RNasin（RNase抑制剂；Boehringer Mannheim）存在下去除基因组DNA（40 U/10μg RNA；Boehlinger Manrheim）30分钟。用随机六聚体引物和SuperScript II RNA酶从0.5μg总RNA合成第一链cDNA−逆转录酶（Moloney鼠白血病病毒逆转录酶修饰；SuperScript T第一链cDNA合成预扩增系统；GIBCO BRL，纽约州格兰德岛）。在20 mM Tris-HCl（pH 8.4）-50 mM KCl和5 mM MgCl中进行cDNA合成（20-μl体积）2，2.5μM随机六聚体，每个脱氧核苷三磷酸1 mM，在42°C下每μl 2.5 U逆转录酶，持续50分钟，然后进行热灭活和RNase H处理。跨越甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因内含子的引物(GAPDH公司)用于验证RNA没有DNA污染。
APJ mRNA的RNA制备和Northern blot分析。
含有聚（A）的膜+从Clontech中获得了来自人脑不同区域的RNA。使用Prime-It II随机引物标记试剂盒（加利福尼亚州拉霍亚市斯特拉赫纳）标记带有[α-32P] dATP（3000 Ci/mmol），使用Klenow酶。α-32使用快速自旋柱（Boehringer-Mannheim）纯化P标记的cDNA。然后是107α的cpm-32P标记的cDNA在含有25 mM Na的杂交缓冲液中杂交过夜2人事军官4，50 mM Tris（pH 7.4），6×SSPE（1×SSPE为0.18 M NaCl，10 mM NaH2人事军官4和1 mM EDTA（pH 7.7）、0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）、100μg/ml单链DNA和1×Denhardt溶液。将膜在42°C的1×SSPE–0.1%十二烷基硫酸钠中洗涤两次，每次10分钟，然后在42°C的条件下将其改为0.2×SSPE-0.1%十二烷基苯磺酸钠的高浓度洗涤液，每次10 min。然后将膜暴露在富士成像板上4小时。板的图像在BAS1000Mac生物成像分析仪（富士）上捕获，并用MacBAS软件进行处理。图像是在Pictography 3000（富士）数字打印机上打印的。
结果
细胞-细胞融合。
我们使用细胞-细胞融合试验来确定APJ是否可以作为HIV-1或SIV的共受体(49,59). Env蛋白通过转染或感染重组痘苗病毒在QT6细胞中表达。此外，通过感染重组痘苗病毒引入T7聚合酶。然后将这些效应细胞与之前转染有编码CD4的质粒、所需的共受体（在CMV启动子的控制下）和荧光素酶（在T7启动子的调控下）的靶鹌鹑QT6细胞混合。在这个实验中，细胞间融合导致细胞质混合和荧光素酶的产生，这很容易量化。如图所示。，CCR5或CXCR4与CD4的共表达分别导致R5或X4-Ev蛋白的有效融合。R5X4 Env蛋白，如HIV-1 89.6介导与携带CCR5或CXCR4的细胞融合。当CD4单独表达时，未观察到融合（数据未显示）。当APJ与QT6细胞中的CD4共表达时，R5X4 Env蛋白89.6和几个X4 Enf蛋白以CXCR4观察到的≥70%的水平介导细胞-细胞融合（图。). 对于一个初级X4 Env蛋白质（93ZR001.3[36])，与表达APJ的细胞融合比与CXCR4融合更有效。大多数R5 Env蛋白介导与APJ表达细胞的融合，但融合水平远低于CCR5（图。和表). HIV-2/ST Env蛋白还介导了与表达CD4和APJ的细胞的低效融合。这种低效的融合是否具有生物学意义值得怀疑。然而，ADA和主要分离物92TH022.4在APJ的介导下融合，融合水平约为CCR5作为病毒共受体时观察到的水平的一半。
