柯萨奇病毒腺病毒受体蛋白可作为a、C、D、E和F亚群腺病毒血清型的细胞粘附蛋白

摘要

人类腺病毒（Ads）与广泛的热带病相关(33,50,51). 他们被分为六个不同的亚群A到F，至少有49个血清型(21,41)根据其遗传变异性、致癌潜能和DNA中的G+C含量(21,50——52). 根据不同的血凝模式，对B亚群（BI和BII）和D亚群（DI、DII和DIII）进行了进一步的亚类划分(12,18,32,33,40,50). 广告能够感染各种不同的组织，并已被确定为各种疾病的病原体(21,22,50,51). 例如，血清型Ad2和Ad5（亚组C）与上呼吸道感染有关，血清型Ad3（亚组B）也与上呼吸道感染有关，尽管后者似乎感染了气道的解剖学上不同的区域(22,50,51). 血清型Ad8和Ad9（D亚组）与流行性角结膜炎相关，Ad4（E亚组）和肺炎相关，Ad12（A亚组）则与隐性肠道感染相关(33)以及Ad40和Ad41（F亚组）与胃肠炎相关（参考文献22,50、和51以及其中的参考）。对不同Ad血清型的详细系统发育分析产生了两个表型簇；胃肠道簇（A和F亚组）和呼吸簇（B、C和E亚组）(三).

有人认为，不同血清型在不同组织中的明显嗜性是由病毒与不同细胞受体的相互作用引起的(50,51). 事实上，令人信服的是，Ad2/5和Ad3纤维蛋白识别不同的细胞受体蛋白(9,10,38,45). 已经证明，B亚群血清型Ad35识别除CAR外的受体(4). 这导致了Ad5/纤维3嵌合体的构建(27,44)和Ad5/fiber 7嵌合体(14)纤维受体向性发生改变，因此可用于靶向显示不同纤维2/纤维3受体水平的组织，如THP1单核细胞(44).

C亚组Ads通过单独但协同的事件附着和摄取到细胞中，这些事件是由纤维蛋白与附着受体和戊糖碱蛋白与内化受体的相互作用引起的(55). 46-kDa柯萨奇病毒-腺病毒受体（CAR）蛋白介导C亚群Ad2和Ad5的纤维依赖性粘附(4,49). 纤维蛋白的C末端旋钮赋予细胞受体识别的特异性(13,16,27,29,38,45). 通过X射线晶体学对1.7Å处的纤维5旋钮进行分析，得出了该蛋白质结构的模型，并确定了一些暴露的氨基酸残基和结构环，这些残基和环理论上与细胞受体识别有关(56). 接下来，在一个已经证明独立于纤维细胞识别的过程中(11,27,55)，病毒戊糖基蛋白与细胞α结合_v（v）-整合素通过RGD环，RGD环是一个从戊糖基三肽结构中突起的三肽基序，导致病毒颗粒快速内化(30,45,46,52,54,55).

除了确定CAR是Ad2和Ad5的细胞纤维受体之外(4,49)，在阐明细胞识别和附着的分子机制方面取得了进展。通过交叉竞争实验表明，尽管Ad2、Ad5和Ad9的纤维具有不同的取向性并分为不同的亚组C和D(21,33,50)，识别相同的细胞纤维受体(38).

观察到来自Ad9（D亚组）和Ad2（C亚组）的旋钮相互竞争结合，表明来自其他亚组的Ad血清型也可能识别相同的受体。作为第一步，我们构建了八种纤维球蛋白的杆状病毒表达克隆，这些蛋白来源于代表六个亚群的血清型。在竞争实验中，我们发现除Ad3外，代表五个亚群A和C到F的所有血清型都与CAR交叉竞争。为了对这一现象进行详细分析，我们制作了一个杆状病毒克隆，该克隆在昆虫细胞中表达可溶性CAR蛋白（sCAR）。纯化的sCAR蛋白被证明直接与来自六个亚组中五个亚组的病毒衣壳和纤维球结合。此外，CAR结合血清型与sCAR的预孵育显示可以阻断其与CAR表达细胞的结合。最后，用人CAR基因cDNA转化的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞进行结合实验(4)验证了除B亚群外的所有Ad亚群的血清型都可以将CAR蛋白用作细胞纤维受体。

