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《维罗尔杂志》。1998年10月；72(10): 7871–7884.
数字对象标识：10.1128/jvi.72.10.7871-7884.1998年
预防性维修识别码：第10110页
PMID：9733824

人类免疫缺陷病毒2型活病毒的遗传变异豚尾猴疫苗模型

安东尼娅·拉达尔利,1,2 Günter Kraus公司,1,† 安·施密特,三 帕特里夏·巴德尔,1 简·麦克卢尔,4 Shiu-Lok Hu公司,4 威廉·莫顿,三 卡洛·德朱利·莫根,2 Flossie Wong-Staal公司,1和D.鲁尼1,5,*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

用一种感染性的、无致病性的人类免疫缺陷病毒2型（HIV-2）分子克隆（HIV-2）接种了四只小尾猕猴韩国)随后感染了高致病性毒株HIV-2287还有两只幼稚的对照动物。激发后，接种高剂量免疫菌株的两只动物受到保护，免受CD4下降和免疫缺陷的影响。为了研究遗传异质性在保护中的作用环境价值用PCR方法从受攻击动物的外周血单个核细胞DNA和血浆RNA中扩增出该基因，并用异源双链追踪分析（HTA）进行检测和测序。通过HTA，主要在包膜的V1和V2区域检测到变异。HTA评估的病毒DNA克隆的变异程度与接种物大小相关，病毒DNA克隆序列的变异程度也与接种物的大小相关。相反，HTA在受保护动物感染后8周发现血浆病毒RNA变体数量迅速减少；这种减少在幼稚或无保护措施的猕猴中并不存在。研究发现，来自血浆病毒RNA的序列比相应的病毒DNA序列更密切相关，并且保护作用与接种相同HIV-2疫苗的动物血浆RNA序列变异的显著减少相关287非同义突变在受保护动物中的发生率显著降低。除一个克隆外，所有克隆的V2区域中都存在一个额外的潜在糖基化位点，并且在V1和V2区域的病毒DNA和RNA克隆中鉴定出与保护相关的氨基酸特征。对这种HIV-2活病毒疫苗模型中病毒变异的作用的研究可能为免疫发病机制提供有价值的见解。

遗传变异性是开发广泛有效的人类免疫缺陷病毒（HIV）疫苗的主要障碍之一(9,45). 已注意到V3区和细胞毒性淋巴细胞表位的变异介导了宿主免疫逃逸(39,54,55)以及出现以不同细胞取向为特征的病毒表型(10,42,44,48)，增加了复制容量(10,42)和合胞体诱导（SI表型）(41,44)与疾病的快速进展有关。然而，虽然基因型变异可能是由于逃避宿主免疫或病毒复制的固有特性引起的，但很难确定变异在免疫发病机制中的因果作用，因为从血浆中扩增出的病毒序列的异质性的重要性信息相对较少。

这个环境价值艾滋病病毒和相关灵长类慢病毒的基因是病毒变异的主要位点(2,7,23)，鉴于编码的表面包膜糖蛋白在确定病毒细胞宿主范围、复制速率和诱导细胞病变效应中所起的作用，可以预期。HIV 1型（HIV-1）、HIV-2和猴免疫缺陷病毒（SIV）外膜糖蛋白中的残基决定了类型特异性中和表位和保守中和表位的特征。HIV-1的V3环是包络线中变化最大的区域之一(28,53——55)，包含一个有效的类型特异性中和表位(32,53)以及对细胞毒性重要的表位(43). 然而，虽然HIV-1包膜V3区的广泛变异已被充分记录，但对最近感染者的研究表明，遗传储备有限(34)，而其他人发现进行性疾病的变异减少(16,47,56). 在HIV-1中，V1和V2结构域包含类型特异的构象中和表位(21)而且变化很大(51)与C4区相比，C4区有助于病毒与CD4分子结合。相比之下，SIV的V1、V2和V4区域似乎是最异质的(1——三,6,7,38)，而V3区域是保守的。针对HIV-2的研究相对较少环境价值感染过程中的基因变异，尽管已观察到V1、V2、V3和V4的变异(5,8,50).

