《维罗尔杂志》。1998年10月；72（10）：7900–7908。
TRAF结合位点和NF-κB活化在EB病毒潜伏膜蛋白1诱导细胞基因表达中的作用
,1,2 ,2 ,2 ,2 ,三和2,*
奥迪尔·德弗根
法国克拉玛特92140，INSERM U131和巴黎南部细胞因子研究所1; 哈佛医学院和马萨诸塞州波士顿布里格姆女子医院微生物和分子遗传学与医学系2；和加州圣地亚哥La Jolla过敏与免疫学研究所三
埃伦·卡希尔·麦克法兰
法国克拉玛特92140，INSERM U131和巴黎南部细胞因子研究所1; 哈佛医学院和马萨诸塞州波士顿布里格姆女子医院微生物和分子遗传学与医学系2；和加州圣地亚哥La Jolla过敏与免疫学研究所三
乔治·莫西亚洛斯
法国克拉玛特92140，INSERM U131和巴黎南部细胞因子研究所1; 哈佛医学院和马萨诸塞州波士顿布里格姆女子医院微生物和分子遗传学与医学系2；和加州圣地亚哥La Jolla过敏与免疫学研究所三
肯尼思·伊祖米
法国克拉玛特92140，INSERM U131和巴黎南部细胞因子研究所1; 哈佛医学院和马萨诸塞州波士顿布里格姆女子医院微生物和分子遗传学与医学系2；和加州圣地亚哥La Jolla过敏与免疫学研究所三
卡尔·F·瓦尔
法国克拉玛特92140，INSERM U131和巴黎南部细胞因子研究所1; 哈佛医学院和马萨诸塞州波士顿布里格姆女子医院微生物和分子遗传学与医学系2；和加州圣地亚哥La Jolla过敏与免疫学研究所三
埃利奥特·基夫
法国克拉玛特92140，INSERM U131和巴黎南部细胞因子研究所1; 哈佛医学院微生物系、分子遗传学系和医学系以及马萨诸塞州波士顿布莱根妇女医院2；和加州圣地亚哥La Jolla过敏与免疫学研究所三
法国克拉玛特92140，INSERM U131和巴黎南部细胞因子研究所1; 哈佛医学院和马萨诸塞州波士顿布里格姆女子医院微生物和分子遗传学与医学系2；和加利福尼亚州圣地亚哥拉霍亚过敏和免疫学研究所三
1998年4月23日收到；1998年7月6日接受。
摘要
在本研究中，我们研究了EB病毒潜伏膜蛋白1（LMP1）对细胞基因表达的诱导作用。此前，研究表明LMP1可诱导EBV阴性Burkitt淋巴瘤（BL）细胞中ICAM-1、LFA-3、CD40和EBI3的表达以及上皮细胞中表皮生长因子受体（EGF-R）的表达。我们现在发现LMP1的表达也增加了BL细胞中的Fas和肿瘤坏死因子受体相关因子1（TRAF1）。LMP1通过位于其C末端细胞质尾部的两个独立结构域介导NF-κB活化，这是一个TRAF相互作用位点，通过PXQXT/S核心基序和TRADD相互作用位点与TRAF1、-2、-3和-5相关。在EBV转化的B细胞或瞬时转染的BL细胞中，大量TRAF1、-2、-3和-5与LMP1相关。在上皮细胞中，TRAF1很少表达，只有TRAF2、-3和-5与LMP1显著复合。利用LMP1突变体研究了TRAF与PXQXT/S基序结合在LMP1介导的基因诱导中的重要性，该突变体在该基序中含有丙氨酸点突变，并且与TRAF没有关联。该突变体LMP1（P204A/Q206A）诱导了60%的野生型LMP1 NF-κB活化，并对Fas具有约60%的野生类型LMP1效应，ICAM-1、CD40和LFA-3诱导。相反，在TRAF1、EBI3和EGF-R诱导中，LMP1（P204A/Q206A）的受损程度更大。因此，TRAF与PXQXT/S基序的结合在上调Fas、ICAM-1、CD40和LFA-3表达中具有非必要作用，在上调TRAF1、EBI3和EGF-R表达中具有关键作用。此外，D1 LMP1（一种不聚集的LMP1突变体）未能诱导TRAF1、EBI3、Fas、ICAM-1、CD40和LFA-3表达，证实了聚集在LMP1信号传导中的重要作用。显性形式IκBα的过度表达阻断了LMP1介导的TRAF1、EBI3、Fas、ICAM-1、CD40和LFA-3上调，表明NF-κB是从TRAF-和TRADD相互作用位点诱导LMP1基因的重要组成部分。
体外静止的人B淋巴细胞感染EB病毒（EBV）可导致细胞持续增殖并转化为淋巴母细胞系（LCL）。这些潜在感染细胞表达几种EBV编码的核蛋白和膜蛋白（参考文献综述36). EBV潜伏膜蛋白1（LMP1）在EBV诱导的B细胞转化中起着关键作用。LMP1在啮齿动物成纤维细胞系中具有转化特性(2,57)并且对EBV转化B细胞的能力至关重要，正如重组EBV的遗传分析所证明的那样(32). LMP1也在大多数EBV相关恶性肿瘤中表达，包括淋巴增生性疾病、霍奇金病和鼻咽癌（参考文献综述50).
越来越多的证据支持LMP1模拟组成性激活的肿瘤坏死因子受体（TNFR）的模型。LMP1在细胞中与TNFR家族的细胞质信号分子、TNFR-associated factor 1（TRAF1）、TRAF2和TRAF3以及TNFR-assessited death domain protein TRADD（图。)(5,10,31,34,46,52). 在B淋巴细胞中，LMP1的表达诱导的效应与TNFR家族成员CD40交联后观察到的效应相似。这些影响包括细胞表面标记物和粘附分子的表达增加以及NF-κB的激活(三,26,36,40,45,58,59). LMP1在诱导应激活化蛋白激酶和对B细胞生长的影响方面也类似于CD40(13,16,19,37,38).