材料和方法

结果

纤维旋钮交叉比赛。

先前的研究表明，通过用C亚群病毒的纤维蛋白预先培养细胞，可以阻止Ad9（D亚群）和Ad12（A亚群）与细胞结合，这表明他们能够将CAR蛋白识别为细胞纤维受体(2,38). 这些观察促使我们评估不同Ad亚组的纤维受体特异性。作为第一步，我们使用佐敦-海因算法对13个纤维球的氨基酸序列进行了比对。系统发育树上的两个主要簇被区分开来（图。​（图1）：1)顶聚类包括A、C、D和E亚组的Ad血清型，下聚类包括B亚组和F亚组的血清型；Ad2和Ad5，66%；Ad9和Ad15，59%；Ad12和Ad31，81%；Ad3和Ad7占52%。亚组之间的旋钮序列不太相似（表​（表1）。1). 例如，F5K与F4K相似63%，与F9K相似52%，与F12K相似40%，与F41LK相似仅29%。

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图1

13个纤维球氨基酸序列的系统发育树。序列的来源在材料和方法中确定。按照表脚注中的说明对齐序列​表11.

表1

15个纤维旋钮氨基酸序列的比对^一

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^一十五个纽扣氨基酸序列的相似表。序列的来源在材料和方法中确定。序列与TLWT铰链序列或类似序列对齐(8,47)通过使用程序Megalign和佐敦-海因算法以及PAM 250权重表，将其转换为翻译终止密码子。亚组内血清型之间的相似性分数以黑体字打印。 

在这些比较的基础上，我们选择了八个旋钮来构建His标记的F12K（亚组A）、F3K（亚组B）、F2K和F5K（亚组C）、F9K（亚组D）和F4K（亚组E）的杆状病毒表达载体。因为Ad41（子组F）既有长纤维又有短纤维(57)F41LK和F41SK均在昆虫细胞中产生。纯化后，将旋钮蛋白用于竞争结合分析^三A549细胞上的H标记亲本病毒（表​（表2）。2). Ad2、Ad4、Ad9和Ad12的纤维球和Ad41的长纤维抑制所有受试病毒的附着，但Ad3除外，后者仅被其同源纤维球抑制。这表明，除Ad3外，所有测试的血清型都可以使用CAR作为细胞纤维受体。血清型Ad9仅被F2K、F4K、F5K、F9K、F12K和F41LK部分抑制。用5 mM EDTA处理细胞后，Ad9结合抑制率增加到90%（数据未显示）。这证实了早先的一项观察，即Ad9与细胞的结合依赖于纤维受体和戊糖碱–α_v（v）-整合素相互作用，后者依赖于二价阳离子，并被螯合剂如EDTA和EGTA抑制。F41SK蛋白不抑制任何血清型，包括亲本病毒Ad41，而F41LK蛋白则抑制。因此，这表明Ad41长纤维可以作为Ad41的细胞粘附蛋白。

表2

纯化旋钮蛋白对Ad血清型的交叉竞争^一

Sero-类型	抑制b条签署人：
	A（F12K）	B（F3K）	C（平方公里）	D（F9K）	E（F4K）	F类
						F41LK码	F41SK系列
广告12	+++	−	+++	+++	+++	+++	−
广告3	−	+++	−	−	−	−	−
广告2	+++	−	+++	+++	+++	+++	−
广告9	++	−	++	++	++	++	−
广告4	+++	−	+++	+++	+++	+++	−
广告41	+++	−	+++	+++	+++	+++	−

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^一大约10⁶将A549细胞（人肺癌细胞）在250μl PBS和2μg纯化纤维球蛋白/ml（37°C）中预培养1h。将细胞冷冻10分钟^三添加H标记的血清型，并在4°C下孵育1小时。细胞被清洗了两次。将颗粒放入100μl PBS中，加入闪烁鸡尾酒中，并直接计数。 