虽然HIV-2与SIV的关系可能比HIV-1更密切(8)在人类中致病性较低(31)它仍然是一种人类病毒，由于某些HIV-2毒株在猕猴和狒狒中感染和产生疾病的能力，它为理解遗传变异和致病性之间的关系提供了一个有用的模型(4,20,37,40,46)允许对病毒变异和复制的动力学进行密切和受控的检查。HIV-2毒株（HIV-2）的可用性287)在幼稚期迅速产生免疫缺陷（或进展）豚尾猴(22,52)以及使用HIV-2（HIV-2）无毒克隆的活病毒免疫模型韩国) (27)在HIV-2攻击后，可以诱导对快速CD4耗竭（非进展性）的保护287(29)，使我们研究了病毒接种和宿主反应对HIV-2猕猴模型包膜多态性的影响。通过异源双链追踪分析（HTA）和外周血单个核细胞（PBMC）病毒DNA和血浆病毒RNA扩增片段的测序，使用来自幼年和免疫动物的样本来检测病毒变异。

异源双链追踪显示，初始病毒DNA变异的程度与接种物的大小有关，并表明受保护动物中病毒RNA物种的变异小于未受保护的对照动物和未受保护动物。这些发现通过HTA可识别克隆的测序得到了证实，测序结果表明，在接受低水平HIV-2接种的受保护动物中，病毒DNA变异显著减少287病毒RNA序列变异程度的显著降低与给予相同HIV-2接种物的动物之间的保护相关287.

材料和方法

动物免疫。

四只辫尾猕猴(梅内斯特里纳)通过静脉注射104（动物J90292和F90350电话; 分别指定为292和350）或10三（动物F90404电话和传真90407; 分别指定404和407）HIV-2合胞体形成单位（SFU）韩国(27)来源于Molt 4/clone 8转染培养物（表​（表1）。1). 所有猕猴都感染了HIV-2韩国如病毒再分离（四分之三）、DNA PCR（四分之一）和gp36肽酶免疫分析（四分三）所示。所有患者在HIV-2感染后都经历了短暂的轻度CD4下降韩国接种后20周解决。艾滋病病毒2型韩国在26 wpi之后，无法从任何动物中分离出病毒DNA，而52 wpi的HIV-2无法在所有动物中检测到病毒DNA韩国HIV-2感染后14个月韩国感染后，这些动物与两个单纯的HIV-2对照组（动物J92096和F92147；分别指定为096和147）一起受到攻击287(29). 挑战病毒是通过将动物287的淋巴结衍生淋巴细胞与同种PBMC共培养获得的。这只动物在接种了另一只接种了HIV-2的动物的全血后，迅速出现免疫缺陷EHO公司(22). HIV-2的挑战287通过静脉接种使用10550%组织培养感染剂量（TCID50)（动物292、407和096）或101TCID公司50（动物350、404和147）。所有猕猴都感染了HIV-2287激发后，如病毒再分离所示，进行了2次wpi。病毒复制和免疫反应的动力学在别处已有描述(29).

表1

挑战实验中使用的动物

动物艾滋病病毒2型韩国接种物（SFU）艾滋病病毒2型287接种物（TCID50)HIV-2感染后CD4下降287接种免疫缺陷病
096无105快速快速
147无101快速快速
292104105无无
350104101无无
40710三105快速延迟
40410三101快速延迟

血浆和PBMC分离；DNA提取。

在激发后每隔2周从每只动物身上抽取血液，如前所述，通过93%Ficoll-Hypaque梯度分离用Hanks平衡盐溶液1:1稀释的血液来分离PBMC(27). 按照制造商的规定，通过柱分离（QIAamp试剂盒；Qiagen）提取病毒DNA。通过直接离心酸-柠檬酸-提取物-抗凝全血或从Ficoll梯度采集稀释血浆（1:1）分离血浆。DNA和血浆均在−80°C下冷冻，直至检查。