LMP1的示意图。LMP1由一个23个氨基酸的N-末端细胞质结构域、六个通过短反向圈分离的疏水性跨膜结构域和一个200个氨基酸的CTD组成。LMP1 aa 187至231（CTAR1/TES1）和aa 352至386（CTAR2/TES2）这两个信令域由空框表示；TRAF结合位点的核心aa 201到210由一个黑框表示。指示与TRAF或TRADD结合直接相关的残留物。标记有星号的残基在LMP1（P204A/Q206A）突变体中突变为丙氨酸。D1-LMP1包括最后两个跨膜结构域和CTD，即LMP1-aa 129至386。
质膜上的LMP1聚集对于信号传递和B淋巴细胞生长转化至关重要(15,16,19,26,29,32,42,58). LMP1构成信号，因为六个跨膜结构域（图。)使配体依赖，在质膜中持续聚集。作为LMP1聚集的结果，TRAF和TRADD与LMP1羧基末端细胞质结构域（CTD）构成关联(10,31). 与LMP1相反，TNFRs与TRAF或TRADD相关，以响应配体结合(25,39,53,55).
23个氨基酸末端细胞质氨基酸（aa）的重要功能似乎是定位第一个跨膜结构域(29)，200-aa CTD的两个区域对NF-κB活化和B淋巴细胞生长转化至关重要（图。). 由细胞质尾部的膜近端45个残基组成的区域（aa 187至231）介导不到30%的LMP1诱导的NF-κB活化，其功能名称为CTAR1（羧基末端活化区1）(26,45). 该结构域对于初始B淋巴细胞转化既必要又充分，并且被指定为TES1（转化效应位点1）(30,33,35). CTAR1/TES1介导LMP1与TRAF的关联(10). 在LCL中，至少50%的TRAF3或TRAF1与该站点相关，而TRAF2的相关程度较小。在TRAF相互作用中重要的LMP1 PXQXT/S核心基序内的点突变减少CTAR1/TES1诱导的NF-κB(10). 我们以前的研究表明，TRAF2或TRAF1-TRAF2异二聚体通过CTAR1/TES1介导NF-κB活化，而TRAF3可能通过取代LMP1 CTD中的TRAF1和TRAF2发挥负调节剂的作用(10,34).
LMP1 CTD的远端区域包括aa 352至386和指定的CTAR2/TES2，是主要的NF-κB诱导域(15,26,45)并介导LMP1与TRADD的关联(31). 未能与TRADD相互作用的LMP1 CTAR2/TES2双点突变在NF-κB活化和B淋巴细胞转化中有缺陷，而NF-κ的活化野生型的第二个CTAR2/TEM2双点突变也是B淋巴细胞转化的野生型(31).
尽管CTAR1/TES1和CTAR2/TES2都激活NF-κB，但它们在功能上并不等同。CTAR1/TES1在上皮细胞中是NF-κB的弱激活剂，但足以进行初始转化，而CTAR2/TES2是NF-kb B的强激活剂，目前发现在没有CTAR1/TES1的情况下不足以进行转化(30). 这两个结构域均可诱导C33A上皮细胞中A20的表达，但只有CTAR1/TES1才能诱导这些细胞中表皮生长因子受体（EGF-R）的表达(44). 因此，CTAR1/TES1对基因诱导的影响与CTAR2/TES2不同。本研究旨在研究TRAF与CTAR1/TES1结合在LMP1介导的细胞基因诱导中的特殊作用。
材料和方法
质粒。
通过插入一个生态pSG5 LMP1和pSG5 LMP1的RI片段（P204A/Q206A）(10)分别位于生态pcDNA3（Invitrogen）的RI位点。基于pcDNA3的表达载体使用巨细胞病毒（CMV）即时早期启动子/增强子，基于pSG5的表达载体则使用猴病毒40（SV40）早期启动子。带有丝氨酸32和36突变为丙氨酸的标记IκBα表达载体pCMV4 IκBαS32AS36A由D.W.Ballard（范德比尔特大学）提供(6). 绿色荧光蛋白（GFP）表达载体pEGFP-C1来自Clontech。
细胞系和转染。
IB4是EBV转化的LCL。BJAB和BL41是EBV阴性的Burkitt淋巴瘤（BL）细胞系。C33A是来源于人类宫颈癌的上皮细胞系。293是人胚胎肾细胞系。细胞系在添加10%胎牛血清的RPMI 1640（B细胞系）或Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（293和C33A）中生长。对于瞬时表达式，4×106到107用Bio-Rad电穿孔器在200 V（C33A）、210 V（BJAB）或220 V（BL41）和960μF的室温下，在400μl含有10%胎牛血清（R10）的RPMI 1640培养基中电穿孔转染细胞，并培养16至24小时。C33A细胞的转染效率为20至40%，BJAB细胞的转导效率为40至70%，以及通过与GFP表达载体的共转染和荧光激活细胞分选（FACS）分析评估的BL41细胞的约5%。在一些实验中，BL41细胞用BTX电穿孔器在400μl冰镇R10中以200 V的一个脉冲电穿孔65 ms，然后放置在冰上5 min，然后在37°C的R10中培养。在这些条件下，多达15%的BL41细胞可以被转染。为了建立稳定表达LMP1或LMP1（P204A/Q206A）的BJAB或C33A细胞，用pcLMP1、pcLMP1（P204A/Q206A）或pcDNA3载体对照电穿孔细胞，并在电穿孔后2天在补充有3（BJAB）或1（C33A）mg Geneticin（Gibco-BRL）/ml的完全培养基中选择。将转染的BJAB接种在96孔板中，免疫印迹法筛选G418-耐药细胞。通过限制稀释法克隆表达LMP1的BJAB细胞。单独挑选肉眼可见的耐药C33A菌落并进行扩增以进行免疫印迹分析。
免疫沉淀和免疫印迹。