HIV-1环境介导的细胞-细胞融合。在T7启动子的控制下，表达CD4、指示辅受体和荧光素酶的QT6细胞与表达T7聚合酶和指示HIV-1或HIV-2 Env蛋白的细胞混合。通过测量荧光素酶活性，在混合后8小时测定细胞-细胞融合程度。当CD4和CCR5（对于R5 Env蛋白）或CXCR4（对于X4和R5X4 Env蛋白质）共表达到100%时，通过设置融合程度将结果标准化。与主要HIV-1共受体的融合程度通常是背景水平（带载体的CD4）的40至100倍。此处和后续图中的误差条表示从多个独立实验得出的平均值的标准误差。
表1
| 病毒 | 环境 | 热带 | 融合一
|
|---|
| CCR5号机组 | CXCR4系列 | 亚太及日本地区 |
|---|
| 艾滋病病毒1型 | DH12型 | R5X4型 | +++ | +++ | + |
| 射频 | R5X4型 | +++ | +++ | − |
| YU2公司 | R5级 | +++ | − | + |
| JR-FL公司 | R5级 | +++ | − | − |
| 第162页 | R5型 | +++ | − | + |
| 91美元005.11 | R5级 | +++ | − | + |
| 93BR019.10号 | R5级 | +++ | − | + |
| 92UG031.7型 | R5级 | +++ | − | − |
| 93年2月29日 | R5级 | +++ | − | − |
| 92UG037.8型 | R5级 | +++ | − | + |
| 92厚度022.4 | R5级 | +++ | − | ++ |
| 92RW020.5号 | R5级 | +++ | − | + |
| SIV公司 | SIVmac251型 | | +++ | − | − |
| SIVmacBK28型 | | +++ | − | + |
| SIVmac239型 | T型 | +++ | − | + |
| SIVmac316型 | M（M） | +++ | − | +++ |
| SIVmac316mut公司 | T型 | +++ | − | +++ |
| SIV17E/Fr型 | M（M） | +++ | − | ++ |
| SIV17E/氯 | M（M） | +++ | − | + |
| SIVmac1A11型 | M（M） | +++ | − | + |
| SIVagmSab1.4系统 | | +++ | − | + |
| SIVsmB670克隆3 | | +++ | − | + |
| SIVsmB670克隆12 | | +++ | − | + |
| SIVsm62A型 | T型 | +++ | − | + |
| SIVsm62D型 | M（M） | +++ | − | ++ |
| SIVsm543-3型 | M（M） | +++ | − | + |
| SIVsm543-B10型 | | +++ | − | + |
| SIVsmPBj6型 | | +++ | − | + |
我们还通过一组SIV Env蛋白检测了APJ支持融合的能力。与HIV-1不同，嗜M型和嗜T型SIV株均利用CCR5作为共受体，而CXCR4要么不被SIV使用，要么很少使用(10,30,44). 此外，孤儿受体STRL33、GPR15和GPR1可被T型和M型SIV株用作共受体(20,32). 我们发现APJ支持几种嗜M和嗜T SIV Env蛋白的融合，但其水平低于CCR5；例外情况是M-tropic SIVmac316 Env及其变体（316mut），它在细胞-细胞融合分析中有效地将APJ用作共受体（表). 此外，APJ支持融合的效率通常低于孤儿受体GPR1、GPR15/BOB和STRL33/Bonzo（数据未显示）。最后，我们发现许多SIV株能够以CD4依赖、CCR5依赖的方式感染细胞(31). 因此，我们测试了HIV-1、HIV-2和SIV Env蛋白介导与单独表达APJ的QT6细胞融合的能力。我们发现APJ共受体活性严格依赖于CD4，因为仅表达APJ的细胞不支持与任何测试的Env蛋白的细胞间融合（数据未显示）。
APJ阳性细胞感染。
