《维罗尔杂志》。1998年10月；72(10): 7916–7925.
腺相关病毒Rep78蛋白与蛋白激酶A及其同源蛋白PRKX相互作用并抑制CREB依赖性转录激活
英国曼彻斯特M20 4BX克里斯蒂医院帕特森癌症研究所分子遗传学科癌症研究活动
*通讯作者。通讯地址：英国曼彻斯特M20 4BX威尔姆斯洛路克里斯蒂医院帕特森癌症研究所分子遗传学科癌症研究运动。电话：161-446-3186。传真：161-446-3109。电子邮件：ku.ca.nam.rcip@yecatss. 收稿日期：1998年5月11日；1998年6月24日接受。
摘要
腺相关病毒（AAV）是一种人类细小病毒属依赖病毒AAV的复制主要局限于与辅助病毒同时感染的细胞。在没有辅助病毒的情况下，AAV基因组可以整合到一个特定的染色体位点，在那里它保持潜伏，直到通过用适当的辅助病毒重叠感染宿主细胞而重新激活。AAV的复制功能已映射到Rep68和Rep78基因产物。Rep蛋白具有DNA结合、内切酶和解旋酶活性，并参与AAV和异源启动子的转录调控。AAV与一系列病毒性和非病毒性肿瘤的致癌性抑制有关。在本研究中，我们试图识别和研究AAV Rep的细胞蛋白靶点，以便更好地了解Rep的各种活性。我们使用酵母双杂交系统来识别与AAV 2型Rep78相互作用的HeLa细胞蛋白。我们分离出几个强相互作用的克隆，随后被鉴定为PRKX（以前称为PKX1），一种最近描述的蛋白激酶a（PKA）催化亚单位（PKAc（c）). 通过pMal-Rep下拉试验在体外证实了这种相互作用。Rep78相互作用的区域被映射到C末端锌指状结构域；Rep68没有这个域，没有与PRKX交互。PRKX显示了对组蛋白H1和PKA寡肽靶点的自磷酸化和激酶活性。自身磷酸化被与Rep78的相互作用所抑制。在转染试验中，PRKX表达载体被证明能够激活CREB依赖的转录。该激活被Rep78抑制，但没有被Rep68抑制。因为PRKX是PKA的密切同源物c（c），我们研究了Rep78是否可以直接与PKA相互作用c（c）发现.pMal-Rep78与纯化的PKA相关c（c）并抑制其激酶活性。共转染实验表明，Rep78可以通过PKA阻断CREB的激活c（c）表达式向量。这些实验表明，AAV可能干扰感染细胞中正常的循环AMP反应途径。
腺相关病毒（AAV）是一种人类细小病毒，其复制通常需要宿主细胞与辅助病毒（通常是腺病毒或疱疹病毒）共同感染。在没有辅助病毒的情况下感染AAV可导致病毒基因组整合到19号染色体上的特定位置。然后，前病毒进入潜伏状态，直到宿主细胞与辅助病毒的重叠感染或基因毒性应激（有关综述，请参阅参考文献5). AAV在人类中似乎是非致病性的；事实上，流行病学表明，AAV血清阳性是防止宫颈癌发展的一个保护因素(14,36). 最近的数据表明，宫颈癌相关的人乳头瘤病毒可能是体内AAV的辅助病毒(53).
AAV 2型（AAV2）基因组包含约4.7 kb的单链DNA分子，可分为早期（Rep）和晚期（Cap）区域(第49页). 基因组由反向末端重复序列（ITR）限制，ITR提供病毒复制的起源。Rep区通过使用两个启动子和差异剪接编码四种相关蛋白。p5启动子驱动Rep78和Rep68的表达，由于差异剪接，它们的C端不同。内部启动子p19指导Rep52和Rep40的合成，分别对应于Rep78和Rep68的C末端区域。Rep68/78蛋白对AAV的复制至关重要，并具有ATP依赖的DNA解旋酶、位点特异性核酸内切酶和病毒起源的复制结合活性(2,23,38,58). Rep68/78蛋白也与19号染色体整合位点结合，并介导AAV整合到染色体中(27,35,57). Rep40/52蛋白不直接与DNA结合，但似乎是单链基因组积累和包被所必需的。
Rep蛋白也在调节AAV基因表达中发挥作用。除了结合病毒ITR外，p5启动子中还存在Rep68/78特异性结合位点(37). 在没有辅助性病毒感染的情况下，Rep的合成受到严格抑制；然而，在辅助物的存在下，Rep和Cap基因的表达都被诱导。这个开关似乎是通过Rep蛋白的活性整合的(32). 在没有辅助病毒的情况下，与p5启动子位点结合的Rep68/78可能通过物理阻断启动子元件来抑制转录(30). Rep还可以在不与启动子近端元件直接结合的情况下，以需要完整Rep核苷酸结合位点的方式抑制p19启动子的转录(22,29). 这表明p19启动子的Rep抑制可能是通过蛋白质相互作用介导的。在生产性感染过程中，Rep作为p19和p40启动子的强大反式激活子，而Rep68/78从p5启动子结合位点的移位可能起到解除该启动子表达的作用(30,32,45). Rep40/52蛋白可能通过与较大的Rep蛋白进入复合物来释放p5启动子，从而降低其DNA结合活性(45). Rep78、-68和-52蛋白具有下调多种异源启动子基因表达的能力，其中大多数不包含与p5和ITR-Rep结合位点的序列同源性(18,19,22,31,42,48). 似乎Rep与特定位点的DNA结合不太可能解释这种情况下的转录抑制，这再次表明Rep蛋白可以通过蛋白质相互作用介导转录沉默效应。
AAV也已被证明在体外抑制致癌转化，在许多情况下，这种特性已被定位到Rep蛋白上。共转染Rep78表达质粒抑制腺病毒E1a转化+ras（拉斯维加斯）、猴病毒40、牛乳头瘤病毒和人乳头瘤病毒(17,19,25). 当AAV DNA整合到HeLa细胞中时，导致生长减少，锚定依赖性增加，对生长因子撤除、肿瘤坏死因子α或基因毒性药物的敏感性增强(51,52). 有证据表明AAV诱导的细胞周期阻滞在两个G1和G2细胞周期的阶段(三,62). 被AAV阻断的细胞含有低磷酸化Rb，并表达高水平的p21/waf-1/cip-1蛋白，这是以p53依赖性方式诱导的。目前尚不清楚p21的上调是否是Rep蛋白的功能(16). AAV抑癌的分子机制和细胞靶点尚不清楚。
腺病毒和单纯疱疹病毒（HSV）2型的辅助病毒功能是AAV复制所必需的。腺病毒E1a、E1b、E2a、E4和VA基因足以发挥辅助病毒的功能(60). 对于1型HSV，ICP4反式激活子、DNA聚合酶、ICP8、起源结合蛋白和解旋酶-脯氨酸复合物都有牵连(40,56). 在其复制周期中，AAV可以抑制其辅助病毒的产生(4,8,9). 辅助病毒复制的潜在干扰机制尚未确定。一份报告表明，腺病毒E1b的转录后下调可能与此有关(43).