将转染后16至18小时获得的LCL或转染细胞在磷酸盐缓冲盐水中洗涤，并在含有蛋白酶抑制剂（1 mM苯甲基磺酰氟、胃蛋白酶抑制素[1μg/ml]、亮氨酸[1μg/ml]）的0.5%Nonide P-40（NP-40）裂解缓冲液（50 mM Tris[PH7.4]、150 mM NaCl、3%甘油、1.5 mM EDTA）中冰上裂解30分钟。LCL裂解物通过Dounce均质制备。细胞裂解物在14000×克并用蛋白G-Sepharose珠（Pharmacia）预处理1至2 h。将清除的裂解产物与反Flag M2亲和凝胶（国际生物技术公司）在4°C下孵育2 h。然后用1 ml 0.5%NP-40裂解缓冲液清洗珠子五次，并通过在十二烷基硫酸钠（SDS）样品缓冲液中煮沸回收结合蛋白。洗脱后的蛋白质通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离，并转移到硝酸纤维素膜上进行免疫印迹。TRAFs和EGF-R用识别TRAF1（H-132或S-19）、TRAF2（C-20）、TRAF3（H-122）、TRAF 5（H-257）、TRAF-6（H-274）或EGF-R（1005）的兔多克隆抗血清检测，或用识别TRAF4（N-16）、TRAF5（C-19）或TRAF6（C-20。在免疫沉淀实验中发现TRAF5抗体H-257也检测到TRAF3，但在免疫印迹试验中未检测到。用亲和纯化的EBI3兔血清检测EBI3(9). 分别用辣根过氧化物酶结合蛋白A（1:7500稀释；Amersham）或辣根过氧化物糖结合驴抗羊抗体（1:5000稀释Tris缓冲盐水–0.5%牛奶；Santa Cruz Biotechnology）检测兔子或山羊抗体的结合。用抗LMP1单克隆抗体S12检测野生型和突变型LMP1，然后用与辣根过氧化物酶（1:5000稀释；Amersham）结合的羊抗鼠抗体检测。使用抗Flag单克隆抗体M2或M5（国际生物技术公司）检测标记蛋白。
细胞表面免疫荧光和FACS分析。
用双色FACS分析转染细胞的细胞表面免疫荧光。电池（5×106用野生型或突变型LMP1表达载体以及3μg GFP报告质粒电穿孔；转染后16至24小时，细胞（106在补充有0.2%胎牛血清和0.01%叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水中洗涤，然后与藻红蛋白（PE）结合的单克隆抗体CD40-PE（Serotec）、CD54（ICAM-1）-PE（Pharmingen）、CD58（LFA-3）-PE。然后用Cellquest软件在FACScan或FACScalibur流式细胞仪（Becton Dickinson）上对细胞进行清洗和分析。活细胞通过正向和侧向散射进行门控。转染的（GFP阳性）细胞被进一步选通（绿色荧光；FL1），这些细胞的表面表达被检测为红色荧光（FL2）。至少分析了5000个GFP阳性细胞。
NF-κB分析。
用来自主要组织相容性复合体I类启动子的三个NF-κB结合位点驱动的350ng荧光素酶报告子转染293细胞(45)使用Superfect（Qiagen），350 ng pGK-β-半乳糖苷酶和375 ng基于pcDNA3的表达质粒。转染前一天，293个细胞（5×105每孔）在6孔板中，在2ml培养基中进行电镀。转染前，立即取出1 ml培养基。将15微升Superfect添加到150微升DMEM稀释的DNA中，并使复合物形成10分钟。将Superfect-DNA复合物滴加到细胞中。培养3-4小时后，用1毫升培养基替换转染培养基。在向培养物中加入Superfect DNA后20至24小时收获细胞。转染分两次进行，并将细胞合并以进行后续分析。按照制造商的指示，使用一半的细胞测定荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性（分别为Promega和Tropix）；另一半在裂解缓冲液（1%NP-40，1%脱氧胆酸盐，50 mM Tris[pH7.5]，150 mM NaCl，1 mM EDTA，400μM Na）中进行裂解三VO（旁白）4，1 mM NaF，每毫升20μg抑肽酶，1 mM-苯甲基磺酰氟。通过离心法去除不溶物，并使用比钦酸蛋白质分析试剂（Pierce）进行蛋白质测定。用抗LMP1单克隆抗体S12进行蛋白质印迹分析。
结果
LMP1（P204A/Q206A）在TRAF相关性中显著受损，但诱导60%的野生型LMP1 NF-κB活化。
先前的研究发现，在CTAR1/TES1的背景下，PXQXT/S基序中P204或Q206突变为丙氨酸（图。)废除TRAF2结合，减少TRAF1结合，但对TRAF3结合几乎没有影响。带有P204A或Q206A的LMP1（1–231）突变体的NF-κB活化显著受损，但仍保留10%至15%的LMP1-κB活化(10). 为了构建TRAF结合和CTAR1/TES1信号的假定零突变，将P204和Q206突变为全长LMP1内的丙氨酸，以产生LMP1（P204A/Q206A）。LMP1（P204A/Q206A）在EBV阴性BL细胞系（BJAB）的细胞内定位与野生型LMP1相似（数据未显示）。LMP1（P204A/Q206A）几乎与野生型LMP1一样稳定。通常，不需要超过两倍的LMP1（P204A/Q206A）表达载体就可以实现与野生型LMP1相同的蛋白表达，如Western blotting所评估的那样（数据未显示）。然而，双点突变对TRAFs与LMP1结合的能力有着深远的影响。虽然大量内源性TRAF1、TRAF2和TRAF3与来自瞬时转染BJAB细胞的野生型标记的LMP1（Flag-LMP1）共免疫沉淀，但TRAF1和TRAF2没有与Flag-LMP1（P204A/Q206A）共免疫沉降，只有与Flag-MP1（P204A/Q206A。A、 左侧，第5和第6车道）。尽管CTAR2/TES2通过TRADD-TRAF2相互作用介导NF-κB活化(31)在所用的实验条件下，在Flag-LMP1（P204A/Q206A）免疫沉淀中未检测到与CTAR2/TES2结合的TRAF2。