^b条+++，>95%抑制；++，40%至60%抑制；−，无抑制作用。 

可溶性CAR蛋白与衣壳和纤维球蛋白结合。

由于Ad2和Ad5纤维已被证明与CAR结合，我们的交叉竞争结果强烈表明亚群A、D、E和F也与CAR结合。构建了表达分泌型sCAR的杆状病毒载体，其由CAR蛋白的胞外结构域及其天然信号序列组成(4)一个连接子序列和一个FLAG-tag序列DYKDDDDK，以便于检测和纯化。除了我们已经获得的血清型外，293/ORF6细胞中还产生了另外三种血清型的病毒库存，即Ad31（A亚群）、Ad15（D亚群）和Ad19（D亚组）(5). 用slot-blot装置将每个血清型纯化的Ad固定在硝化纤维素上，并测试其结合sCAR的能力（图。​（图2）。2). 除B亚组外，所有受试血清型均结合sCAR蛋白。它们包括Ad12和Ad31（亚组A）、Ad2和Ad5（亚组C）、Ad9和Ad15（亚组D）、Ad4（亚组E）和Ad41（亚组F）。在另一个实验中（数据未显示），D亚组病毒Ad19也与sCAR结合。Ad41的信号似乎比其他信号弱，可能是因为短的Ad41纤维不结合CAR。毫不奇怪，B亚群病毒Ad3和Ad7没有结合sCAR蛋白（图。​（图2）。2).

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图2

sCAR-病毒缝隙印迹。约2×10¹⁰将每种血清型的颗粒印在硝酸纤维素上。在PBS中封闭5%的牛奶，然后用可溶性CAR蛋白孵育过夜。按照材料和方法进行检测。字母表示子组分类。字母和数字组合是指以下血清型：A1和A2、Ad12和Ad31；B1和B2、Ad3和Ad7；C1和C2、Ad2和Ad5；D1和D2、Ad9和Ad15；E1、Ad4；第1层，第41页。

将纯化的纤维球蛋白印在硝化纤维素膜上，并用sCAR蛋白孵育印迹，证实了这些结果。图中的结果。​图3三证明除F3K和F41SK外，所有测试的纤维球蛋白都能结合sCAR蛋白。尽管每个测试的旋钮都经过了纯化，但纯度和测得的蛋白质浓度的差异可能解释了观察到的信号强度的差异。在一个反向实验中，首先将sCAR蛋白固定在塑料上，然后将标记的病毒结合在一起，测量到的结合水平在所有测试血清型中波动不超过两到三倍（数据未显示）。这表明，每种血清型对CAR蛋白的亲和力大体相当。显然，需要进一步研究来解决这一点。

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图3

sCAR纤维旋钮蛋白槽印迹。将大约2μg纯化的纤维球蛋白印在硝化纤维上。阻断印迹并用sCAR蛋白孵育过夜。按照材料和方法进行检测。字母表示子组分类。字母和数字组合是指以下纤维球蛋白：A1、F12K；B1、F3K；C1和C2、F2K和F5K；D1、F9K；E1、F4K；F1和F2、F41LK和F41S-K。

接下来评估sCAR蛋白阻止纤维介导的粘附到Ramos细胞的能力。选择这些细胞是因为它们表达高水平的CAR蛋白，但缺乏α_v（v）-整合素。这允许直接评估纤维介导的结合，同时消除任何涉及α的二级结合机制_v（v）-Ad9的整合素(38). 首先，我们确定需要最终浓度为10μg/ml的sCAR蛋白来完全抑制Ad2与Ramos细胞的结合（数据未显示）。然后^三在室温下，将H标记的Ad12、Ad3、Ad2、Ad9、Ad4和Ad41（输入计数相等；通过紫外光谱测定的粒子数大致相同）与sCAR蛋白孵育30分钟，并添加到Ramos细胞中。培养1小时后，清洗细胞，并通过闪烁计数测定结合病毒（图。​（图4）。4). 我们的结果表明，除血清型Ad9外，所有先前被证明与sCAR结合水平相当的病毒都与Ramos细胞结合，而Ad9的结合水平比其他病毒低得多。虽然已经证明Ad9能够将CAR蛋白用作细胞纤维受体，但它优先使用α_v（v）-整合素与细胞结合。由于Ramos细胞缺乏这些玻璃体凝集素受体，我们假设其他细胞表面受体可能干扰短轴Ad9纤维到达其细胞表面受体CAR的能力，导致观察到的Ad9与这些细胞的结合水平较低(38). 未发现与Ad3结合，表明Ramos细胞不表达Ad3纤维受体。将病毒与sCAR蛋白预孵育后，与细胞结合的病毒数量下降了95%。这表明，sCAR蛋白通过与受体识别旋钮结合来阻断病毒纤维蛋白，从而阻止它们与Ramos细胞上的天然受体结合。结果还首次证明，sCAR蛋白可以在无辅因子的情况下直接与纤维蛋白相互作用，并且由于其缺乏细胞内尾部，因此没有细胞内信号。