AAV Rep的各种活性可能部分通过Rep蛋白和宿主细胞蛋白之间的接触介导。之前已经证明Rep可以与自身相互作用形成高阶结构，可能是六聚体(20,49). 最近有研究表明Rep可以与转录因子Sp1结合，这可能部分解释了其调节AAV和异源启动子转录的能力(21,45). 还发现Rep与高迁移率族1蛋白相关，这种相互作用增强了Rep的DNA结合、解旋酶和核酸内切酶活性(11).
在本文中，我们描述了酵母双杂交系统用于识别与AAV2 Rep78相互作用的细胞蛋白。我们发现Rep78而非Rep68与PRKX相互作用，PRKX是最近描述的环腺苷酸依赖性蛋白激酶a催化亚单位（PKA）的同源物c（c）). 随后，我们发现Rep78也与PKA相互作用c（c）自身。与Rep78相互作用可抑制PRKX和PKA的激酶活性c（c）Rep78而非Rep68能够阻断HeLa细胞中CREB依赖性转录的诱导。这些观察结果表明，AAV可能利用Rep破坏感染细胞中的cAMP依赖性调节通路。抑制这些途径可能会影响AAV和辅助病毒复制之间的平衡。
材料和方法
质粒载体的构建。
含有AAV2 Rep68（pMALcRep68）的麦芽糖结合蛋白（MBP）融合构建物和包含AAV2全基因组的克隆（pAV2）是Ken Berns赠送的礼物。pGBT9-Rep68是通过使用生态RI和Xho公司I位点存在于两种载体中。pGBT9-Rep78是通过亚克隆Aat公司二-Xho公司包含AAV2的核苷酸（nt）1868至2233的I片段（编号与GenBank登录号下的序列相同。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“J01901”，“term_id”：“209616”，“term_text”：“J01901“}}J01901号)从pAV2进入Aat公司二-Xho公司I-消化pGBT9-Rep68。pGBT9-Rep78-Cterm是通过消除生态来自pGBT9-Rep78的RI片段（nt 321至1767）。
为了产生表达Rep78的MBP融合构建体Aat公司二-Xho公司将来自pAV2（见上文）的I片段克隆到类似消化的pMALcRep68中，得到pMALc Rep78。Rep78 C末端区域被克隆为谷胱甘肽S公司-通过PCR扩增AAV2 nt 1768至2252和亚克隆作为巴姆HI片段进入pGEX-4T-1（Pharmacia）产生pGST-Cterm。
在巨细胞病毒（CMV）启动子控制下仅表达Rep68或Rep78的载体是J.Kleinschmidt的礼物（pKex68和pKex78）(22). p78-myc/his是通过克隆Xho公司我-Hin公司dIII从pKex78插入pcDNA3.1（Invitrogen），将Myc和His肽标签添加到C末端。使用类似的协议将Rep68从pKex68亚克隆到pcDNA3.1中，产生p68-myc/his。在p78-myc/his和p68-myc/his中，Rep基因受CMV和T7启动子的控制。
pCITE-PRKX是通过克隆生态来自pGAD-PRKX（编码氨基酸29至358）的RI片段进入pCITE4b（Novagen）。这导致在T7启动子的控制下，S标签附着到该载体产生的PRKX蛋白的N末端。来自pCITE-PRKX的插入物，包括S标签，也被克隆到pCI（Promega）中以产生pCIS-PRKX并将ORF置于CMV启动子的控制下。PRKX的全长克隆（FB166，包含nt 309至1640）是G.A.Rappold赠送的礼物(26). 该质粒的插入物被克隆为Sma公司我-生态RI片段成生态RV汽车-生态RI消化pcDNA3.1（Invitrogen）以产生pcDNA-PRKX，其中ORF受CMV启动子控制，并包含内源性PRKX-AUG密码子上下文。
酵母双杂交系统控制载体pGBT-p130、pGBT-p107和pGAD-HPV16-E7是Massimo Tommasino的礼物。表达载体pFR Luc、pFA CREB和pFC PKA是商业获得的（Stratagene）。
酵母双杂交系统文库筛选。
在酿酒酵母使用Clontech Matchmaker系统。简单地说，用pGBT9-Rep78转化HF7c菌株，并用载体pGAD-GH（Clontech）中先前扩增的HeLa细胞cDNA文库重新转换得到的克隆。在含有20 mM 3-氨基三唑（3-AT）的Trp-Leu-His脱落培养基上筛选转化酵母细胞。从大约10个菌落的筛选中获得了大约400个菌落6独立克隆。所有400个菌落通过过滤试验检测β-半乳糖苷酶活性。从阳性克隆中提取质粒DNA并用于转化大肠杆菌XL-1蓝色（地层）。从pGAD-GH文库中选择克隆，并将质粒与pGBT9-Rep78或pGBT9一起重新转化为酵母菌株SFY526。使用基于定量溶液的ONPG对结果克隆进行β-半乳糖苷酶活性分析(哦-硝基苯-β-d日-吡喃半乳糖苷）含量测定。通过DNA测序进一步分析本试验阳性克隆的质粒。
pMal-Rep下拉实验。
MBP（新英格兰生物实验室）和GST（法玛西亚）融合蛋白在大肠杆菌BLR（Novagen）和蛋白质按照制造商的说明进行纯化。然而，对于GST-C末端蛋白的产生，IPTG（异丙基-β-d日-硫代吡喃半乳糖苷）诱导温度为30℃。将融合蛋白固定在直链淀粉或谷胱甘肽-脑葡萄糖微球上（视情况而定），并通过Bradford蛋白分析（Pierce）和十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶的考马斯蓝染色来估计蛋白浓度。