P204A/Q206A突变对TRAF与LMP1结合的影响。（A） BJAB细胞（107每次转染）或C33A细胞（4×106用20μg表达Flag-LMP1（F-LMP1）的质粒pSG5电穿孔(10)，20（左）或30（右）μg pSG5 Flag-LMP1（P204A/Q206A）（F-LMP PQAA）(10)，或20μg pSG5 EBI3-Flag（EBI3-F）(9)作为控件。转染后18小时，在0.5%NP-40裂解缓冲液中裂解细胞，并将细胞提取物提交给带有抗病毒亲和凝胶的免疫沉淀（IP）。用SDS-PAGE在8%凝胶上分析免疫沉淀前获得的一部分细胞裂解物（左，1至3道；右，2至4道）和总免疫沉淀物（左、4至6道；右、5至7道），并用识别TRAF1（S-19或H-132）、TRAF2（C-20）、，或TRAF3（H-122）、抗标记抗体M5（左）或抗LMP1单克隆抗体S12（右）。LMP1和LMP1（P204A/Q206A）在这里使用的提取条件下显示出相似的溶解性，使得在细胞裂解物部分中观察到的LMP1蛋白的量代表整个LMP1蛋白含量（数据未显示）。5×10细胞提取物5IB4细胞被用作TRAF1检测的对照（右侧，车道1）。显示TRAF1双绞线和TRAF2、TRAF3和LMP1的位置。（B） 80×10 NP-40细胞提取物6将来自表达N-末端Flag标记的LMP1蛋白的重组LCL（F-LMP1）或来自表达非Flag标记的LMP1的对照IB4-LCL（LMP1）的细胞用M2抗Flag亲和凝胶进行免疫沉淀。免疫沉淀之前（输入；第1和第2道）或之后（未结合；第3和第4道）获得的细胞裂解物的一部分，或未溶解部分（未溶解；第5和第6道）的一部分以及总免疫沉淀（第7和第8道）在10%凝胶上通过SDS-PAGE进行分析，并使用识别TRAF2（C-20）、TRAF3（H-122）和TRAF4（N-16）的兔多克隆抗体和识别TRAF5（C-19）的山羊多克隆抗体进行Western blot分析。标记TRAF的位置；免疫球蛋白重链用星号表示。用抗Flag抗体Ms进行Western blot分析表明，50%以上的LMP1被溶解和沉淀（数据未显示）。（C） BJAB细胞（107每次转染）或C33A细胞（5×106以25μg的pSG5 Flag-LMP1（F-LMP1）、35μg的pSG5 Flug-LMP1，P204A/Q206A（F-LMP PQAA）或25μg pSG5 EBI3-Flag（EBI3-F）作为对照，对每一转染）进行电穿孔。转染后18小时，细胞在0.5%NP-40裂解缓冲液中裂解，细胞提取物用抗病毒亲和凝胶进行免疫沉淀。用SDS-PAGE在10%凝胶上分析免疫沉淀物，并用识别TRAF5（H-257）或抗标记抗体M5的兔多克隆抗体进行Western blot分析。显示TRAF5和LMP1的位置。
LMP1（P204A/Q206A）与TRAF的相关性也在C33A上皮细胞系和293肾细胞系中进行了评估。TRAF1在转染C33A细胞的裂解液中未检测到，在293细胞裂解液中几乎未检测到（图。A[右]和数据未显示）。TRAF2和TRAF3与瞬时转染的C33A或293细胞的Flag-LMP1有效共免疫沉淀，但未与Flag-LMP1（P204A/Q206A）共免疫沉淀。在来自上皮细胞的Flag-LMP1免疫沉淀物中很少或没有检测到TRAF1，这与这些细胞中几乎无法检测到的TRAF1水平一致（图。A[右侧，车道6]和数据未显示）。因此，在几乎没有TRAF1的情况下，TRAF2与来自转染C33A和293细胞的野生型LMP1有效地共免疫沉淀。考虑到谷胱甘肽中TRAF2与LMP1 CTD的弱结合，这有点令人惊讶S公司-LCL中TRAF2与LMP1的转移酶结合分析和低水平共免疫沉淀(10).
最近，在体外研究谷胱甘肽S公司-转移酶结合试验表明，TRAF5与CTAR1/TES1结合，但与CTAR2/TES2不结合，而TRAF6与LMP1 CTD没有任何可检测的结合(5,27). 为了研究LMP1在体内是否与TRAF5相关，将LMP1从由编码Flag-LMP1的重组EBV转化的LCL提取物中免疫沉淀(10)通过Western blotting评估相关TRAF5的数量。大量TRAF5与Flag-LMP1共沉淀，但在来自对照非标记LMP1-EBV-转化LCL的Flag免疫沉淀物中未检测到TRAF5信号（图。B、 车道7和8）。TRAF5与LMP1的关联程度小于TRAF3或TRAF1的观察结果（图。B类；比较免疫沉淀前细胞裂解液中TRAF5或TRAF3的数量[第2条车道]与未结合部分[第4条车道]和Flag免疫沉淀[第8条车道]中的TRAF5和TRAF3数量；TRAF1也未显示数据）。在LCL的裂解液或Flag-LMP1免疫沉淀物中未检测到TRAF6（数据未显示）。尽管在LCL提取物中检测到TRAF4，但在Flag免疫沉淀物中未检测到特异性TRAF4信号（图。B） ●●●●。在瞬时转染的BJAB和C33A细胞中也研究了TRAF5与LMP1的关联。在两种细胞系的转染细胞中，内源性TRAF5与Flag-LMP1共同免疫沉淀，但与Flag-RMP1没有免疫沉淀（P204A/Q206A）（图。C） ●●●●。因此，在这里使用的实验条件下，全长LMP1背景下的P204A/Q206A突变消除了TRAF1、TRAF2、TRAF3和TRAF5与LMP1的体内关联。
当LMP1（P204A/Q206A）在293细胞中的表达水平与LMP1相当时，其诱导的NF-κB活化量约为LMP1的60%（图。). 这一结果与先前针对CTAR1/TES1或TRAF结合位点缺失的LMP1突变体的数据一致，该数据表明CTAR1/TES1在NF-κB活化中的活性低于CTAR2/TES2，并且CTAR1/TES1的缺失仅适度降低NF-κB活化(30,45).