我们用两种不同的检测系统测试了APJ支持病毒感染的能力，以更严格地评估其作为辅助受体的能力。在一系列实验中，我们使用荧光素酶报告病毒分析，其中各种Env蛋白被假分型到一个共同的背景上。将表达Env的质粒转染人类293T细胞，该质粒在CMV或猿病毒40启动子的控制下表达Env，并转染含有前病毒基因组的质粒，该前病毒基因组中含有一个不活跃的Env基因和荧光素酶来代替Nef(9,13). 如果细胞感染这些假型病毒进展到病毒DNA整合的程度，则在感染后3天可以很容易地测量荧光素酶的产生。
表达CD4的人类U87细胞和指示的共受体感染了几种HIV-1假型（图。). 携带ADA、89.6和HxB-Env蛋白的假型介导了APJ阳性细胞的感染，但效率低于细胞-细胞融合试验中观察到的结果。我们还对携带SIV CP-MAC和17E/Fr Env蛋白的病毒假型进行了感染。由于U87细胞感染的背景水平相对较高，所以将鹌鹑QT6细胞作为靶细胞。这两种SIV-Env蛋白都介导了APJ阳性细胞的感染，尽管其水平低于CCR5表达时观察到的水平。不幸的是，由于伪型形成不良，一些Env蛋白无法进行检测，或者与HIV-1 93ZR001.3和92UG024.2 Env蛋白一样，因为在没有任何外源性辅受体的情况下，背景值非常高。在这些情况下，很可能Env蛋白能够通过使用内源性表达的辅受体介导感染。
病毒感染检测。将表达CD4的U87（针对HIV-1）或鹌鹑QT6（针对SIV）细胞和指示的共受体感染带有指示HIV-1或SIV-Env蛋白的荧光素酶病毒假型，并在感染后2至3天测定荧光素酶活性。结果是艾滋病毒三次感染和SIV重复感染的平均值。在其他独立感染实验中也获得了类似的结果。
我们还使用基于PCR的进入试验来确定APJ是否支持HIV-1 IIIB和89.6的感染。如图所示。HIV-1 IIIB和HIV-1 89.6均能进入表达CD4和APJ的QT6细胞，尽管进入效率低于主要HIV-1共受体。因此，两种独立的技术证明APJ是HIV-1 89.6和HIV-1 IIIB感染的共同受体。
病毒进入表达CD4和APJ的细胞。稳定表达CD4和瞬时表达所需共受体的QT6细胞被DNA处理的无细胞病毒感染。感染后2天，按照材料和方法中的描述，用PCR检测病毒特异性DNA；产物在2%琼脂糖凝胶上溶解，并在杂交后检测。
APJ的表达。
APJ最初是从人类基因组DNA中克隆出来的，使用基于大鼠同源物的探针对大鼠组织进行分析表明APJ在大脑中广泛表达(50). 最近，APJ在人脑的某些区域表达(45). 由于APJ被一些病毒株用作辅助受体，我们通过Northern印迹分析重新检查了它在人脑中的分布。与Matsumoto等人的结果一致(45)，我们发现胼胝体、脊髓和髓质中存在高水平的APJ转录物（图。A） ●●●●。我们发现人类大脑其他区域的APJ转录物水平也较低。在外周组织中，APJ转录物很容易在脾脏中检测到，但在PBL中没有（图。B） ●●●●。其他外周组织中检测到较低水平的转录物。为了研究APJ在常用的HIV-1传播细胞中的分布，我们对大量细胞株进行了RT-PCR分析。产生稳定表达APJ的U87细胞系并用作阳性对照。我们发现APJ在C8166细胞中表达，但在检测的其他细胞系（Jurkat、CEMss、SupT1、Hut78、CEMx174、Molt4Cl8、PM1、U937和THP-1）中无法检测到APJ特异性反应产物[图。和数据未显示]）。此外，我们未能获得证据证明APJ在PHA、PHA和IL-2或抗CD3和IL-2刺激的PBMC、单核细胞或MDM中表达（图。). APJ特异性反应产物也未从原代人类小胶质细胞中获得。在一次实验中，少突胶质细胞APJ呈阴性，而在另外两次实验中检测到轻APJ特异性带。有趣的是，分化的NT2N神经元及其未分化的NT2细胞前体表达了容易检测到的APJ信息水平。虽然从NT2细胞获得的APJ特异性带比从NT2N神经元获得的APJ-特异性带更强烈，但从NT2神经元获得的β-actin扩增带也更强，这表明该样品含有更多的RNA。NT2N神经细胞是通过维甲酸处理从NT2畸胎瘤细胞系获得的。NT2N神经元是有丝分裂后的神经元，形成完全极化的轴突和树突，并表达许多人类神经元特有的蛋白质(15,53,54). 这些发现表明，神经元和少突胶质细胞可能是Northern印迹法检测到的大脑APJ信号的来源。