35在兔网织红细胞裂解物（RRL）（100μl反应混合物；TnT系统[Promega]）中通过体外转录-翻译产生下拉反应的S标记靶蛋白。将含有0.5至1.0μg每种融合蛋白的珠粒与20μl标记的靶蛋白在4°C下孵育15分钟，总体积为250μl，磷酸盐缓冲盐水（PBS）每毫升含有1 mg牛血清白蛋白和0.1%Nonidet P-40。在用PBS–牛血清白蛋白–Nonide P-40进行大量洗涤后，结合放射性标记蛋白通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分析，并通过荧光成像仪分析（分子动力学）进行可视化。随后对凝胶进行再水化，并通过考马斯蓝或银染色检查蛋白质负载量。通过在单独的聚丙烯酰胺凝胶上运行10%的输入来估算放射性标记靶蛋白的输入水平。
在图中所示的实验中。c、 在RRL中从pCITE-PRKX合成未标记的S标记PRKX，然后在4°c下将20μl裂解液与10μl S珠孵育15分钟，最终体积为250μl的PBS中固定。然后在PBS中进行五次冲洗。通过使用放射性标记蛋白和银染色的平行实验证实了PRKX的成功固定。然后用20μl35S标记的靶蛋白，并按上述方法进行分析。
Rep78与PRKX的体外相互作用。（a） 仅包含Rep78、Rep68或Mal序列的MBP融合蛋白固定在直链淀粉珠上，然后与35在RRL中合成的S标记PRKX、Rep68或荧光素酶（Luc）蛋白。洗涤后，通过12%聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影术显示与MBP融合蛋白相关的标记蛋白。车道标记表明MBP融合/RRL蛋白组合。泳道M，分子质量标记物（单位：千道尔顿）。（b） 输入与下拉反应中添加量的10%对应的RRL蛋白质。（c） 在RRL中合成未标记的S标记PRKX，并将其固定在S珠上，然后用35S标记、RRL衍生的Rep78或荧光素酶。通过PAGE和放射自显影术观察结合Rep78。（d） 含有Rep78的C末端139个氨基酸的GST融合蛋白用于下拉实验35S标记、RRL衍生的PRKX或荧光素酶。输入通道包含添加到下拉反应中的10%的量。
PKA分析。
100单位纯化PKAc（c）（Promega）与0.5至1μg MBP或GST融合蛋白（如上所述固定在珠子上）在最终体积为50μl的PBS中在4°C下孵育10分钟，然后用PBS进行大量漂洗。然后使用凯肽磷酸化测定法（PepTag；Promega）测定固定化PKA活性，如下所示。将小球重新悬浮在含有肯普肽底物的25μl激酶分析缓冲液中，然后在室温下培养30分钟。通过煮沸终止反应，并通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检查产物。对于Rep抑制PKA活性的实验，PKA的量c（c）在10分钟的反应中获得约50%的底物肽磷酸化所需的条件是首先通过经验确定的。然后使用此量的PKA进行分析c（c）保持不变，同时向反应混合物中添加更多的直链淀粉或谷胱甘肽稀释的MBP、MBP-Rep或GST和GST-C末端蛋白。然后按照上述方法测定肯普肽底物的磷酸化。
组蛋白H1激酶测定。
如上所述，将未标记的PRKX固定在S珠上。在室温下在激酶分析缓冲液（20 mM Tris-HCl[pH7.4]，10 mM MgCl）中培养10微升S珠2)含有20 nCi的[γ-32P] ATP，含或不含0.5μg组蛋白H1，最终体积为30μl。对于自磷酸化抑制测定，在培养45分钟之前加入0.3或0.6μg MBP或Rep-MBP融合蛋白。
细胞培养和转染。
HeLa细胞在5×10条件下培养5/转染前24小时，在六孔板上进行培养。每孔转染30μl DOTAP（Boehringer Mannheim）和1μg pFR-Luc、1μg mFA-CREB以及1μg pcDNA-PRKX、pCIS-PRKX，pFC-PKA或pCI。另外用2μg pKex68、pKex78或pCI转染样品。在转染后48小时收集细胞，然后进行裂解并分析蛋白质含量和荧光素酶活性。结果表示为相对于pFR-Luc/pCI/pCI对照的标准化荧光素酶活性。所提供的数据来自至少三个独立实验，每个实验均进行两次。
结果
利用酵母双杂交系统鉴定PRKX为Rep78相互作用蛋白。
将AAV2的Rep78基因克隆到酵母穿梭载体pGBT中，生成pGBT-Rep78，其中Rep78基因融合到Gal4 DNA结合域。将pGBT-Rep78转换为酿酒酵母HF7c单独或与Gal4激活域载体（pGAD424）联合在His脱落培养基上生长，表明Rep78在此系统中具有内在转录激活活性。然而，向培养基中添加20 mM 3-AT（组氨酸生物合成抑制剂）可有效抑制Rep78的反式激活（数据未显示），随后将此浓度的3-AT用于文库筛选。以载体pGBT-Rep78为诱饵，筛选在载体pGAD-GH中克隆的HeLa细胞源cDNA文库；随后进行β-半乳糖苷酶过滤测定。分离出11个在两种分析中均呈阳性的克隆。为了对推测的相互作用进行定量评估，酵母菌株SFY526含有lacZ公司由Gal4应答启动子驱动的基因，用pGBT-Rep78或pGBT转化。随后，用从文库中分离出的11个pGAD克隆分别重新转换这两个克隆。使用基于溶液的ONPG分析法对产生的克隆进行β-半乳糖苷酶生产分析。对于阳性对照，使用包含融合到DNA结合域（pGBTp130）的口袋蛋白p130和融合到激活域（pGAD-HPV16-E7）的人乳头瘤病毒E7蛋白的克隆。如图所示。其中三个克隆（pGAD6、-12和-162）与pGBT-Rep78结合产生的β-半乳糖苷酶的水平约为阴性对照（pGBT-Rep78+pGAD424）的10倍，与阳性对照（pGB Tp130+pGAD-HPV16-E7）的水平相当。这些克隆的活性取决于融合到DNA结合域的Rep78序列的存在，因为当结合空载体pGBT9（未显示）检测pGAD6、-12或-162时，可以观察到可忽略的β-半乳糖苷酶活性。我们得出结论，克隆pGAD6、-12和-162编码的蛋白质与Rep78特异性相互作用。