病毒DNA序列的PCR扩增。

使用引物243（5′-ATG-TGT-GGA-GTC-TCT-TTG-AGA-CC-3′），从已发表的HIV-2的核苷酸[nt]5328到5350，通过第一轮PCR扩增出编码HIV-2 gp130的V1-V2和V3-V4-CD4区域的DNA序列EHO公司序列；GenBank基因座HIV2EHOA，登录号。长14545)和126（5′-CAA-AGC-CAA-TTG-GTG-TTA-TC 3′，nt 6520至6539）得到1212 bp（nt 5328至6539的产物）。扩增从500 ng DNA开始，最终体积为50μl，在含有每个引物的混合物中进行，每个引物在1μM，每个脱氧核苷三磷酸在200μM，1.25 U塔克DNA聚合酶（Promega），2.5 mM MgCl2、50 mM KCl和10 mM Tris HCl（pH 8.3），置于Perkin-Elmer 480热循环器中。PCR条件为94°C 45 s，60°C 30 s，72°C 1 min 40 s。柱纯化（QIAquick；Qiagen）后，使用两组内引物V1-V2（nt）（5352-5742）区域引物290（5′-CAA-TAA-AAC-CAT-GTG-TTA-AAT-TAA-CC-3′，nt 5352-5377）扩增2μl先前扩增的产物使用上述PCR条件，加上244（5′-GCA-CAA-TAC-CTA-AAT-CTT-AAA-CTA-TCC-3′，nt 5716-5742）和V3-V4-CD4（nt 5912-6539）区域引物240（5′-GGT-AAA-GAC-ATA-AGC-3′，nt 5912-5938）加上126。第一组和第二组引物分别设计用于扩增包含gp120的V1-V2区域和包含V3、V4和CD4结合区域的628 bp区域的391 bp DNA片段。

HTA公司。

通过HTA分析第二轮PCR产物的异质性(14,15)使用放射性标记的单链DNA（ssDNA）探针。为了获得探针，PBMC衍生的病毒DNA环境价值从两只携带HIV-2病毒的2 wpi幼稚猕猴身上获得的碎片287经PCR扩增，克隆到pUC19载体中，并测序。选择与一致序列具有最高总体同源性的克隆（克隆147/2-14）来生成HTA探针。通过PCR扩增克隆147/2-14制备ssDNAs，使用两种方法32P-标记的（探针）和生物素化的（捕获）引物，然后通过与M-280链亲和素结合的磁珠（Dynabeads；Dynal）孵育和在磁性粒子集中器（MPC-1；Dynal）中处理来变性和去除生物素化链(第13页). 探针引物末端标记有32P使用0.01 pM引物，0.01μCi的[γ-32P] dATP、2 U的T4多核苷酸激酶和1×多核苷酸激酶缓冲液（Boehringer Mannheim），10μl。在37°C下孵育30分钟后，将酶在95°C下灭活5分钟，然后在热循环器中冷却至4°C。在含有退火缓冲液（1 mM NaCl、100 mM Tris HCl[pH7.8]、20 mM EDTA）和5000 cpm32每个样本的P标记ssDNA探针。变性在95°C下进行2分钟，然后在4°C下在热循环器中培养5分钟。单独的ssDNA探针（5000 cpm）和使用未标记引物扩增探针质粒147/2-14所得的5μl同源双链对照样品以相同的方式变性和冷却，所有样品加载到5%中性1-mm厚的聚丙烯酰胺凝胶上（30%:0.8%丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶于88 mm三硼酸盐–2 mm EDTA中[pH8][TBE缓冲液]），并在550 V的低温室中，在Protean II垂直凝胶仪器（Bio-Rad）上的TBE缓冲溶液中运行2小时45分钟。

HTA结果的定量分析。

手动计数条带进行数值分析。此外，在蓝光下扫描如上所述制备的凝胶的自动射线照片（Silverscan III），以获得8位标记图像文件格式（TIFF）文件。TIFF文件进行了定量分析，包括归一化香农熵的测定(秒N个)和平均流动性变化的方式类似于Delwart等人(15). 简单地说，ImageQuant软件用于确定窄（4像素宽）网格（一列，32行）内的单元体积，绘制网格的目的是从单链探针位置的正下方延伸到每条车道中同型双链控制迁移对应位置的正下，而不是从沿模拟线的密度测量中平均线性像素值。此外，还应用仿射变换来平滑背景值。通过这种方式，可以获得完整凝胶的数据，并将其导出到电子表格中，以进行其他地方所述的测定(15).