通过LMP1和LMP1（P204A/Q206A）在293细胞中诱导NF-κB。293个细胞（5×105)由主要组织相容性复合体I类启动子的三个NF-κB结合位点驱动的350 ng荧光素酶报告子、350 ng pGK-β-半乳糖苷酶和375 ng基于pcDNA的表达质粒转染。数据显示为荧光素酶活性归一化为β-半乳糖苷酶活性，并调整为pcDNA3对照转染细胞的1。293个裂解物的蛋白质含量标准化，并使用抗LMP1单克隆抗体S12通过免疫印迹分析分析LMP1的表达。
LMP1（P204A/Q206A）在稳定转染的C33A细胞中不能诱导EGF-R表达。
LMP1或LMP1（1–231）可以诱导C33A上皮细胞中EGF-R的表达，而缺失aa 187至351的LMP1则不能，这与TRAF结合位点（LMP1 aa 199至210）介导EGF-R诱导的观点相一致(44). 为了更准确地评估TRAF信号通路在EGF-R诱导中的参与，用野生型LMP1或LMP1（P204A/Q206A）稳定转染C33A细胞，并通过免疫印迹法检测EGF-R的诱导（图。). 虽然6个pcDNA3载体对照转染克隆缺乏EGF-R表达，但在转染pcDNA3-LMP1表达载体的所有5个C33A克隆中均检测到EGF-R的表达。这些克隆中EGF-R的表达水平不同（图。[车道3、4、9和10]以及未显示的数据）。相比之下，转染pcDNA3-LMP1（P204A/Q206A）表达载体的10个C33A细胞克隆中有8个未能表达EGF-R，另外两个克隆几乎没有检测到EGF-R表达（图。[车道5、6、11和12]以及未显示的数据）。LMP1（P204A/Q206A）诱导C33A细胞EGF-R表达的失败并不是因为LMP1的表达降低。通过免疫印迹，LMP1（P204A/Q206A）的表达水平与野生型LMP1相似或更高（图。和数据未显示）。因此，这些数据更准确地将C33A细胞中EGF-R表达的LMP1诱导与TRAF介导的信号联系起来。
P204A/Q206A突变对C33A细胞EGF-R诱导的影响。稳定转染pcDNA3（载体；1、2、7和8巷）、表达野生型LMP1（WT；3、4、9和10巷）或LMP1的四个独立C33A克隆的全细胞提取物（P204A/Q206A）（PQAA；5、6、11和12巷）用识别EGF-R的兔多克隆抗体或抗LMP1单克隆抗体S12进行免疫印迹。左边的数字显示标准分子量蛋白质的位置（单位：千）。用EGF-R抗体观察到的120-kDa交叉反应蛋白的强度与Ponceau染色的强度相似，表明了总蛋白负载量。由于通道4中LMP1蛋白的含量非常低，与右侧显示的斑点相比，左侧显示的S12斑点过度暴露。选择40天后进行免疫印迹分析。
LMP1介导的BL细胞TRAF1和EBI3表达的有效诱导依赖于TRAF与CTAR1/TES1内PXQXT/S基序的结合。
TRAF1在大多数组织中不表达，并且由EBV感染在B淋巴细胞中诱导(46). 我们注意到，用LMP1表达载体瞬时或稳定转染BJAB或BL41 BL细胞可特异性诱导TRAF1表达。用SV40启动子驱动的pSG5 LMP1表达载体瞬时转染BJAB细胞，与pSG5载体控制转染细胞中观察到的低水平相比，TRAF1表达增加（图。A、 车道1至4）。同样，在金属硫蛋白或CMV启动子的控制下，BJAB细胞中LMP1的稳定表达导致TRAF1的表达水平更高（图。B、 车道2、6和7）。LMP1诱导的TRAF1表达水平与EBV转化的B淋巴细胞中观察到的水平相似（图。B类；将车道2、6和7中的TRAF1信号与车道3中IB4 LCL中的TRAF1信号进行比较）。相反，尽管LMP1和LMP1（P204A/Q206A）的表达水平相似，但LMP1（P204A/Q206A）在BJAB细胞中的稳定表达并没有改变TRAF1的表达（图。B、 车道8和9）。BJAB细胞中LMP1（P204A/Q206A）的瞬时表达通常也不会导致TRAF1表达的显著增加（图。A、 车道5至7）。CTAR1/TES1缺失的LMP1突变体的高水平LMP1（P204A/Q206A）瞬时表达或瞬时表达（标记LMP1Δ187-351[31])在一些实验中弱诱导TRAF1表达（数据未显示）。TRAF1诱导是细胞类型特异性的，因为在C33A细胞中瞬时或稳定的LMP1表达，或在293细胞中瞬时LMP1的表达，都没有引起可检测到的TRAF1表达增加（图。A、 右侧，数据未显示）。