正相互作用克隆的酵母双杂交分析。用pGBT-Rep78转化SFY526酵母细胞，然后用活化域载体pGAD6到-319分别重新转化，该载体之前在LacZ过滤试验中呈阳性。然后使用定量的基于溶液的ONPG分析测定β-半乳糖苷酶的生成。对照转化为pGBT-Rep78加pGAD424（GAD载体）和pGBTp130加pGAD-HPV16-E7（p130/GAD-E7）。
对这些克隆的分析表明，这三个克隆都有相同的插入物，鉴定为PKX1的nt 449至2487（氨基酸29至358）（现在指定为PRKX；EMBL登录号。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“X85545”，“term_id”：“1052736”，“term_text”：“X85545“}}X85545型)，一个先前确定的cAMP依赖性蛋白激酶催化亚单位PKA的X连锁同源物c（c）(26). PRKX和PKAc（c）它们的催化结构域之间的同源性为75到76%，同源性为49到55%。因此，pGAD6被重新命名为pGAD-PRKX。
Rep68不与PRKX交互。
Rep68是Rep78的剪接变体，其中氨基酸530至621不存在，并被序列LARGHSL取代（图。a） ●●●●。因此，Rep78包含一个独特的C末端结构域，包含六个CXXH或CXXC基序，这些基序是许多转录因子中发现的锌指结构域的典型特征。为了研究Rep68是否能与PRKX相互作用，首先将Rep68基因克隆到pGBT9中以产生pGBT-Rep68。结合pGAD-PRKX转化该结构，然后测定β-半乳糖苷酶的产生（图。b） 。正如预期的那样，Rep78和PRKX的组合产生了高水平的β-半乳糖苷酶活性，而阴性对照Rep78和pGAD424的活性很低，但可以检测到，这与之前观察到的Rep78的反式激活活性一致。另一方面，Rep68与pGAD-PRKX或pGAD424控制载体联合使用时，没有检测到β-半乳糖苷酶活性。我们得出结论，Rep68在酵母双杂交系统中不与PRKX相互作用。此外，这表明Rep78，而不是Rep68，在这个系统中显示了内在的转录激活活动。与Rep78/PRKX和p130/HPV-16-E7相比，由pGBT-p107和pGAD-HPV16-E7组成的阳性对照显示出相当低的活性（图。)组合。这可能是由于p107在该系统中表达不良或耐受性低。
酵母双杂交分析以定位Rep78和PRKX之间的相互作用域。（a） pGBT-Rep78包含氨基酸1至621的全长Rep78 ORF。在pGBT-Rep68中，来自氨基酸529的内含子被剪接出来，并且序列LARGHSL出现在剪接受体位点（浅灰色）。安生态删除从pGBT克隆位点延伸至AAV nt 1767的RI片段，生成pGBT-Cterm，该片段编码Rep氨基酸483至621。（b） 用pGBT和pGAD载体将菌株SFY56酵母细胞转化为x个轴。然后通过ONPG测定β-半乳糖苷酶活性。误差线表示标准偏差。
Rep78的C末端区域与PRKX相互作用。
由于Rep和PRKX之间的相互作用仅限于Rep78，我们检查Rep78的C末端区域是否足以与PRKX相互作用。产生了仅编码Rep78的C末端139个氨基酸的pGBT载体（图。a） ，并如上所述对所得克隆pGBT-Cterm进行β-半乳糖苷酶活性检测。与pGAD-PRKX结合，Rep78 C末端克隆显示出接近全长Rep78克隆的β-半乳糖苷酶活性，表明Rep78 C端区域与PRKX相互作用（图。b） 。pGBT-Cterm结合空结合域载体pGAD-424也显示出明显的可检测活性。这证实了C末端区域具有内在转录激活能力，并表明锌结合域参与了这一现象。用C末端结构域结构观察到的β-半乳糖苷酶活性水平始终低于用全长Rep78克隆获得的水平（图。b和数据未显示）。虽然从这些实验中可以清楚地看出，Rep78的C末端区域对于与PRKX的相互作用至关重要，但C末端区域以外的区域可能有助于增强相互作用的强度。
pMal-Rep78融合蛋白与PRKX的体外相互作用。
为了确定Rep78和PRKX是否在体外直接相互作用，进行了下拉实验。Rep78和Rep68编码序列在大肠杆菌通过固定在直链淀粉微球上纯化蛋白质。来自pGAD-PRKX的PRKX片段被克隆到T7启动子驱动的载体pCITE4a中，PRKX蛋白在RRL中表达并代谢标记。Rep68和荧光素酶蛋白也在RRL代谢标记以用作对照（图。b） 。然后将标记的蛋白质与上述等量的固定化MBP融合物组合用于下拉反应，并通过SDS-PAGE测定与珠子相关的标记的蛋白质的量。如图所示。a、 MBP-Rep78与标记荧光素酶无关；然而，在与标记的PRKX孵育后观察到强烈的相互作用，如出现约43至46 kDa的带簇所证明的。标记的PRKX不单独与MBP相互作用。MBP-Rep68不能与标记的PRKX结合，这与之前对酵母双杂交系统的观察一致。为了确保MBP-Rep68能够胜任蛋白质相互作用，我们用从T7-driven Rep68表达载体（p68-myc/his）产生的RRL标记的Rep68培养MBP-Rep68。通过使用该方法，发现MBP-Rep68能够自我关联，证实并扩展了之前对Rep78的观察(22,49).