DNA测序克隆的筛选。

使用上述条件对病毒DNA序列进行PCR扩增），环境价值用引物290和126扩增片段。产品在溴化乙锭染色的低熔点琼脂糖凝胶上进行分析，并切除1212-bp条带，通过氯化锂沉淀进行纯化，然后使用制造商指定的TA克隆试剂盒（Invitrogen Corp.，San Diego，Calif.）将其克隆到质粒pCRII中。

对于每只动物、时间点和材料来源（DNA或RNA），获得30到40个克隆，并使用引物290和126进行PCR筛选，以确定是否存在正确大小的插入物。使用正向引物[M13（−40）引物]和引物126通过PCR确定方向。然后用内引物290和244扩增V1-V2区，用异源双链追踪法进行筛选32P标记的V1-V2区域探针。HTA的结果用于识别代表病毒DNA群体中主要病毒变体的克隆，这些病毒DNA群体存在于8和18 wpi的幼年动物096和8和72 wpi免疫动物292和350中。选择在HTA分析中表现出明显活动性的样本（单个动物、来源和时间点）中的所有克隆进行序列分析。为了测序，隔夜培养克隆，并通过碱解/聚乙二醇沉淀程序提取质粒DNA（Applied Biosystems，Inc.，Perkin-Elmer）。将模板DNA（1μg）、3.2 pmol引物和9.5μl终止剂预混料（PRISM Ready反应染料脱氧终止剂循环测序试剂盒；Applied Biosystems）组合成20μl的最终体积。分别使用引物M13（−40）和244测定正向和反向序列。反应在Perkin-Elmer 480热循环器中进行（25次循环；95°C 30 s，45°C 15 s，60°C 4 min），产品储存在4°C下。然后，根据制造商的规范，在Centri-Sep柱（普林斯顿分离公司）上旋转产品，以去除多余的端接器。将反应混合物干燥并重新悬浮在4μl加载缓冲液中（50 mM EDTA[pH8]中的5:1去离子甲酰胺/右旋糖酐蓝[30 mg/ml]），在90°C下变性2 min，并在冰上冷却。将每个样本加载到Applied Biosystems 373A DNA测序仪上，并在TBE缓冲液中运行12小时。

RNA分离。

通过RNAzol方法分离血浆RNA（Tel-Test，Inc.，Friendswood，Tex）。简单地说，在4°C的Contifuge 17RS离心机（Heraeus）中以17000 rpm的速度将400μl血浆超速离心1 h，并用200μl RNAzol溶解颗粒。用0.1体积的氯仿提取RNA（冰上15分钟），并通过在4°C下以12000×g旋转悬浮液15分钟来分离水相。然后在−20°C下用1体积的异丙醇沉淀RNA 45分钟，再在12000×克在4°C下保持15分钟，并用75%乙醇洗涤两次。然后将RNA颗粒干燥并重新悬浮在经二乙基焦碳酸钠处理的水中。

cDNA的RNA反转录和PCR扩增。

对于病毒RNA的反转录，将1μM反向引物126在热循环器中以14.2-μl反应体积退火（68℃，8 min）至2μl RNA模板；将产物在4°C下快速冷却，然后添加到含有逆转录酶缓冲液的混合物中（25 mM Tris HCl[pH8.3]，50 mM KCl，2 mM MgCl2100μg牛血清白蛋白/ml）、1 mM脱氧核苷三磷酸、10 mM二硫苏糖醇和200 U Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶（Gibco，BRL，Life Technologies），最终体积为20μl。逆转录在37℃下进行45分钟，然后在90℃下进行2分钟，在4℃下进行2min。将逆转录产物（10μl）加入40μl的混合物中，该混合物含有50pmol正向引物290、逆转录酶缓冲液和1.25U塔克聚合酶。在使用上述外引物290和126扩增后，使用嵌套引物290和244扩增1-μl体积的产物，以获得V1-V2区域片段，用于HTA分析。除第一轮退火温度为56℃外，所有PCR条件均与DNA扩增所用条件相同。

所有动物的RNA病毒血症，除动物350和292在20 wpi后的时间点外，血浆病毒RNA的拷贝数为1000或更多(29)可用于逆转录-PCR的起始材料，以确保统计上有效的样本量。

序列分析。

序列最初通过与一个短的高度保守的核苷酸基序的一致性在5′端手动对齐，然后使用分层多重对齐算法(12). 通过两种FASTA比较确定核苷酸成对距离(12)PHYLIP 3.5c DNADIST程序中的Kimura算法(17). 为了比较分布，计算了平均成对距离，以及t吨使用SAS System 6.11软件对两个平均数不等的样本进行检验）和非参数（Wilcoxon秩和统计）统计检验。DNAML(18)该程序使用对齐的核酸序列获得系统发育树。预测的氨基酸序列再次对齐，并通过脱气手动调整。用VESPA软件进行氨基酸序列特征模式分析(26).