APJ在人体组织中的表达。含有聚（A）的膜+来自人脑不同区域（A）和外周组织（B）的RNA（从Clontech获得）与APJ特异的标记cDNA探针孵育过夜，然后暴露在富士成像板上4小时（A）通道：1，杏仁核；尾状核；胼胝体；4、海马；5、全脑；6、黑质；丘脑底核；8、丘脑；9、小脑；大脑皮层；11、髓质；12、脊髓；13，枕叶；14，额叶；15，颞叶；16，壳核。（B） 巷：1、脾；胸腺；3、前列腺；4，睾丸；5、卵巢；6、小肠；7、结肠粘膜；8，总PBL。
APJ在原代细胞和细胞系中的表达。将来自所示细胞的RNA用于单管RT-PCR，并在2%琼脂糖凝胶上运行每种25μl反应混合物中的10μl。或者，使用上标从小胶质细胞、少突胶质细胞（OLIGO）、NT2细胞和NT2N细胞获得的DNA处理RNA生成cDNA。预测的APJ带的大小为481 bp。质粒DNA和U87-APJ RNA均为阳性对照；用水作为阴性对照的模板。单核细胞；MAC，巨噬细胞。
讨论
HIV-1 Env蛋白是病毒向性的主要决定因素，其在向性中的作用主要在辅受体的使用水平上发挥。在感染的早期阶段分离的病毒几乎总是使用CCR5作为共受体，而后来获得的分离物可能使用CXCR4以及其他共受体来代替或补充CCR5。共受体使用改变导致的病毒趋向性改变可以扩大病毒宿主范围，并与加速疾病进展有关(14,64). 考虑到HIV-1环境中发生突变的频率，与CCR5和CXCR4相关的受体可以作为至少一些病毒株的共受体并不奇怪。迄今为止，已鉴定出九种替代共受体：CCR2b、CCR3、CCR8、CX3CR1、GPR1、GPR15、STRL33、US28和ChemR23(11,20,27,32,38,41,55,57,60,62). 我们现在报告发现了另一种替代的共受体APJ，它能够作为HIV-1和SIV的共受体。
由于几个原因，识别替代共受体非常重要。首先，识别替代共受体可能有助于揭示与CD4或病毒Env蛋白相互作用的保守结构基序。CCR5的氨基末端结构域是辅受体功能的重要决定因素(2,三,25,29,51,58,61)最近确定的NYT主题尤为重要(33). APJ包含一个氨基末端NYYG序列，这可能有助于解释其作为某些病毒株的共受体的能力。第二，使用替代共受体可能有助于解释病毒发病的某些方面。例如，CCR3在胎儿人类小胶质细胞中表达，可能支持嗜神经病毒株感染这些细胞(37)虽然并非所有感染小胶质细胞的病毒都使用这种辅受体(67). 人脑中大量APJ转录物的存在及其支持体外病毒感染的能力表明，该受体有可能影响病毒神经病变或环境介导的细胞毒性。最后，CCR5是抗逆转录病毒化合物的一个有吸引力的靶点，因为缺乏CCR5的个体对病毒感染具有高度抵抗力(17,39,42,63). 此外，已经描述了CXCR4的小分子抑制剂(23,24,48,65). 因此，如果发现了抑制HIV使用CCR5或CXCR4的方法，那么替代性共受体在体内可能具有更大的重要性。
APJ在细胞-细胞融合试验中作为病毒辅受体发挥作用的效率令人印象深刻，一些病毒株使用APJ的效率几乎与主要的HIV-1辅受体CCR5和CXCR4一样（图。和表). 相比之下，大多数其他替代共受体，包括US28、CCR2b、CCR8、GPR1、CX3CR1、STRL33和GPR15，对HIV-1环境介导的细胞间融合的支持相对无效。辅受体支持细胞-细胞融合或病毒感染的效率取决于表面表达水平(40,52,60). 因此，在高表达水平下，许多病毒株可以使用CCR3作为辅助受体，而在较低水平下，相对较少的病毒株可以使用CCR3(60). 由于APJ特异性抗体和配体尚不可用，我们无法将APJ在体外系统中的表达水平与体内的表达水平进行比较。尽管如此，APJ在某些病毒株的细胞-细胞融合中的有效使用在替代共受体中并不常见。