为了进一步确认Rep78和PRKX之间的相互作用，进行了反向下拉实验。将PRKX克隆到T7表达载体pCITE4a中后，在分子中添加了N末端肽S标签。在RRL中合成未标记的S标记PRKX，然后将其固定在S珠上。为了提供Rep78的来源，我们将该基因克隆到pcDNA3.1中，将Rep78置于CMV和T7启动子的控制之下。使用T7启动子在RRL中产生标记的Rep78。然后将S-bead-fixed PRKX与标记的Rep78/RRL中制备的荧光素酶孵育。如图。c、 固定化的PRKX与Rep78相互作用，但不与萤光素酶相互作用。与pcDNA3.1衍生Rep78相关的SDS-PAGE中的高表观分子量是由于在蛋白质中添加了C末端Myc和His标记（参见材料和方法）。
实验如图所示。表明PRKX与包含483至621氨基酸的Rep78的C末端片段相互作用。尝试将该片段表达为MBP融合蛋白失败，因为所得蛋白在大肠杆菌（未显示）。然而，发现含有Rep78 C末端结构域的GST融合蛋白是稳定的，可以在谷胱甘肽-脑葡萄糖珠上纯化（未显示）。固定化GST–C末端蛋白用于与RRL中产生的标记PRKX或荧光素酶的下拉实验。如图所示。d、 GST–C末端片段与PRKX相互作用，但不与荧光素酶相互作用。单独相当数量的商品及服务税无法与标记的PRKX相关联。综上所述，这些数据表明PRKX和Rep78可以在体外进行物理相互作用，并且这种相互作用依赖于Rep78的C末端区域。
PRKX显示自磷酸化和组蛋白H1激酶活性。
尽管PRKX与哺乳动物PKA的激酶结构域具有高度同源性c（c）PRKX的亚单位、激酶活性以前没有被证明。我们试图证明PRKX的激酶活性，最初以组蛋白H1为底物。在RRL中合成未标记的S标记PRKX，并将其固定在S珠上。洗涤后，将蛋白质培养在含有[γ]的激酶缓冲液中-32P] 含或不含组蛋白H1的ATP。令人惊讶的是，当PRKX单独与不含组蛋白H1的激酶缓冲液孵育时32P标记带在约46 kDa处可见，对应于PRKX本身的大小（图。a、 车道2）。银染色显示，存在的唯一可检测的蛋白质是PRKX（未显示）。这些数据表明，PRKX具有自我磷酸化的能力。为了确保该活性与PRKX相关，而不是RRL携带的污染物，将S珠与含有荧光素酶的RRL孵育，然后清洗并用于激酶分析。在对照组中未检测到磷酸化蛋白（图。a、 车道1）。使用全长未标记的PRKX克隆进行的其他对照实验证实，携带在PRKX上的N末端S标记不是自动磷酸化的底物（未显示）。
体外PRKX蛋白激酶活性。（a） 在RRL中合成S标记的PRKX，并在S珠（S-bds）上纯化，然后添加以组蛋白H1作为底物存在（第3道）或不存在（第2道）进行的30分钟激酶分析。作为阳性对照，纯化PKAc（c）在激酶分析中使用组蛋白H1（第5通道）或不使用组蛋白H2（第4通道）。作为阴性对照，将S珠与荧光素酶（LUC）编程的RRL孵育，然后添加到激酶分析中（通道1）。32通过PAGE和放射自显影术观察P标记的磷酸化蛋白。显示磷酸化PRKX和组蛋白H1的位置。泳道M，分子质量标记物（单位：千道尔顿）。（b） 与面板a相同，只是将激酶反应混合物的孵育时间延长至60分钟。在本实验中，组蛋白H1被添加到阴性对照反应中（通道1）。（c） S珠纯化的PRKX与荧光标记的PKA底物坎普肽（LRRASLG）孵育。通过琼脂糖凝胶电泳从未磷酸化底物中分离磷酸化的坎普肽，并在紫外透射仪上进行可视化。作为对照，在激酶反应中使用预先与荧光素酶编码的RRL孵育的S珠。（d） S-bead纯化的PRKX在α[γ-32P] 如图所示，在添加的MBP或MBP-Rep融合蛋白存在300 ng（3、5和7道）或600 ng（4、6和8道）时发生激酶反应。车道1，PRKX，但无MBP；通道2，来自荧光素酶编程RRL的S珠，无MBP。
在PRKX反应中添加组蛋白H1最初没有明显效果（图。a、 车道3）。然而，在长期暴露中，观察到PRKX的组蛋白H1激酶活性较弱（未显示）。我们推断，虽然自磷酸化可能是首选反应，但在PRKX激酶分析混合物的较长培养时间后，H1激酶活性可能明显。事实上，在PRKX与组蛋白H1长时间孵育后，除自身磷酸化活性外，后者的磷酸化也很明显（图。b、 车道3）。控制装置（图。b、 通道1）表明，通过与S珠的非特异性结合，RRL中没有H1激酶活性。对与自磷酸化相关的延迟H1激酶活性的观察表明，自磷酸化事件可能与PRKX活性对异源底物的激活有关（见讨论）。
我们还研究了PRKX是否能够磷酸化PKA靶肽LRRASLG。我们使用了一种分析方法，其中该肯普肽是荧光标记的，并且在其未磷酸化形式中，携带的净电荷为+1。肽的磷酸化产生−1的净电荷；因此，在琼脂糖凝胶电泳中，未磷酸化和磷酸化形式的方向相反。然后通过紫外荧光观察每种形式的肽的相对量。如图所示。c、 来自RRL的S-tag纯化的PRKX样品能够磷酸化kemptide底物，而与含有荧光素酶的RRL孵育的S珠没有相关的kemptied激酶活性。
PRKX与Rep78相互作用的一个可能结果可能是抑制激酶活性。因此，研究了MBP-Rep融合蛋白抑制PRKX自身磷酸化活性的能力（图。d） ●●●●。用[γ]培养S-tag纯化的RRL-derived PRKX-32P] ATP导致了自磷酸化，这是之前观察到的（车道1）。添加更多纯化的、麦芽糖稀释的MBP对激酶活性没有影响（通道3和4）。然而，添加越来越多的MBP-Rep78融合蛋白显著抑制了PRKX激酶活性（通道7和8）。MBP-Rep68也抑制激酶活性，但程度较小。最后一次观察的原因尚不清楚。
PRKX可以激活CREB依赖的转录。
