许多RNA病毒的感染性cDNA克隆和克隆的缺陷干扰RNA已被用于研究病毒RNA复制所必需的病毒RNA元件(顺式-作用复制信号）。一般来说，顺式-RNA病毒的作用复制信号包括至少一个基因组末端。一些病毒顺式-作用复制信号，如鼠冠状病毒、鼠肝炎病毒JHM株（MHV-JHM）的DI RNA，在基因组内部有一个额外的区域(10,11,16).
MHV是一种原型冠状病毒，包含一个约31 kb长的单链阳性RNA基因组(三,13,14,24). 最小的（2.2-kb）自然发生的MHV DI RNA，DIssE(18)，由亲本MHV-JHM基因组的三个非相邻区域组成(21)：最5′区域（结构域I）对应于基因组RNA最5′0.86kb；第二个0.75-kb区域（结构域II）对应于基因组5′端的3.1-3.9-kb区域；第三个区域（结构域III）对应于基因组RNA的最大3′0.6 kb（图。). 在这些地区中，顺式-作用复制信号最初被鉴定为域I最5′端约470-核苷酸（nt）长的区域，域III最3′端约460nt，域II的内部序列134nt（0.13-kb区域）(11). 对0.13-kb区域的进一步缺失分析表明，DI RNA复制区域的最小长度为58nt（58-nt区域）；我们之前将58-nt区域称为57-nt序列(11). 另一种MHV-JHM DI RNA DIssF的特性表明顺式-作用复制信号还包括58-nt区域(16).
IRWT与MHV-JHM基因组RNA和DIssE RNA的结构比较图。DIssE的三个结构域（I到III）显示在DIssE图的上方。58-nt区域代表内部顺式-动作复制信号。
查看内部顺式-我们比较了不同MHV毒株0.13-kb区域的序列(11). 总体而言，来自不同MHV菌株的0.13-kb区域的序列彼此相似。基于计算机的0.13-kb区域二级结构分析显示，大多数MHV菌株在阳性链中形成相同或类似的主干环结构，而MHV-A59形成较小的主干循环结构(11). 在MHV菌株中，负链中的RNA二级结构不太一致。大多数含有MHV-JHM衍生的5′端和3′端的DI RNA顺式-作用复制信号加上来自各种MHV株的内部0.13-kb区域在37°C下在MHV感染细胞中复制，但MRP-A59除外，它包含一个来自MHV-A59的0.13kb区域(11). 有趣的是，MRP-A59在39.5°C下复制，但在37°C下不复制(11). MRP-A59的负向RNA合成发生在37°C，而积累的负向链DI RNA的正向RNA合成在将培养温度从39.5°C改变到37°C后不会发生，这表明内部顺式-作用复制信号在正链DI RNA合成中起作用，但在负链RNA合成中不起作用(11). 我们推测，MRP-A59形成的RNA结构适合在39.5°C但不适合在37°C进行RNA复制，而含有0.13-kb区域的DI RNA来自其他MHV菌株，形成37°C的生物活性结构。由于MHV-A59衍生的0.13-kb区域中正链的二级结构不同于其他MHV，我们假设顺式-在正序列RNA中起作用的复制信号对正序列DI RNA的合成可能很重要(11).
复制克隆的自然产生的MHV-A59-衍生DI RNA，MIDI(4,17,27)和合成的DI RNA转录物B36，其主要由MHV-A59衍生序列组成(22)不需要与MHV-JHM 58-nt区域相对应的MHV-A59序列的58-nt长区域。MIDI缺失分析表明，DI RNA复制所需的最小序列为5′端466nt和3′端461nt，不包括poly（A）(17). 然而，仅由MHV-A59基因组末端的5′端466nt和3′端461nt组成的RNA转录物能否复制尚不清楚。在我们手中，由来自MHV-A59两端的0.5 kb合成的DI RNA转录物，以及由来自MHV-A59两端0.5 kb加上MHV-A590.13-kb区域的DI RNA合成的转录物未能在感染MHV-A59-的细胞中复制（未公布的数据），而另一个由MHV-A59-1衍生的RNA，将MHV-JHM 0.13-kb的内部序列插入MHV-A59衍生的末端之间，在37°C的MHV感染细胞中复制（未公布的数据）。因此，我们推测MHV-A59衍生的DI RNA的复制可能需要一个相当于MHV-JHM DI RNA 58nt区域的内部区域(11). MHV-A59 DI RNA中功能相似的RNA元件可能与MHV-JHM 58-nt区的位置完全不同。我们进一步推测，亲本MHV基因组RNA可能包含多个基因组区域，这些区域与内部具有相同的生物学功能顺式-MHV-JHM DI RNA的作用复制信号。其中一些可能是有效复制MHV基因组RNA所必需的，而MHV DI RNA只包含其中一个或两个功能区(11).