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图4

sCAR蛋白抑制与Ramos细胞的结合。放射标记Ad血清型的等比活度输入剂量（9000 cpm）与sCAR蛋白以10μg/ml在RT孵育30分钟。然后，将病毒添加到2×10⁶Ramos细胞，在RT下悬浮培养1h。清洗细胞，将颗粒重新悬浮在100μl PBS中，并通过闪烁计数测定结合病毒。条形图表示cpm结合（三次分析的平均值±5%）。CTRL是没有sCAR预孵化的控件绑定。

为了证实所选血清型通过纤维CAR相互作用附着在细胞上，用不表达CAR蛋白的野生型CHO细胞和用人CAR cDNA转化的CHO细胞系进行了结合实验(4). 在对照实验中，没有一种受试病毒（Ad12、Ad2、Ad9、Ad4和Ad41）在背景以上与野生型CHO细胞结合（图。​（图5）。5). 然而，所有病毒都与CHO-CAR细胞高度结合。用饱和量的纯化F5K蛋白（最终浓度为2μg/ml）预培养这些细胞后，病毒的结合降低到背景水平。用饱和量的sCAR蛋白预孵育Ad5也可将该病毒的结合抑制高达95%（数据未显示）。当纯化的sCAR蛋白固定在聚苯乙烯孔中，然后用^三H标记的Ad病毒。用F5K蛋白预孵育微孔后，几乎未发现病毒结合（数据未显示）。这些结果证实，受试病毒均使用CAR蛋白作为细胞纤维受体。

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图5

Ad与CHO-CAR细胞结合的定性分析。大约10⁶CHO-CAR细胞，或与F5K蛋白以5μg/ml预孵育的CHO-CAR细胞，在4°C下与放射性标记的Ad血清型孵育1小时。清洗细胞，将颗粒重新悬浮在100μl PBS中，并通过闪烁计数测定结合病毒。开条表示病毒与标准化为1的CHO细胞的结合（3次检测的平均值±6%）。阴影条表示与CHO-CAR细胞的结合（与CHO结合的倍数增加）。实心条表示与F5K蛋白预孵育后与CHO-CAR细胞结合（与CHO结合的倍数增加）。测量的计数（单位：cpm）如下：Ad12，323，5021，865；Ad21944、10299、1500；广告9、50、320、210；广告4、293、4772、1135；Ad41、255、8567、1158。

讨论

CAR蛋白最近被鉴定为C亚群病毒Ad2和Ad5以及柯萨奇B病毒的细胞纤维受体(4,49). 在这项研究中，我们已经证明至少有七种以上的Ad血清型可以将CAR用作细胞纤维受体：Ad12和Ad31（a亚组）；Ad9、Ad15和Ad19（D亚组）；Ad4（E亚组）；和Ad41（子组F）。我们的结果证实了先前的观察结果，即Ad2纤维可以阻断Ad12与A549和HeLa细胞的结合(2)Ad12光纤旋钮可以阻挡Ad2。可溶性CAR与Ad12和Ad31结合的事实并不奇怪，因为这些血清型的纤维球在氨基酸水平上有81%的相似性（表​（表11).