PRKX与PKA的紧密同源性c（c）结合PRKX可磷酸化PKA kemptide底物的观察，提示PRKX可能通过激活CREB调节PKA应答的转录调控途径。我们利用瞬时共转染模型研究了PRKX是否能够激活CREB依赖性转录。在该系统中，CREB激活域/Gal4 DNA结合域融合蛋白用于激活Gal1上游激活序列控制的荧光素酶报告子。因此，当CREB被PKA通路激活磷酸化时，荧光素酶表达被强烈诱导。
用CREB/Gal4融合构建物pFA-CREB和报告质粒pFR-Luc共转染HeLa细胞。为了研究PRKX激活CREB的能力，在CMV启动子的控制下克隆了PRKX的全长cDNA，以产生pcDNA-PRKX。pcDNA-PRKX与pFA-CREB和pFR-Luc的共转染导致荧光素酶活性的诱导，表明PRKX可以激活CREB依赖的转录（图。，前两个栏）。诱导程度（约8倍）远低于PKA时观察到的约80倍诱导c（c）使用表达载体（见下文）。这表明PRKX在激活该途径方面可能不如PKA有效。然而，PRKX起始密码子的自然背景(26)与科扎克共识在最佳翻译启动方面的匹配性较差。我们还将包含PRKX氨基酸29至358的S标记片段从pCITE-PRKX克隆到pCI中，生成一个结构体（pCIS-PRKX），其中AUG处于强Kozak上下文中。使用pCIS-PRKX的共转染实验证明CREB的平均激活率为23.5倍（未显示）。
CREB依赖性转录激活的转染分析。用Gal4 DNA结合域/CREB融合蛋白载体pFA-CREB和pFR-Luc共同转染HeLa细胞，后者是一种包含最小启动子和Gal1上游激活序列的荧光素酶报告构建物。进一步用PRKX表达载体pcDNA-PRKX和分别表达Rep78和Rep68的pKex78或pKex68载体共同转染样品。48小时后，裂解细胞并测定荧光素酶活性。结果与仅转染pFR-Luc/pFA-CREB的细胞中发现的水平有关。显示了至少三个独立实验的平均值，每个实验重复进行，标准偏差用误差线表示。
Rep78，而不是Rep68，通过PRKX抑制CREB依赖性转录的激活。
利用上述共转染系统研究Rep蛋白对CREB依赖性转录激活的影响。当克隆只表达Rep78（pKex78）时(22)与pFA-CREB、pFR-Luc和pcDNA-PRKX共同转染HeLa细胞，观察到荧光素酶活性的激活降低（图。，第三巴）。使用仅表达Rep68的pKex68时，未观察到这种抑制（第四栏）。这表明Rep78与细胞中的PRKX相互作用并抑制PRKX；然而，我们不能排除Rep78对转录的影响可能有助于观察到CREB依赖性激活的抑制（见讨论）。
Rep78直接与PKA交互c（c）并抑制其催化活性。
因为PRKX是PKA的密切同源物c（c），我们调查了PKA是否c（c）也可能与Rep78互动，尽管PKAc（c）未从酵母双杂交文库筛选中分离。纯化PKAc（c）（100 U）与纯化的MBP-Rep78、MBP-Rep68或固定在直链淀粉珠上的MBP混合。经过大量洗涤后，使用PKA特异性肯普肽靶点分析与珠相关的蛋白的激酶活性。如图所示。a、 固定化激酶活性与MBP-Rep78相关，但与MBP-Rep68或MBP单独无关。在没有PKA预孵育的情况下c（c），MBP-Rep78未显示任何激酶活性（未显示）。我们得出结论，Rep78与PKA相互作用c（c）因为Rep78和PKAc（c）以纯化蛋白的形式存在，这种相互作用很可能涉及两种蛋白之间的直接物理接触。
PKA之间的体外相互作用c（c）和代表78。（a） 纯化PKAc（c）（100 U）与固定在直链淀粉珠上的0.5至1.0μg MBP（第2道）、MBP-Rep68（第3道）或MBP-Rep78（第4道）融合蛋白孵育。洗涤后，将珠添加到肯普肽磷酸化分析中。用琼脂糖凝胶电泳和紫外透照法观察磷酸化肯普肽。PKA第1车道c（c）直接添加到kemptide分析中。（b） 与面板a中相同，但GST（通道1）或GST–C末端蛋白（通道2）用于捕获PKAc（c）.（c）一单位纯化PKAc（c）添加到20分钟kemptide分析中，以及0.3、0.6或0.9μg MBP（1到3道）、MBP-Rep68（4到6道）或MBP-Rep78（7到9道）融合蛋白。（d） 一台PKAc（c）添加到含有30、60或90 ng GST（泳道1至3）或GST–C末端蛋白（泳道4至6）的8分钟keptide测定中。
由于Rep78的C末端区域与PRKX相互作用有关，因此很可能与PKA的相互作用涉及相同的结构域c（c）.用纯化的PKA培养固定化GST–C末端蛋白c（c）随后进行大量洗涤，使kemptide激酶活性与固相结合（图。b、 车道2）。PKA孵化c（c）单独使用固定化GST不会导致激酶活性的捕获（通道1）。因此，Rep78和PKA之间的相互作用依赖于Rep78的482和621氨基酸之间的序列。
Rep78和PKA之间相互作用的可能结果c（c）可能是抑制激酶活性。为了研究这一点，我们首先测定了纯化PKA的浓度c（c）在标准的kemptide分析中，它使底物转化为磷酸化形式约50%。然后进行反应，其中PKA的浓度为c（c）在肯普肽试验期间，与浓度增加的麦芽糖稀释MBP、MBP-Rep68或MBP-Rep78孵育（图。c） ●●●●。在试验中添加较高浓度的MBP-Rep78导致PKA抑制c（c）磷酸化kemptide的积累减少证明了这一点（7到9道）。单独添加MBP或MBP-Rep68未显示抑制作用（通道1至6）。然而，我们注意到，长时间与高浓度MBP-Rep68孵育有轻微抑制作用（未显示）。我们得出结论，Rep78和PKA之间的相互作用c（c）可以抑制PKA的激酶活性c（c）.