了解内部顺式-作用复制信号驱动MHV DI RNA阳性序列RNA的合成，将揭示冠状病毒阳性序列RNA合成的机制，而这种机制目前尚不明确。MHV DI RNA在DI RNA转染细胞中高效复制(20); 它们的复制可以从引入的阳性标记DI RNA转录物开始(20)以及负链转录本(8)，并且在DI RNA复制中有一种独特的对冷敏感的变体(11). MHV DI RNA的这些特性为研究冠状病毒RNA复制机制提供了一个极好的模型系统。
我们测试了我们的假设：顺式-在正序列RNA中作用复制信号对正序列DI RNA的合成很重要(11)，我们的数据确实支持这一假设。
材料和方法
病毒和细胞。
斑克隆MHV-A59被用作辅助病毒(12). 小鼠DBT细胞(6)用于制备种子病毒，小鼠L2细胞用于RNA转染实验。
质粒构建。
所有寡核苷酸的名称及其序列、唯一限制位点和结合位点如表所示对于所有涉及PCR的质粒构建，我们使用相同的PCR条件：质粒DNA和寡核苷酸引物在PCR缓冲液（0.05 M KCl，0.01 M Tris-HCl[pH 8.0]，0.0025 M MgCl2、0.01%明胶、0.17 mM[每个]脱氧核苷三磷酸和5 U塔克聚合酶[Promega]）25个周期。DIssE的一个完整cDNA DE5-w4被用作构建DI cDNA的亲本克隆(20).
表1
| 寡核苷酸 | 顺序一 | 限制站点 | 绑定位置b条 |
|---|
| 52 | 5′-AAGCTTAATAGACTCACTATAGAGTGATGCGTCCGTAC-3′ | | 1–24（23 nt T7启动子） |
| 101 | 5′-CGCTCTTAACTAGT公司TTG-3′ | Spe公司我 | 1488–1504 DIssE |
| 130 | 5′-TTCCAATTGGCAATTCAA-3′ | | IRWT的21236–1255 |
| 1942 | 5′-GTAG公司AGTACT公司在3′ | Sca公司我 | IRWT的643–678 |
| 2167 | 5′-塔塔加特CGGCCG公司AACAGATGTGT-3′ | Eag公司我 | DIssE的852–878 |
| 10052 | 5′-ATGCTGACAGGCCT公司GTAG-3′ | 斯图我 | DIssE的905–922 |
| 10078 | 5′-TCCGAATCAG公司ACTAGT公司CAACCTGCTC-3′ | Spe公司我 | INT-1的528–552 |
| 10082 | 5′-燃气涡轮发电机AGGCCT公司gtagttttg-3′ | 斯图我 | IRWT的475–494 |
| 10083 | 5′-GTTGG型AGGCCT公司GTAGTCTTTG-3′ | 斯图我 | IRWT的475–494 |
| 10084 | 5′-燃气涡轮发电机AGGCCT公司GTAGTCCTTGTCGCTGAT-3′ | 斯图我 | IRWT的475–502 |
| 10115 | 5′-燃气涡轮发电机AGGCCT公司GTAGTCCTTGTCACCG-3′ | 斯图我 | IRWT的475–500 |
| 10120 | 5′-CTTTAGACAACGCAGTT-3′ | | IRWT的643–664 |
| 10127 | 5′-CTCTTAACTAGT公司CAACCTGCTCTTGGCACGCTGTCTC-3′ | Spe公司我 | IRWT的512–551 |
| 10155 | 5′-CAGCTCG公司CCCGGG公司GTCC-3′ | Sma公司我 | 第4–21页，共pT7-4页 |
| 10167 | 5′-CTCTTAACTAGT公司CAACCTGCTTGGCACACGCTCCTC-3′ | Spe公司我 | IRWT的512–551 |
| 10245 | 5′-AACTAGT公司CAACCTGCTCTTGGCACTCGTCCTCTCTTTGGGTAGAGAGAGACAGAGAGAAG-3′ | Spe公司我 | IRWT的491-546 |
| 10246 | 5′-AACTAGT公司CAACCTGCTCTTGGCACTCGTCCTCTCTTTGGGTAGGACAAG-3′ | Spe公司我 | IRWT的491-546 |
| 10252 | 5′-A行动CAACCTGCTCTTGGCACTCGTCCTCTCTTTGGGTATCTGCGAC-3′ | Spe公司我 | IRWT的494–546 |
| 10253 | 5′-AACTAGT公司CAACCTGCTCTTGGCACTCGTCCTCTTCTGGTATCCGCGAC-3′ | Spe公司我 | IRWT的494–546 |