转染BJAB细胞中LMP1突变体诱导TRAF1和EBI3的免疫印迹分析。（A） BJAB细胞（107每次转染）瞬时转染表达野生型LMP1（WT）或LMP1的pSG5载体（P204A/Q206A）或表达D1 LMP1(42). 细胞提取物（106每个泳道的细胞）用识别TRAF1的兔多克隆抗体（h-132）、用亲和纯化的兔多克隆抗EBI3抗体或用抗LMP1单克隆抗体S12进行免疫印迹。LMP1及其衍生物、TRAF1倍体和EBI3的位置显示在右侧。左边的数字显示标准分子量蛋白质的位置（单位：千）。Ponceau S印迹染色显示每条泳道的总蛋白负荷相等（数据未显示）。较高量的D1 LMP1表达并未导致TRAF1的显著诱导（数据未显示）。（B） 细胞提取物（106来自稳定表达野生型LMP1或LMP1（P204A/Q206A）的独立BJAB克隆的每车道细胞）通过免疫印迹分析TRAF1和EBI3的表达，如上所述。在金属硫蛋白启动子的控制下，BJ-MTLMP（通道1和2）是稳定转染的表达（+）或不表达（−）LMP1的BJAB细胞系(59); 通道4和5包含两个pcDNA3矢量控制衍生的BJAB克隆；在CMV启动子的控制下，BJ pcLMP（第6和第7道）和BJpcLMP PQAA（第8和第9道）分别稳定表达野生型LMP1和LMP1（P204A/Q206A）。IB4（车道3）是EBV改造的LCL。LMP1、TRAF1双绞线和EBI3的位置显示在右侧。左边的数字显示标准分子量蛋白质的位置（单位：千）。Ponceau S印迹染色显示每条泳道的总蛋白负荷相等（数据未显示）。
LMP1诱导TRAF1需要LMP1的细胞质尾部聚集。D1 LMP1的瞬时表达（最后两个跨膜结构域和CTD，aa 129至386；[图。])在BJAB细胞中未能诱导TRAF1表达（图。A、 车道8）。D1 LMP1不聚集在质膜中，但在细胞质膜中呈弥散分布(42). 与BJAB细胞中的这些结果类似，LMP1能够在瞬时转染的BL41细胞中诱导TRAF1表达，但LMP1（P204A/Q206A）和D1 LMP1无法诱导TRAF1的表达（数据未显示）。
在BJAB、BL41或Louckes BL细胞系中稳定的LMP1表达诱导EBI3的表达，EBI3是一种EBV诱导的白细胞介素-12 p40同源细胞因子，与白细胞介素-12 p35相关，形成异二聚体细胞因子(9,11). 虽然在BJAB细胞中瞬时或稳定的LMP1表达上调了免疫印迹上检测到的EBI3表达，但瞬时或稳定的LMP1（P204A/Q206A）和瞬时D1表达没有上调（图。和数据未显示）。LMP1（P204A/Q206A）的高水平表达诱导很少或没有EBI3（数据未显示）。然而，正如TRAF1观察到的那样，用标记的LMP1Δ187–351瞬时转染BJAB细胞后，可以观察到微弱的EBI3诱导（数据未显示）。总之，这些数据表明，LMP1对B淋巴细胞TRAF1和EBI3表达的有效上调依赖于TRAF与CTAR1/TES1的结合。CTAR2/TES2只能诱导低水平TRAF1和EBI3表达。
LMP1上调ICAM-1、Fas、CD40或LFA-3不需要TRAF与CTAR1/TES1结合。
稳定表达LMP1的BL41细胞的CD40、ICAM-1和LFA-3水平高于载体衍生的对照克隆(59). 类似地，LMP1和GFP表达载体在BL41细胞中的瞬时共转染导致GFP阳性细胞上ICAM-1、CD40和LFA-3的表达显著上调（图。). 通过瞬时转染在BL41细胞中观察到的ICAM-1、CD40和LFA-3诱导水平与在四环素调节启动子控制下诱导LMP1表达后在DG75 BL细胞中发现的水平相似(14). 我们现在发现，BL41细胞中短暂或稳定的LMP1表达也会诱导Fas表达（图。和数据未显示）。BJAB细胞组成性地表达高水平的CD40、LFA-3和Fas，并且这些蛋白没有被LMP1表达进一步上调（数据未显示）。然而，LMP1的表达确实上调了BJAB细胞上ICAM-1的表达（数据未显示）。
瞬时转染BL41细胞中野生型和突变型LMP1诱导细胞表面分子的FACS分析。BL41细胞（5×106)单独用pSG5载体或表达野生型LMP1（WT；20μg。转染后22小时，对一部分细胞进行ICAM-1、Fas、CD40和LFA-3细胞表面表达染色，并通过双色FACS分析进行检查，如材料和方法所示；第二部分通过免疫印迹分析LMP1的表达。仅显示GFP阳性细胞的FL2荧光(X轴，荧光强度；y轴，单元格编号）。虚线对应于载体控制转染细胞；粗线代表LMP1或LMP1突变转染细胞。为了量化野生型和突变型LMP1蛋白上调这些标记表面表达的相对效率，设置了一个门限，使5%的载体对照转染细胞的表面标记分析结果为阳性。每个图上的百分比对应于LMP1阳性表达细胞的分数。给出了三个代表性实验中的一个实验的数据。通过抗LMP1单克隆抗体S12的免疫印迹评估，野生型和突变体LMP1蛋白的表达水平相似。
与野生型LMP1相比，D1 LMP1未能在BL41细胞中诱导显著的ICAM-1、Fas、CD40或LFA-3表面表达（图。). LMP1（P204A/Q206A）诱导了所有四个标记，但比野生型LMP1效率低（图。). LMP1、LMP1（P204A/Q206A）和D1 LMP1的表达水平大致相似，通过LMP1免疫印迹法进行评估（数据未显示）。平均而言，LMP1（P204A/Q206A）对ICAM-1上调的野生型LMP1作用为70%(n个=7），62%对Fas上调的影响(n个=6），65%的CD40上调作用(n个=4），以及对LFA-3上调的56%的影响(n个= 5). LMP1和LMP1（P204A/Q206A）也弱诱导Fas表达，如稳定C33A转染体的免疫印迹分析所观察到的（数据未显示）。因此，ICAM-1、Fas、CD40和LFA-3上调并不特别需要TRAF结合到CTAR1/TES1内的PXQXT/S基序，尽管它有助于最大诱导。