我们研究了Rep78的C末端区域是否足以抑制激酶活性（图。d） ●●●●。重复上述kemptide磷酸化抑制试验，这一次使用洗脱的GST–C末端蛋白或GST蛋白与PKA预孵育c（c）GST-C末端蛋白浓度的增加抑制了激酶活性（图。d、 车道4至6），而仅GST没有（车道1至3）。因此，Rep78的C末端139氨基酸似乎足以结合和抑制PKAc（c）激酶活性。
Rep78而非Rep68通过PKA抑制CREB依赖性转录的激活c（c）.
我们使用CREB依赖性转录系统研究Rep78蛋白是否可以阻断PKA通路的下游功能。除pKex78、pKex68或等量的pCI载体外，HeLa细胞还与pFA-CREB、pFR-LUC和pFC-PKA共转染。如图所示。pFC-PKA的共转染大大诱导了报告基因的活性。在分析中添加pKex78导致CREB依赖性启动子激活受到严重抑制。使用pKex68时观察到很少或没有抑制。这些数据表明，Rep78可以阻断PKA诱导细胞CREB依赖性转录。虽然Rep78对转录的直接作用可能起作用，但这些观察结果强烈表明，Rep78可以通过结合并抑制PKA的激酶活性来阻断CREB的激活c（c）.
代表介导抑制CREB依赖性转录激活的转染试验。用pFR-Luc和pFA-CREB转染HeLa细胞。一些样本被PKA共同感染c（c）表达载体pFC-PKA和pKex68或pKex78。结果与仅转染pFR-Luc/pFA-CREB的细胞中发现的水平有关。显示了至少三个独立实验的平均值，每个实验重复进行，标准偏差用误差线表示。
讨论
在本研究中，我们确定cAMP依赖性PKA的催化亚单位及其X连锁同源物PRKX为AAV Rep78的细胞靶点。在酵母双杂交系统、体外和哺乳动物细胞与CREB依赖的转录系统中证明了这种相互作用。在PKA的情况下c（c），纯化蛋白之间显示出直接的相互作用。因此，我们认为这可能代表AAV感染或复制期间发生的生理交互作用。
PRKX最初是通过定位克隆确定为点状软骨发育不良基因的候选基因(26). 研究表明，mRNA在成人和胎儿组织中广泛表达，该基因与染色体不稳定部位有关。对PRKX编码的蛋白质几乎没有进行过表征。虽然PRKX是PKA的密切同源物c（c），它不是PKA亚型。亚型之间的同源性在催化域中通常大于90%，而在该区域与PRKX的同源性仅为49-55%。PRKX最接近的已知同源物是果蝇属数据中心2(24). 少校果蝇属PKA同源物c（c）是DC0，而DC2不能补充DC0突变体，这表明它们的功能不同(39). 通过类推，这些观察结果表明PRKX和PKA可能具有相关但可分离的功能。
我们在这里表明，PRKX对组蛋白H1和含有PKA一致识别序列的肽表现出激酶活性。我们进一步表明，PRKX表达载体可能通过体内CREB磷酸化诱导CREB依赖的转录激活。在这些方面，PRKX的功能与PKA相似c（c）然而，一些证据表明PKA和PRKX在功能上可能并不相似。首先，发现PRKX在体外进行自磷酸化，而PKA的自磷酸化c（c）不会发生。PRKX的组蛋白H1激酶活性仅在延长激酶分析混合物的培养时间后检测到。自磷酸化优先发生在过量组蛋白H1存在的情况下，这一观察结果表明，自磷酸化事件可能与PRKX活性对异源底物的激活有关。此外，尽管PRKX可以激活CREB依赖的转录，但激活程度远低于PKA的激活程度c（c）表达式向量。这种影响可能部分归因于PKA和PRKX表达水平的差异，因为PRKX的自然起始密码子处于弱Kozak共识环境中(26). 用一个接近共识的起始密码子替换起始密码子将CREB依赖性转录的激活增加到大约20倍（数据未显示），这比用自然起始密码子观察到的8倍诱导要多（图。)但仍低于PKA通常观察到的80倍诱导c（c）表达载体（图。). 综上所述，这些观察结果表明，PRKX和PKA的底物偏好和调节机制可能不同，需要对PRKX与PKA活性进行严格比较。
PKA是一种相对普遍存在的酶，所以问题是为什么PKA没有从酵母双杂交系统筛选中出现。同样，我们也没有检测到HMG-1和Sp1蛋白的相互作用，其他方法已经证明HMG-1蛋白与AAV Rep相互作用(11,21,45). 筛选酵母双杂交文库很困难，因为Rep78具有内源性反式激活活性，并且含有Rep78的酵母克隆生长很差。因此，筛选出的潜在相互作用的数量是次优的，可能还有其他重相互作用蛋白尚未在筛选中确定，这一点仍在继续。