| 10308 | 5′-AACTAGT公司CAACCCGCTCCTTG-3′ | Spe公司我 | IRWT的525–546 |
| 10309 | 5′-AACTAGT公司CAACCTGTTCTTGGCAAC-3′ | Spe公司我 | IRWT的520–546 |
| 10310 | 5′-AACTAGT公司CAACCTGCTCTGCAACGCC-3′ | Spe公司我 | IRWT的517–546 |
| 10311 | 5′-AACTAGT公司CAACCTGCTCGGCACGCCG-3′ | Spe公司我 | IRWT的516–546 |
| 10316 | 5′-燃气涡轮发电机AGGCCT公司GTAGTCCCTGTCGC-3′ | Spe公司我 | IRWT的475–498 |
| 10317 | 5′-燃气涡轮发电机AGGCCT公司GTAGTCCTCGTCGCC-3′ | Spe公司我 | IRWT的475–499 |
| 10321 | 5′-克AGGCCT公司GTAGTCCATG-3′ | Spe公司我 | IRWT的478–494 |
| 10322 | 5′-ACTAGT公司CAACCTCTCCATG-3′ | Spe公司我 | IRWT的526–545 |
| 10323 | 5′-GAGGCCT（自动控制系统）GTAGTCCTAGTC-3′ | Spe公司我 | IRWT的478–496 |
| 10324 | 5′-ACTAGT公司CAACCTGCTCTAG-3′ | Spe公司我 | IRWT的526–545 |
| 10325 | 5′-GAGGCCT公司GTAGTCCGTG-3′ | Spe公司我 | IRWT的478–494 |
| 10326 | 5′-ACTAGT公司CAACCTGCTGGTG-3′ | Spe公司我 | IRWT的526–545 |
| 10327 | 5′-GAGGCCT（自动控制系统）GTAGTCCTGGTC-3′ | Spe公司我 | IRWT的478–496 |
| 10328 | 5′-ACTAGT公司CAACCTGCTCTGG-3′ | Spe公司我 | IRWT的526–545 |
用DE5-w4和寡核苷酸2167和101获得PCR产物。这个Eag公司我-Fsp公司然后将PCR产物的I片段插入Pst（磅/平方英尺）pT7-4的I位点产生JHM134+。通过将DE5-w4与寡核苷酸10052和寡核苷酸101孵育获得PCR产物。插入斯图我-Spe公司PCR产物的I片段进入DE5-w4大片段斯图我-Spe公司I片段产生质粒INT-1。这个斯纳商业智能-Spe公司将INT-1与寡核苷酸10078和寡核苷酸52孵育得到的PCR产物的I片段插入到大INT-1中，该片段由T7启动子序列和MHV基因组RNA序列的5′端组成斯纳商业智能-Spe公司我用碎片产生IRWT。通过将IRWT与寡核苷酸10082和寡核苷酸130孵育获得的PCR产物受到以下限制斯图我和Nru公司然后插入大型IRWT斯图我-Nru公司I片段产生IRP-1。IRP-2、IRP-3和IRN-1是通过类似的程序构建的，但分别使用寡核苷酸10083、10084和10115代替寡核苷酸10082。IRN-2是通过插入斯纳商业智能-Spe公司将IRWT与寡核苷酸10127和寡核苷酸52孵育到大IRWT中获得的PCR产物的I片段斯纳双-Spe公司我的碎片。克隆IRP-4、IRP-5、IRP-6、IRP-7、IRPN-2、IRPN-3、IRPN-4、IRPN-5和IRPN-6的构建方式与克隆IRN-2类似，但分别使用寡核苷酸10308、10309、10310、10311、10167、10245、10246、10252和10253代替寡核苷酸10127。IRPN-1的结构与IRP-3相同，只是IRN-2用作PCR模板。IRPN-7的构建方式与IRP-1类似，只是用寡核苷酸10316代替寡核苷酸10082，IRP-4用作PCR模板。IRPN-8的结构与IRPN-7的结构基本相同，只是分别使用寡核苷酸10317和IRP-5代替寡核苷酸10082和IRP-4。插入斯图我-Spe公司通过将IRWT与寡核苷酸对10321和10322、10323和10324、10325和10326以及10327和10328孵育到大IRWT中而获得的PCR产物的I片段斯图我-Spe公司I片段分别导致IRPN-9、IRPN-10、IRPN-11和IRPN-12的构建。对于每个突变体，我们对PCR获得的插入的整个区域进行测序。
RNA转录和转染。
质粒DNA线性化Xba公司如前所述，我用T7 RNA聚合酶进行消化和转录(20). 如前所述，我们使用DEAE-右旋糖酐介导的RNA转染程序(20).