LMP1介导的蛋白诱导依赖于NF-κB。
由于LMP1和LMP1突变体诱导ICAM-1、Fas、CD40和LFA-3表面表达的效率与其诱导NF-κB的相对能力相关，NF-κ的B活化可能是这四种细胞表面抗原上调的重要介体。为了更直接地评估NF-κB在LMP1介导的基因诱导中的作用，我们评估了对活化诱导的降解具有抗性的IκBα的显性突变体IκBαS32AS36A的程度(6)，将消除这些LMP1诱导的效应。
用GFP表达载体瞬时共转染BL41细胞，并增加pSG5 LMP1（0、5和15μg）和pCMV4 IκBαS32AS36A（0、3、6和10μg）的数量。用FACS分析ICAM-1、Fas、CD40和LFA-3水平。仅IκBαS32AS36A的表达持续导致BL41细胞上ICAM-1、Fas、CD40和LFA-3表达的极少量下降（图。A和数据未显示）。细胞活力和转染效率不受影响（数据未显示）。用5μg pSG5 LMP1转染BL41细胞可诱导ICAM-1、Fas、CD40和LFA-3水平升高，而15μg的pSG5 LMP1可诱导更高水平（图。A和数据未显示）。随着IκBαS32AS36A数量的增加，共表达导致LMP1诱导ICAM-1、Fas、CD40和LFA-3表面表达的剂量依赖性抑制，当10μg pCMV4 IκBαS32AS16A共转染时，抑制率超过90%（图。A和数据未显示）。在这些条件下，IκBαS32AS36A共表达没有显著影响LMP1水平（图。B） ●●●●。因此，NF-κB活化是LMP1诱导ICAM-1、Fas、CD40和LFA-3表达的重要介质。
IκBαS32AS36A过度表达对LMP1介导的Fas上调的影响。用3μg GFP表达载体转染BL41细胞，转染指定数量（微克）的pSG5 LMP1和pCMV4 IκBαS32AS36A。通过添加载体DNA，转染的DNA总量保持不变。（A） 转染后约20小时，通过双色FACS分析测试一部分细胞的Fas、ICAM-1、CD40和LFA-3表面表达，如图所示。。仅显示Fas的数据。（B） 全细胞裂解物（5×105用抗LMP1单克隆抗体S12通过免疫印迹分析LMP1的表达。
接下来我们评估了NF-κB激活在TRAF1和EBI3诱导中的重要性。仅用1μg pSG5 LMP1转染BJAB细胞可导致显著的TRAF1和EBI3诱导（图。A、 车道2）。相反，用高达15μg的pSG5 LMP1和3至10μg的IκBαS32AS36A表达载体共同转染BJAB细胞，可完全抑制TRAF1或EBI3的诱导（图。A、 车道6至8）。虽然IκBαS32AS36A的共表达降低了LMP1的表达，但LMP1水平高于转染1μg pSG5 LMP1后观察到的水平（图。A、 车道2和6至8）。用FACS平行分析细胞表面ICAM-1的表达。LMP1表达增加伴随着ICAM-1表面表达的剂量依赖性增加。转染3或6μg IκBαS32AS36A表达载体可抑制90%以上的ICAM-1诱导，10μg联合转染可100%抑制ICAM-1的诱导（数据未显示）。
IκBαS32AS36A过度表达对LMP1诱导TRAF1和EBI3的影响。BJAB细胞（5×106每次转染）瞬时转染3μg GFP表达载体和指定数量（微克）的pSG5 LMP1（A）或pcDNA LMP1，以及pCMV4 IκBαS32AS36A。通过添加载体DNA，转染的DNA总量保持不变。细胞提取物（5×105用识别TRAF1（H-132）的兔多克隆抗体、亲和纯化兔多克隆抗EBI3抗体或抗LMP1单克隆抗体S12进行免疫印迹分析。LMP1、TRAF1双绞线和EBI3的位置显示在右侧。
用CMV启动子驱动的LMP1表达载体和pCMV4 IκBαS32AS36A共同转染BJAB细胞对LMP1的表达水平影响较小。然而，IκBαS32AS36A共表达明显抑制LMP1诱导的TRAF1、EBI3或ICAM-1表达（图。B和数据未显示）。因此，NF-κB的激活对LMP1诱导的EBI3和TRAF1的表达也至关重要。
讨论
这些实验证明了LMP1在上调细胞基因表达中的新作用，并评估了TRAF与CTAR1/TES1 PXQXT/S位点和NF-κB活化在LMP1信号传导中的重要性。LMP1诱导Fas表达。LMP1可能因此导致EBV感染的B淋巴细胞显示高水平的Fas，对Fas配体更敏感，并促进凋亡。尽管TRADD与CTAR2/TES2的相互作用本身也可能具有促凋亡作用，但到目前为止，我们还无法证明这种作用。而LMP1的细胞毒性已在包括BALB/c 3T3细胞在内的多个细胞系中得到证实(17)，仅在RHEK-1细胞中观察到LMP1诱导的凋亡(43). 大多数细胞中缺乏净凋亡效应可能是由于LMP1激活NF-κB和上调抗凋亡基因，包括bcl-2基因和A20(20,40). 后一种作用使LMP1能够保护BL细胞免受凋亡(20).