在酵母中，反式激活活性和生长抑制表型都定位于Rep78的C末端区域（图。和数据未显示）。与PRKX和PKA的相互作用清楚地映射到这个C末端结构域，这将Rep78与Rep68区分开来。该结构域包含可能参与三个锌指形成的基序，并包含与腺病毒E1a的反式激活功能有关的其他序列元素(22,55). 很少有研究能够解决Rep78和Rep68功能之间的差异，部分原因是仅表达单个Rep蛋白的载体最近才可用。对于Rep68，尽管启动子下调所需的主要序列位于N末端区域，但已注意到下调异源启动子的能力略有降低(22). Rep68-MBP融合蛋白产生于大肠杆菌已证明足以支持AAV体外复制(54). 最近有研究表明，Rep78蛋白可以自我结合(20,49). 如本文所示，Rep68也可以观察到自关联（图。). 因此，一种仅针对Rep78的生物功能尚待阐明。与PRKX和PKA相互作用的Rep78 C末端域c（c）由p19衍生的Rep52蛋白共享。这表明Rep52也可能与这些细胞靶点相互作用；然而，这种相互作用尚未得到实验证明。
PKA活性可以通过MBP-Rep78的下拉试验检测（图。a） ；然而，Rep78也被发现抑制激酶活性（图。c和d）。在下拉分析中，PKAc（c）过量存在，并且激酶检测的持续时间比抑制检测的持续更长。下拉分析中检测到的激酶活性可能来自游离PKAc（c）在激酶测定过程中，其与复合物分离，表明抑制可能是可逆的。在体外试验中，我们有时观察到Rep68可以抑制磷酸化，尽管程度要小得多。这表明，尽管Rep68明显不能结合PRKX和PKA，但氨基酸529至621内含子区域以外的结构域可能有助于抑制激酶活性。在存在高浓度纯化Rep68蛋白且紧密结合要求降低的体外检测中，这些结构域可能具有较弱的效果。PKA和Rep蛋白结合和激酶抑制的结构要求的详细分析正在进行中。
在共转染试验中，Rep78明显抑制CREB依赖的转录激活；然而，实现这一目标的机制尚不明确。体外数据表明，抑制PRKX和PKA激酶活性是主要原因，因为该系统高度依赖CREB磷酸化。然而，还必须考虑Rep对异源启动子具有抑制活性(18,19,31,42). 该系统中使用的CREB、PRKX、PKA和Rep表达结构均使用CMV即时早期启动子增强子，该增强子对Rep抑制相对不敏感(1). Rep对异源启动子的抑制已被证明是通过Sp1位点介导的，至少在某些情况下是这样(21). 报告构建物pFR-Luc中的Gal4-CREB应答启动子非常简单，包括Gal上游激活序列和腺病毒E1b的TATA盒。E1b启动子Sp1位点在pFR-Luc结构中不存在；因此，Rep对该启动子转录的直接影响应该是最小的。Rep68不能抑制来自该启动子的CREB依赖性转录激活的观察结果支持了这一观点（图。和). 因此，我们支持这样的解释，即Rep78抑制细胞中PRKX和PKA的激酶活性，从而降低CREB磷酸化，从而抑制报告基因的激活。
Rep78与PKA或PRKX之间的交互作用可能会产生什么功能后果？一种可能性是Rep78是PRKX和/或PKA的底物。AAV Rep蛋白被磷酸化，在复制周期中其磷酸化状态发生变化(10). 然而，我们无法通过PRKX或PKA证明MBP-Rep融合蛋白的磷酸化（数据未显示）。
许多病毒包含PKA/CREB通路来调节其基因表达；示例包括人类T细胞白血病病毒1型、人类免疫缺陷病毒1型，腺病毒、HSV和EB病毒(12,15,28,33,41,47,50,59,63). cAMP反应途径成分经常用于控制早期到晚期或潜在到溶解复制模式的转换。例如，腺病毒E1a蛋白可以通过与CBP/p300的相互作用来处理含有CRE的私有基因(44). 此外，腺病毒的E1a、E3和E4启动子含有CRE(34). HSV潜伏相关转录物和UL9基因启动子具有cAMP反应性，这种反应与诱导裂解复制有关(33). HSV ICP4蛋白已被证明为HSV和AAV复制提供关键的辅助功能(40,56). ICP4是PKA的底物，其磷酸化促进HSV裂解复制(59). 这些观察结果表明，AAV Rep78的一个功能可能是抑制辅助病毒对cAMP通路的利用，从而抑制辅助病毒的生产性复制。
已知很少有病毒能抑制cAMP通路。丙型肝炎病毒NS3蛋白已被证明与PKA结合c（c）抑制其催化活性和核移位(6,7). 已证明脊髓灰质炎病毒3Cpro蛋白酶可裂解CREB(61). 这些相互作用在各自的病毒生命周期中的作用尚不清楚。AAV2和小鼠自主细小病毒微小病毒（MVMp）在控制主要非结构蛋白的启动子中都有CRE元件(13,46). AAV2 p5启动子CRE的功能尚未被广泛研究；然而，cAMP依赖性刺激小鼠微小病毒的CRE具有负调节作用(46). 这支持一种模型，其中Rep78对PRKX/PKA的抑制可能涉及控制Rep基因表达的自动调节环。因此，我们认为Rep-PRKX/PKA相互作用的功能可能会影响AAV和辅助病毒复制之间的平衡。
致谢
我们感谢Ken Berns、J.Kleinschmidt、G.Rappold和Massimo Tommasino慷慨捐赠质粒，感谢Stephen Lyons提供的卓越技术援助。
这项工作得到了癌症研究运动和国际癌症研究协会的支持。
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