溶液中RNA二级结构的表征。
溶液中的RNA二级结构分析是通过用各种RNase消化体外转录的RNA转录物，然后进行引物延伸分析来完成的。我们遵循了Jacobson等人的方法(7)Stern等人(26)经过修改。简言之，将2μg与MHV-JHM 0.13-kb区域相对应的体外RNA转录物悬浮在30μl反应缓冲液中，反应缓冲液由30 mM Tris-HCl（pH 7.4）、10 mM MgCl组成2270 mM KCl、18 mMβ-巯基乙醇和100μg tRNA/ml。将样品加热至68°C 5 min，缓慢冷却至37°C，并用RNases处理。进行了初步实验，以确定最佳酶稀释和培养温度，使RNA转录物部分消化一致。A 3-μl量的RNase A（0.25μg/ml），RNase T1（0.2 U/ml），或RNase V1（700 U/ml）在冷酶缓冲液中（80 mM HEPES[pH7.8]，20 mM MgCl2分别向RNA样品中添加300 mM KCl和6 mMβ-巯基乙醇），并分别在室温下培养17分钟、室温下培养20分钟和37°C下培养19分钟。通过添加150μl冷冻停止缓冲液（300 mM醋酸钠和10 mM EDTA），然后放置在冰上，终止反应。为了用RNase U2部分消化RNA转录物，将1μl RNase U2（200 U/ml）与2μg RNA混合在5μl RNse U2缓冲液（8 mM柠檬酸钠[pH3.5]，0.8 mM EDTA，0.5μg tRNA/ml）中，并在50°C下培养12分钟。通过添加194μl冷冻停止缓冲液终止反应。5′端32将与0.13-kb区域下游的质粒衍生序列结合的P标记寡核苷酸10155添加到RNA中，并根据Stern等人的方法进行引物延伸反应(26). 在含有7M尿素的6%聚丙烯酰胺凝胶上分析反应产物。
病毒特异性细胞内RNA的制备和Northern印迹。
如前所述，在感染后7小时（p.i.）提取病毒特异性细胞内RNA(18). 通过寡聚（dT）-纤维素柱色谱选择含有聚（A）的RNA。RNA变性并通过含有甲醛的1%琼脂糖凝胶电泳(19)并转移到尼龙过滤器上（ICN Pharmaceutical，Inc.）。Northern blot分析使用32P-标记的随机引物探针，对应于来自DE5-w4的5′端的85至474个核苷酸。
DI-特异性RT-PCR产品的直接测序分析。
通过将细胞内RNA与寡核苷酸1942孵育，合成了DI-RNA特异性cDNA，该寡核苷酸与IRWT 5′端的nt643-678区域结合；这个结合位点代表3′端之间的连接位点顺式-作用信号和含有58-nt区的插入片段。cDNA合成后，将样品加热至100°C 10分钟，灭活禽骨髓瘤病毒逆转录酶（RT）（Promega）。将cDNA与寡核苷酸1942和52孵育，获得DI-特异性RT-PCR产物，并通过琼脂糖凝胶电泳分离。如前所述进行直接PCR测序(9,28)，使用寡核苷酸10120作为引物。
结果
溶液中58-nt区域的RNA二级结构。
为了验证我们的假设，即顺式-作用复制信号对正向DI RNA合成很重要(11)，我们使用酶探针方法来确定计算机建模预测的58-nt区域的RNA二级结构(31)与溶液中的实际RNA二级结构相当。尽管58nt定义了生物功能所需的最小大小，但我们使用了包含整个0.13-kb区域的体外转录物进行分析；我们希望围绕58-nt区域的MHV衍生序列可以稳定58-nt形成的结构。