我们现在显示LMP1刺激TRAF1表达。TRAF1与B淋巴细胞中的CTAR1/TES1相互作用，对NF-κB诱导具有协同激活作用(10). 因此，TRAF1上调有助于高水平NF-κB活化，这可能在LMP1的抗凋亡和转化作用中很重要。由于LMP1既有促凋亡作用又有抗凋亡作用，LMP1的净效应可能取决于细胞类型、分化和激活的阶段，以及Fas配体和其他环境因素的存在。
现已证明，大量TRAF5与EBV转化的B细胞中的LMP1构成相关，并且这种关联依赖于CTAR1/TES1中的PXQXT/S基序。由于TRAF2和TRAF5都能激活NF-κB并结合到LMP1上的同一位点，因此TRAF2显性阴性突变形式的过度表达对CTAR1/TES1诱导NF-κ）B的负面影响(34)可能不仅影响TRAF2结合；TRAF5可能也介导来自该位点的NF-κB活化。
LMP1（P204A/Q206A）双点突变几乎完全破坏了LMP1与TRAF关联的能力，并使LMP1效应与TRAF的关联具有更精确的遗传联系。该LMP1突变体在诱导EGF-R、TRAF1和EBI3表达时受损，这与通过CTAR1/TES1聚集TRAF具有独特活性的概念相一致，尽管其具有参与TRADD的能力，但LMP1其余突变体并不容易提供这种活性。相反，LMP1（P204A/Q206A）诱导ICAM-1、Fas、CD40和LFA-3的表达，其水平约为野生型LMP1的60%，这与TRADD结合位点介导的野生型NF-κB活化的60%相关(31). 后面的数据与之前的缺失分析一致，表明CTAR1/TES1和CTAR2/TES2都可以独立地介导不同细胞系中ICAM-1和CD40的诱导，并且两者都是这两种细胞表面分子最佳诱导所必需的(26).
这里描述的结果为TRAF在TNFRs介导的基因诱导中的作用提供了额外的证据。TRAF与CD40介导的基因诱导有关。显性阴性突变体TRAF3或TRAF5的过度表达可阻断CD40介导的CD23诱导(7,28)此外，CD40细胞质尾部PXQXT基序中T-234突变为丙氨酸会破坏TRAF2、TRAF3和TRAF5的结合，并消除或减少CD40介导的B淋巴细胞中ICAM-1、LFA-1、Fas、CD23、B7.1和LT-α的诱导(18,21,23). . 然而，T-234突变为丙氨酸不仅破坏了TRAF结合，也破坏了Jak3结合，因此Jak3可能是CD40对基因诱导的一些作用的原因(18). 来自LMP1或CD40的TRAF信号也与NF-κB介导的上皮细胞白细胞介素-6诱导有关。CTAR1/TES1和CTAR2/TES2都有助于白细胞介素-6的诱导。PXQXT/S基序内的突变或TRAF2或TRAF3显性阴性突变体的过度表达抑制了CTAR1/TES1诱导的白细胞介素-6(12).
尽管CTAR1/TES1和CTAR2/TES2似乎对此处研究的LMP1诱导的基因效应有不同的贡献，但尚不清楚这些不同的效应是如何通过生化途径介导的。CTAR1/TES1和CTAR2/TES2分别通过与TRAF2的直接和间接相互作用激活NF-κB，在这个阶段，它们的作用可能是相似的(31,34). 然而，这里和之前提供的数据(44)支持LMP1-TRAF结合位点在EGF-R、TRAF1和EBI3上调中的独特作用，可能在静止的B淋巴细胞生长转化中发挥作用。CTAR1/TES1的独特作用可能是激活不同的NF-κB/Rel家族成员。我们表明，CTAR1/TES1在体内与TRAF5结合，但TRAF5在下游作用方面似乎与TRAF2相似(1,28,47,54). TRAF2和TRAF5还介导TNFRs的应激激活蛋白激酶激活(41,48,49,54)和LMP1也诱导应激活化蛋白激酶(13,19,37). 最近的研究表明，CTAR1/TES1和CTAR2/TES2可能在这些尚不明确的途径中存在差异(13,37). 或者，CTAR1/TES1在高水平上与TRAF3结合的独特能力可能解释了这种差异。TRAF3与下调NF-κB活性和影响HT29细胞死亡有关(10,51,55)并可能调解其他活动。对TRAF1、EBI3和EGF-R启动子的分析可能有助于确定CTAR1/TES1和CTAR2/TES2之间的功能差异。
与之前使用LCL或B淋巴母细胞的实验相比，这里提供的数据显示TRAF1在LMP1信号传导中的作用有所不同。在这些细胞中，LMP1似乎主要通过TRAF1与TRAF2结合，作为TRAF1-TRAF2异二聚体(10). 此外，在B淋巴细胞中，TRAF1在LMP1的作用下高水平表达，并能与LMP1在NF-κB活化中协同作用(10). 我们现在表明，在上皮细胞中几乎没有TRAF1的情况下，TRAF2可以在高水平上与LMP1结合。因此，CTAR1/TES1通过TRAF2和TRAF5的信号可能对LMP1对上皮细胞生长的影响，包括对鼻咽癌早期病变的影响至关重要。
不可降解的IκBαS32AS36A结构的过度表达取消了我们所研究的所有LMP1介导的蛋白诱导，证实了NF-κB活化在LMP1中介信号传导中的重要作用。NF-κB位点已在Fas启动子和ICAM-1启动子中确定(4,8,56). TNF-α诱导的ICAM-1表达需要ICAM-1启动子中的NF-κB位点(22). NF-κB以前不知道在CD40和LFA-3基因诱导中起作用，该作用可能是间接的，因为计算机搜索结果表明人类CD40和LFA-3启动子没有明显的NF-κ的B位点。
致谢
Dean Ballard提供了IκBαS32AS36A表达载体。David Davidson就BL41电穿孔提供了建议。Fred Wang提供了在金属硫蛋白启动子控制下稳定转染LMP1的BJAB细胞系。
这项工作得到了国家癌症研究所（E.K.）的PHS拨款CA47006以及国家医学研究所（Institute National de la Santéet la Recherche Médicale）和巴黎南大学（O.D.）的支持。E.C.M.得到了NIH培训拨款AI 07061-20的支持。
附录
本文提交后，Miller等人(第44页)据报道，LMP1 PXQXT/S基序的突变损害了LMP1在C33A上皮细胞中诱导EGF-R诱导的能力。
参考文献
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