根据之前的研究，似乎Ad9（D亚组）使用与Ad2相同的细胞纤维受体(38). 对Ad8、Ad9、Ad15和Ad19的纤维旋钮序列进行比较后发现，相似性得分较高，从F15K和F19K的59%到F9K和F119K的85%，再到F8K和F9K的95%（表​（表1）。1). 因此，sCAR与印迹的Ad15和Ad19病毒结合也就不足为奇了（图。​（图11和数据未显示）。鉴于Ad8和Ad9光纤旋钮序列之间的高度相似性，我们预计Ad8也将绑定到CAR。

据推测，E亚群Ad4中唯一的血清型是混合基因型的Ad，因为病毒基因组的E1、E2和E3区域与B亚群病毒中典型的序列同源，而纤维基因和E4可能来自C亚群病毒(三,15). Ad2和Ad4光纤旋钮序列相似64%（表​（表1），1)毫不奇怪，两者都识别相同的细胞纤维受体。

F亚群血清型Ad41已被证明包含两个不同的纤维基因；一个编码由22个β重复序列组成的纤维轴，每个重复序列包含15个氨基酸，另一个编码有12个β重复片段，每个重复片段包含15个胺基酸(48,57); 这些光纤分别被称为长轴（41L）和短轴（41S）光纤。我们已经证明，纤维41L将CAR识别为细胞纤维受体蛋白。纯化纤维41S旋钮蛋白的竞争实验未能抑制^三H标记的Ad41到A549细胞，表明F41L作为该血清型的附着蛋白发挥作用（表​（表2）。2). F亚群还有一种血清型Ad40，也被证明含有长轴蛋白和短轴纤维蛋白(24). Ad40和Ad41长纤维的旋钮在氨基酸水平上显示97%的相似性(26,48). 因此，长轴Ad40纤维也很可能用作附着蛋白。

有趣的是，F2K和F41LK的整体序列相似性仅为29%，仍然导致识别和结合CAR作为细胞纤维受体（表​（表1）。1). 然而，在这种相似性水平上，保守氨基酸仍有可能在纤维-受体相互作用中发挥作用，可能会因基于不同纤维球之间保守的结构二级和三级特征的相互作用而增强，例如环、β-表(56)裂缝或峡谷。已发现许多蛋白质识别位点(23)，保守的氨基酸和结构可以共同提供纤维和CAR蛋白之间的多次接触，导致病毒附着在细胞上。这些接触点在众多的CAR纤维对之间可能不同，不同纤维对CAR蛋白的相对亲和力也可能不同。

我们的结果进一步表明，F41S旋钮蛋白对其亲本病毒Ad41或任何其他测试病毒与CAR蛋白的细胞粘附没有影响。对于短轴光纤的可能功能，可以提出几个假设。已经证明，对于Ad40，病毒粒子戊糖碱蛋白与短轴或长轴纤维结合，这两种结合都可能发生在单个病毒粒子上(24). Ad40和Ad41戊糖碱蛋白都缺乏RGD序列(31,48)，通过α促进Ad颗粒的内化_v（v）-整合素(55). 短轴纤维可能通过与α受体以外的受体相互作用来促进内化_v（v）-整合素。评估这一假设的实验正在进行中。

短轴Ad40和Ad41光纤与长轴光纤的关系几乎与不同子组的光纤无关(24,34,48). F亚群肠道病毒仅包含两种血清型，尽管根据DNA限制模式已鉴定出至少176株病毒(24,26,48). 对纤维DNA和蛋白质序列异质性的研究导致了这样一种假设，即Ad40和Ad41的长轴纤维非常相似，足以以某种频率发生基因重组(26,31,48). 据推测，41S光纤是从Ad5光纤演变而来的(24)，可能已经失去了将CAR识别为细胞纤维受体的能力。因此，41S纤维可能是一种天然的（如果是多余的）纤维突变体。

我们的发现是，许多Ad血清型的纤维能够将CAR蛋白用作细胞受体，但这并不排除这些病毒识别或使用除CAR以外的受体的可能性。在这方面，已经鉴定出一种类似MHC I类α2结构域的拟态(20)作为潜在的细胞纤维结合位点。一种合成的MHC-Iα2同源物，尽管与人类CAR蛋白胞外结构域的序列完全不同(4,49)据报道，其对Ad5与HeLa细胞的结合具有净中和作用(20).