从质粒JHM134+中体外转录出与MHV-JHM RNA内部区域相对应的RNA转录物，并用各种核糖核酸酶处理。我们选择了RNase T1、与单链区域反应的RNase A和RNase U2，以及RNase V1，其与双链区域反应，因此当通过引物延伸进行分析时，将产生反映该区域对RNA酶的可及性的特异性终止。图A代表两种引物延伸分析。我们对RNase A和RNase T进行了九项独立实验1RNase U2和RNase V的处理和四个独立实验1治疗。我们发现单独实验的结果略有不同，但一些位点始终被核糖核酸酶切割。图B显示了一致的核糖核酸酶裂解位点的位置。核糖核酸酶A在21（21U）和23位残基处表现出持续的强裂解；在其他实验中，核糖核酸酶A对23U的裂解更为明显（数据未显示）。核糖核酸酶T1在重复实验中，在28G、31G和43G下有效地切割。核糖核酸酶T1在2个3′-28G残基、4个3′-31G残基和45 C残基上经常表现出弱的裂解活性1图7车道所示46 A至49 G处的解理。如图15中的车道所示，A未持续观测到。在重复实验中，RNase U2在27A和29A时裂解效率较高，而在6A时效率较低。核糖核酸酶V1在18°C和20°A下持续解理。在大多数实验中，在9°C、10°C、11°U和19°G下观察到弱解理（图。A） ●●●●。核糖核酸酶V1解理，如图所示。在其他实验中，20A下游的几个核苷酸并不明显。
酶法探测58-nt区域的阳性RNA。（A） 在体外合成包括0.13-kb区域的RNA转录物，并用无RNase（第5和13道）、RNase A（第6道）和RNase T处理1（7和15车道），RNase V1（泳道8）或RNase U2（泳道14）。使用32在0.13-kb区域下游杂交的P标记寡核苷酸。将引物延伸产物应用于6%的测序凝胶。相应序列的双脱氧序列显示在车道1至4和9至12中。标记重复实验中一致观察到的核糖核酸酶裂解位点；大符号和小符号分别代表强解理位点和弱解理位点。开放箭头，RNase A切割；实心箭头，RNase T1切割；星号，RNase U2切割；箭头，核糖核酸酶V1削减。开口圆圈表示全尺寸底漆延伸产品的位置。（B） 酶探测结果的示意图。显示了RNase裂解位点相对于计算机预测的58-nt区正链RNA二级结构的位置。末端回路的自由能为−6.6 Kcal/mol。符号与面板A的符号相同。
尽管发生了一些意外的一致性核糖核酸酶裂解，例如核糖核糖核酶V1在20 A时切断，RNase T较弱1在45℃和RNase T下切割1在几个非G位点进行裂解，我们得出结论，从引物延伸分析推断出的RNA二级结构和计算机预测的结构(11)两者相似；我们在下面的讨论中讨论了意外RNase削减的相对重要性。基于这些实验，我们确信RNA二级结构的计算机建模足够可靠，可以作为我们后续实验的基础。
58-nt区的不对称突变分析。
为了测试58-nt区的阳性标记RNA结构对生物功能是否重要，我们检测了改变每条链上58-nt区域的RNA二级结构是否会影响DI RNA的复制。为了创造这些突变体，我们使用了G-U碱基对特有的特性，选择性地破坏正链或负链中的结构。G-U对可以取代一股中的A-U对或G-C对，但在相反的股上，A-C碱基对无法形成，茎结构将被破坏。因此，通过将DI RNA中的G-C对更改为G-U对、a-U对更改为GU对、G-U对更改成G-C对或G-U对更换成a-U对并分析DI RNA复制，我们可以有选择地评估两条链中特定结构的需要。