除了细胞-细胞融合外，APJ还支持病毒感染（图。和). APJ支持病毒感染的效率通常低于细胞-细胞融合试验中观察到的效率。其原因尚不清楚，但可能是由于细胞类型或细胞和病毒颗粒表面环境密度的差异。我们发现APJ作为R5X4和X4病毒分离物的共受体比R5病毒Envs更有效。与CXCR4一样，APJ的第一和第二细胞外环是酸性的，与CCR5中的相应区域形成鲜明对比。CXCR4的第一和第二胞外环已被证明是CXCR4共受体功能的关键决定因素(7,26,43)这些结构域的酸性与某些阳离子化合物阻断CXCR4功能的能力有关(24). 此外，热带病毒分离物的V3环特征上比热带毒株的V3域更基本(18,35)因此可能会与CXCR4的酸性细胞外环相互作用，也可能与APJ相互作用。
APJ共受体活性对HIV-1和SIV株均严格依赖于CD4。虽然CD4诱导依赖的原发性HIV-1毒株尚待描述，但CD4诱导的CCR5依赖性利用是原发性SIV毒株的一个相对常见的特性，并解释了一些病毒感染原发性CD4阴性CCR5阳性细胞（如脑毛细血管内皮细胞）的能力(31). 因此，CD4阴性细胞中CCR5的表达可能与病毒发病有关。在APJ病例中，迄今为止似乎只有当CD4存在时，它才能作为共受体发挥作用。
APJ最初是通过设计用于识别加压素受体和相关分子的引物从人类基因组DNA中克隆的。大鼠同源物也被克隆，发现与人类受体具有74%的氨基酸同源性(50). 使用从多个大鼠组织中分离的RNA和基于大鼠APJ序列的探针进行Northern分析，仅在大脑中检测到APJ转录物。纹状体、海马、小脑和皮层中检测到APJ转录物，原位杂交实验与这些发现非常一致(50). 最近的一项研究发现，APJ也在人脑的多个区域表达(45). 我们证实了这一发现，并确定APJ在脾脏和其他几个外周组织中表达，尽管其表达水平低于脾脏或中枢神经系统。RT-PCR检测C8166 T细胞系和Northern blot分析脾脏中APJ转录物表明APJ可能在某些T细胞亚群中表达。当获得特异性抗血清时，用其他方法重新评估其在CD4阳性T细胞、巨噬细胞和小胶质细胞中的表达将非常重要。此外，通过RT-PCR从NT2N神经元获得的高水平APJ特异性反应产物表明，APJ可能在人类神经元中表达，这可能是其在人脑中广泛分布的原因。
至于其他替代性共受体，目前还不能完全确定APJ在体内病毒发病机制中的意义。为此，有必要确定APJ表达的特定细胞类型，并确定支持病毒感染所需的APJ表面水平。APJ天然配体的鉴定或特异性抗体的开发将使研究APJ在原代细胞中的表达并确定其是否支持病毒感染成为可能。特别有趣的是对中枢神经系统中APJ表达的更详细分析。神经系统疾病是HIV-1和SIV感染的一个常见且显著的特征，辅受体使用的变化可能有助于解释嗜神经性毒株的发展(46,56). 此外，一些Env蛋白可以通过CCR5或CXCR4诱导信号传导，可能影响病毒复制的进入后步骤，或者可能导致未感染细胞的细胞病变效应，这也可能在艾滋病痴呆症中起作用(16,69). 因此，必须评估大量嗜神经病毒株使用APJ感染细胞或通过该受体诱导信号传导的能力。特别是，应筛选主要的中枢神经系统分离物，以确定其使用这种替代共受体进行感染的能力，并确定其诱导因Env-APJ相互作用而产生信号的能力。
致谢
我们感谢Franciso Gonzalez-Scarano、Julie Strizki、Joseph Sheih和Andrew Albright提供人类小胶质细胞和少突胶质细胞，感谢Jack Rose（耶鲁大学）提供89.6-VSV Env结构。以下试剂来自美国国立卫生研究院艾滋病司艾滋病研究和参考试剂项目：rVV/ST，来自Mark J.Mulligan；和93ZR001.3、92UG024.2、US005.11、93BR019.10、92UC031.7、93BR029.2、92UK037.8、92TH022.4和92RW020.5环境价值来自世卫组织艾滋病毒分离和鉴定网络和Beatrice Hahn的克隆。
这项工作得到了美国国立卫生研究院对R.W.D.的AI-40880拨款和对R.G.C.的AI-35502拨款的支持。A.L.E.得到了MSTP计划的支持，美国国立卫生研究院的2T32 GM07170拨款支持，T.L.H.得到了富兰克林学者计划的支持，B.L.得到了Measey基金会临床医生奖学金的支持。
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