过去，Ads是根据其与13个不同物种的红细胞的血凝（HA）特性进行分类的(18,40). D亚群又被进一步分为强凝集人和大鼠红细胞的DI病毒（Ad9和Ad19）、强凝集大鼠红血球的DII病毒（Ad15和Ad22）和不凝集任何红细胞的DIII病毒(12,18,40). 亚组C和E病毒Ad2、Ad5和Ad4在大鼠红细胞中表现出弱HA，而亚组A病毒几乎没有HA(18). 我们测试的Ad血清型显示出广泛差异的HA活性，但仍将CAR识别为细胞纤维受体。表达CAR蛋白的人红细胞与抗CAR抗体孵育可抑制亚群DI病毒Ad8和Ad9的血凝作用(5a级). 综上所述，这些观察结果表明，识别CAR和凝集红细胞的能力是不同但可能重叠的纤维蛋白的特性。

属于A、C、D、E和F亚群的病毒都结合相同的细胞纤维受体CAR，但它们会导致不同的疾病模式。因此，纤维-受体相互作用不太可能是病毒组织嗜性的唯一决定因素(33,50,51). 观察到的亚组向性差异可能会受到几个与附着相关的因素的显著影响，如纤维轴的长度和戊糖基的受体特异性（图。​（图6）。6). 纤维蛋白的轴长度在23到6个β-重复序列之间变化(8). 纤维轴长度的差异会影响戊糖基在粘合中的作用，如之前Ad9所示(38)以及戊糖碱受体特异性的差异(53). 当考虑到这些差异时，这些亚组可以分为具有含有RGD的戊子的长CAR再识别纤维（亚组A和C）或RGD-减去戊子的纤维（子组F，以及短的非CAR识别纤维和含有RGD的戊子（B亚组）（图。​（图6）。6). 因此，我们认为光纤轴长度是Ad连接策略的主要决定因素。只要纤维轴中β-重复序列的数量保持在临界值以上，病毒就会将其纤维专门用于附着，然后由α内化_v（v）-整合素(55). 在这方面，值得关注的是血清型Ad4（E亚组），其纤维具有12个β-重复序列，仅通过纤维蛋白与A549细胞结合（数据未显示）。低于临界值的任何数量的纤维轴β-重复将导致病毒结合策略，该策略包括不同程度地结合CAR和直接结合α_v（v）-整合素。这种结合策略可能是短轴病毒（如D亚群和B亚群）向性的一个促成因素。

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图6

基于纤维轴长度、纤维受体识别和戊聚糖碱基受体识别的Ad嗜性模型。识别CAR的五个Ad亚群的血清型具有不同的纤维轴长度，并与具有RGD序列的戊糖基复合，尽管戊糖基可能在没有RGD序列（Ad40和Ad41）的情况下出现。亚组A和C到F的纤维能够识别CAR蛋白作为细胞纤维受体。这些血清型的纤维轴中β-重复序列的数量从23（Ad12）到8（Ad9）不等。一旦β-重复序列的数量下降到8，通过戊糖基RGD环与细胞α_v（v）-整合素。纤维41短和纤维3的细胞纤维受体仍未确定。

血清型Ad40和Ad41（F亚组）是具有长轴CAR识别纤维的病毒，其戊糖基蛋白中缺乏RGD序列(31,48). 除了α_v（v）-整合素，通过使用尚未确定的结合位点。对这些肠道广告的几项体外研究表明，除了附着和内化外，Ad-tropilism还受许多在细胞、转录和翻译水平上起作用的因素控制(21,22,48,50). 然而，这在体内可能会大不相同(31). 阐明Ad向性的细胞外和细胞内机制将对Ads的分子生物学以及基于Ad的载体在人类基因治疗中的应用产生重大影响。

鸣谢

参考文献