IRWT含有MHV-JHM衍生的58-nt区域，用作野生型（wt）DI RNA。为了便于DNA构建，IRWT包含0.27-kb长的额外序列，这对于DI RNA复制来说是不必要的(10,11)在58-nt区和3′之间顺式-动作复制信号（图。). 我们构建了两系列IRWT衍生的突变体，其中一个保持了58nt区域的正链RNA二级结构，但没有保持负链RNA二级结构（图。); 这些是IRP-1、IRP-2、IRP-3、IRP-4、IRP-5、IRP-6和IRP-7。计算机模拟表明，这些突变DI RNA的负链RNA的58-nt区域具有与其他区域截然不同的RNA二级结构，并且突变DI RNA 58-nt区的负链RNA二级结构与wt 58-nt的负链RNA二级结构都不相似（数据未显示）。第二系列突变体（IRN-1和IRN-2）包含58-nt区域的wt负链RNA二级结构，并改变了正链RNA二次结构（图。). 通过计算机建模，我们检查了从G-C对到G-U对、从a-U对到G-U对、从G-U对到G C对的所有可能的单核苷酸替换，或从58-nt区正链和负链的G-U对到a-U对，发现只有这九个位点的核苷酸替换导致RNA二级结构的股特异性改变；即它们不改变一条链中的RNA二级结构，但改变了相反链中的RNA二级结构。
IRP和IRN突变体中核苷酸替换的位置。58-nt区5′端的位置和每个突变体的核苷酸替换在突变体名称下方的括号中。IRP突变体图表示58-nt区阳性标记RNA的wt二级结构。IRN突变体图表示58-nt区负链RNA的wt二级结构。根据图中所示的数据总结了每个DI RNA的复制效率。以类似于IRWT的效率复制的DI RNA用“+++”表示，以IRWT效率约5%复制的DI RNAs用“+”表示。未能复制的DI RNA用“−”表示。
在转染前1小时，将等量的体外合成的DI RNA转录物转染到感染MHV-A59辅助病毒的L2细胞和模拟感染细胞。病毒特异性细胞内RNA在7 h p.i.提取，含聚（A）RNA通过寡聚（dT）柱色谱选择并在1%琼脂糖甲醛凝胶上分离。用特异性结合DI RNA和MHV mRNA 1的探针进行的Northern印迹分析在重复实验中显示，IRWT、IRP-1、IRP-2、IRP-3、IRP-5、IRP-6和IRP-7复制，而IRP-4、IRN-1和IRN-2不复制（图。). IRP-5的复制效率显著低于IRWT或任何其他IRP突变体。来自DI RNA转染细胞的DI特异性RT-PCR产物的序列分析表明，复制DI RNA保持其输入58-nt区域的序列（数据未显示）。IRP-1、IRP-2、IRP-3、IRP-5、IRP-6和IRP-7均保持58-nt区域的正链RNA二级结构，但不复制负链RNA二次结构。这些数据不仅证明了负链RNA结构对58-nt区的生物功能并不重要，而且也表明了正链RNA二级结构在58-nt区域功能中的重要性。
IRP和IRN突变体在DI RNA转染的MHV-A59感染细胞中的复制。将等量的体外合成的DI RNA转染到1小时前感染MHV-A59辅助病毒的L2细胞单层中。于p.i第7小时采集细胞质RNA。通过寡聚（dT）柱色谱选择含有多聚（A）的RNA，并通过含有甲醛的1%琼脂糖凝胶电泳。转移到硝化纤维素膜后，将样品杂交到32P标记探针对应于MHV基因组RNA.+的nt 85至473，MHV感染；−，模拟感染和模拟转染。MHV-A59基因组RNA和DI RNA分别用开放箭头和箭头表示。
58-nt区域的序列要求。
接下来我们研究了为什么IRN-1、IRN-2和IRP-4没有复制。未能复制IRN-1和IRN-2可能是由于58-nt区域的正标记RNA二级结构被破坏或这些突变体的一级序列发生改变。为了区分这些可能性，我们构建了IRPN-1和IRPN-2，它们分别包含IRN-1和IRN-2的原始突变，IRN-1中有一个额外的39 C→39 U替换，IRN-2中又有一个附加的18 C→18 U替换（图。). 这些变化的作用是将正链和负链的整体二级结构恢复为wt的二级结构，同时保持IRN-1和IRN-2中先前引入的一级序列改变。对DI RNA转染细胞中DI RNA复制的Northern blot分析表明，IRPN-1和IRPN-2根本没有复制（图。).
IRPN突变体中核苷酸取代的位置。每个突变体的位置和核苷酸替换在计算机预测的58-nt区wt阳性序列RNA的二级结构上显示。这些突变体中改变的核苷酸碱基对从58-nt区的5′端装箱并编号。根据图中所示的数据总结了每个DI RNA的复制效率。.复制效率与IRWT相似的DI RNA用“+++”表示，复制效率约为IRWT效率5%的DI RNA则用“+”表示；那些以低于IRWT效率1%的速度复制的数据用“+/-”表示。未能复制的DI RNA用“−”表示。
在DI RNA转染的MHV-A59感染细胞中复制IRPN突变体。如图图例所示，进行RNA转染和Northern印迹分析。.+，MHV感染；−，模拟感染和模拟转染。MHV-A59基因组RNA和DI RNA分别用开放箭头和箭头表示。
IRPN-1有一个16 a-39 U碱基对，取代了正链中的wt 16 G-39 C对。这种变化可能会削弱RNA二级结构，并导致RNA二级构造发生改变，不再具有功能。或者，58-nt区域的功能可能需要16G的存在。为了检验这些可能性，我们构建了IRPN-3和IRPN-4。这两个克隆都保持了正链和负链RNA的二级结构，并有两个核苷酸替换；IRPN-3具有16U和39A，IRPN-4具有16C和39G。注意，IRPN-3在位置16和39处包含U-A碱基对。来自DI RNA转染细胞的细胞内RNA的Northern blot分析显示IRPN-3和IRPN-4都复制了（图。). DI-特异性RT-PCR产物的序列分析表明，IRPN-3和IRPN-4的复制保持了其58-nt区域的输入序列。由于IRPN-3形成了一个弱的16U-39A碱基对，因此在核苷酸16和39处存在G-C（或C-G）碱基对并不是58-nt区域生物功能的必要条件。这些数据表明，nt16可能是G、U或C，但不是A，并且仍然保持58-nt区域的功能。
IRPN-2中引入的核苷酸替换将wt G-C碱基对在位置18和37处变为弱U-a碱基对。IRPN-2复制失败的原因可能是将G-C碱基对改变为U-a碱基对，或将37A替换为37G。18C→18U的改变不太可能是IRPN-2中58-nt区生物功能丧失的原因，因为含有18U的IRP-3复制良好（图。). 为了阐明IRPN-2没有复制的原因，我们构建了IRPN-5和IRPN-6；IRPN-5有一对18A-37U碱基，IRPN-6有一对18 G-37C碱基，而每条链中都含有wt-RNA二级结构。DI RNA转染细胞中DI RNA复制的特征表明，IRPN-6（而非IRPN-5）被复制（图。). IRPN-6特异性RT-PCR产物的序列分析表明，复制IRPN-6的58-nt区域没有序列变化（数据未显示）。含有18 C-37 G（IRWT）、18 U-37 G（IR P-3）或18 G-37 C（IRPN-6）的DI RNA被复制，而含有18 A-37 U（IRPN-5）或18 U-37 A（IRPN-2）的DI RNAs没有复制，这表明为了维持58-nt区的功能，nt 18不应该是A，和/或nt 37不应该是U或A。
为了发现IRP-4没有复制的原因，我们构建了三个额外的突变DI RNA：IRPN-8、IRPN-10和IRPN-12。这些DI RNA在nt 12和46处有核苷酸替换；IRPN-8有一个12C-46G碱基对，IRPN-10有一个12-a-46U碱基对和IRPN-12有一对12G-46C碱基对（图。). 所有这些突变体在两条链中都保持了58-nt区的wt-RNA二级结构（图。). DI RNA转染细胞中DI RNA复制的特征表明，这些DI RNA复制非常差（效率低于IRWT的1%）（图。)，证明该碱基对中的任何序列替换对DI RNA复制都是致命的。这种一级序列要求可能表明，这些位置的核苷酸除了保持58-nt区域阳性标记RNA的二级结构的完整性之外，还有其他作用。
接下来我们研究了为什么IRP-5保持了58-nt区域的正标记RNA二级结构（图。)，通过表征另外三种DI RNA，IRPN-7、IRPN-9和IRPN-11，以低效率复制。这些DI RNA在两条链上都具有wt-RNA二级结构，在nt 11和47处有核苷酸替换；IRPN-7有一个11 C-47 G的碱基对，IRPN-9有一对11 U-47 A的碱基，而IRPN-11则有一对11G-47 C的碱基（图。). DI RNA转染细胞中DI RNA复制的特征表明，这三个突变体的复制效率与IRP-5相似（图。). 对来自DI RNA转染细胞的DI特异性RT-PCR产物的序列分析表明，IRPN-7、IRPN-9和IRPN-11保持了其输入58-nt区域的序列（数据未显示）。这些数据表明，11U-47A碱基对对高效DI RNA复制至关重要。由于在nt 11-47碱基对含有核苷酸替换的突变DI RNA的复制效果优于在nt 12-46碱基对含核苷酸替换的变异DI RNA，因此nt 11-47碱对DI RNA复制的序列要求不如nt 12-46碱对的严格。
这些研究表明，除了维持58nt区域正链的完整性外，该区域特定位点的特定初级序列对其生物功能也很重要。
讨论
本研究验证了一个假设，即58-nt区域所形成的RNA二级结构对阳性标记DI RNA合成很重要。我们发现，用酶法推导的溶液中58-nt区域的RNA二级结构与用计算机二级结构分析预测的相似。正链中58-nt区的RNA二级结构对生物功能很重要，而负链中则不是。58-nt区的功能允许许多序列替换，但有序列要求。DI RNA中58-nt区域的差异不太可能影响RNA的稳定性，从而决定了DI RNA的复制，因为我们在获得的2、4、，或转染到非MHV感染细胞后6小时（数据未显示）。
酶法检测RNA二级结构表明，计算机预测的RNA二级架构与溶液中的RNA二次架构非常相似；大多数核糖核酸酶裂解位点通常与计算机预测的RNA二级结构很好地吻合。然而，存在一些差异。因为RNase V1被预测为单链区的切割的20A，有可能与RNA的某些其他区域发生相互作用1经常在33 G和34 G下劈开，这两个都被预测为末端回路的一部分（图。B） 然而，这些位点的切割效率不如残基28G和31G处的位点。这些RNA酶的弱切割可能表明，一些RNA分子在溶液的末端环形成不同的RNA二级结构，例如，一些RNA转录物群体可能形成24 C-33G和25 C-33G碱基对；这些相互作用可能产生较小的端环结构。端环的大小对58-nt区域的功能可能不是很关键，因为MHV-1 0.13-kb区域具有生物功能，计算机模型预测端环结构较小(11). 核糖核酸酶T1经常在非G残基29 A、30 A、32 A、35 A和45 C处裂解。然而，在一些实验中，这种异常裂解不太明显（图。A、 比较车道7和15）。因为RNase T1在本研究中使用的酶量（0.0006 U）下，这些非G裂解可能是实验的伪影；也就是说，这些条带可能是引物延伸产物过早终止的结果。RNase T在非G残基上异常裂解的出现1在RNA二级结构的研究中，其他人也发现了(2,7).
58-nt区的阳性标记RNA二级结构在阳性标记DI RNA合成中如何发挥作用？一种可能性是58-nt区域是病毒聚合酶识别位点的一部分；MHV RNA复制机制可能识别顺式-作用复制信号和其他区域顺式-激活复制信号，从DI RNA的5′端启动正向RNA合成。这种可能性有先例；单链RNA噬菌体Qβ含有两个内部病毒聚合酶识别位点，用于负链RNA合成；每个内部识别位点与其功能起始位点从3′端分别分离约1.4和2.8kb(1,23,25). 在阳性标记DI RNA合成中，58-nt区域的阳性标记RNA二级结构的另一个可能机制是，58-nt区域可能与DI RNA的另一区域相互作用，以促进RNA二级构造的稳定，这对启动阳性标记RNA合成很重要。我们发现58-nt区生物功能的序列特异性要求：一些位点的序列改变不会影响功能，而其他位点的单核苷酸替换严重影响功能。58-nt区域内的特定位点可能与其他位点相互作用顺式-通过序列特异性接触的作用区域，以及58-nt区域内特定位点的序列替换可能会破坏这种RNA-RNA相互作用。另一种可能性是，病毒或宿主蛋白（58-nt区域的生物功能所必需）与该区域特异性结合，58-nt区的突变可能会干扰这种特异性蛋白结合。已经描述了几种与MHV RNA不同区域结合的宿主蛋白(5,29,30)并确定(15)然而，是否有任何蛋白质与58nt区域特异性相互作用尚不清楚。