结果

感染的临床结果。

感染梅内斯特里纳有10个4（动物292和350）和10三（动物404和407）HIV-2的SFU韩国分子克隆(27)导致一过性低水平病毒血症和CD4轻度短暂下降+淋巴细胞数(27). 相反，接种高或低剂量的HIV-2287，HIV-2连续传代后获得的分离物环境卫生组织在里面梅内斯特里纳产生大量病毒血症，CD4迅速下降+淋巴细胞数量与免疫缺陷的快速发展(29)在幼稚动物096和147中。接种HIV-2的幼年动物基因组变异性比较287HIV-2中存在的病毒韩国-免疫猕猴受到接种后幼年动物快速临床恶化的限制(29). 接种后（18周），来自幼稚动物的样本仅在有限的时间内可用，之后对动物实施安乐死。可以对HIV-2进行更完整的比较（2、4、6、8、52、56至68，以及高达72 wpi）韩国-HIV-2感染后CD4下降的免疫动物（404和407）和CD4下降保护动物（292和350）287接种。先前感染HIV-2的动物免疫韩国发现在没有临床疾病证据的情况下存活时间更长，但只有注射高HIV-2病毒的动物韩国接种物（292和350）可防止CD4下降(29)高剂量或低剂量HIV-2激发后287（表​（表1）。1). HIV-2的再激活韩国遵循HIV-2287根据使用针对任一HIV-2的特异性引物的PCR判断，该挑战未被检测到韩国或HIV-2287.

遗传变异在环境价值基因。

检测HIV-2内基因组变异的分布环境价值基因跟随挑战，HIV-2的大片段287 环境价值基因（1212 bp，nt5328至6539），通过外包膜糖蛋白的CD4结合区包围V1区，被扩增。PCR起始材料中的拷贝数并非在所有时间点都能在所有动物中获得：在接种低水平HIV-2的动物中观察到PBMC病毒DNA拷贝数低287（147、350和404）排除了在8wpi的反应中使用>20份病毒DNA作为起始材料。在动物350和404中，500 ng基因组DNA中存在<10个拷贝；在动物147中，在8wpi下使用了预测的13个拷贝。在所有其他动物中，以8 wpi的速度使用了20多个预测的病毒DNA拷贝（正如Delwart等人[14,15])，并且对于所有其他时间点，通过定量PCR预测存在>100个拷贝的病毒DNA(29). 对于HTA，检测了该较大片段的两个亚段，包括一个片段V1，包含V1和V2区域（nt5352至5742），以及第二个片段CD4，包含HIV-2的V3、V4和CD4结合区域（nt5912至6539）287gp130。使用从动物147的PBMC衍生病毒DNA克隆中获得的代表性ssDNA探针（参见材料和方法），我们比较了原始和HIV-2中这两个区域随时间的变化范围韩国-免疫动物（保护和未保护CD4+淋巴细胞减少）287接种。

使用CD4区域探针，从所有HIV-2中获得V3-V4-CD4区域的HTA287-受感染的猕猴在所有时间点都有强条带在同源双链位置附近迁移，很少或没有检测到小条带（图。​（图1）。1). 根据类似的研究，这并不奇怪，虽然检测到V1、V2和V4的变异，但感染猕猴SIV包膜的V3或CD4结合区几乎没有变异(1,2,7,38). 虽然用这种方法可能可以检测到简单的点突变，但这些片段没有被考虑用于进一步分析。相反，如多条带所示，HTA放射自显影中存在许多流行的病毒形式，显示了使用V1探针的分析结果（图。​（图2），2)，而迁移到同源双链位置附近的条带通常不可见或非常微弱，这表明与探针密切相关的病毒形式在这些时间点仅作为次要变体存在于这些动物中。对平均迁移率偏移的分析证实了这些区域的显著差异（CD4区域为0.25±0.004，V1-V2区域为0.64±0.013，P（P）<0.0001（通过Wilcoxon秩和检验）。在所有时间点，检测到动物147中靠近同源双链位置迁移的带（图。​（图2B）2B） 很可能是因为HTA探针是从该动物的PBMC衍生病毒DNA序列中以2 wpi提取的（参见材料和方法）。

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来自HIV-2包膜V3-V4-CD4区域的PBMC衍生病毒DNA序列的HTA。面板显示了在32P标记的ssDNA探针和引物240和126的产物扩增了接种后不同时间从动物获得的PBMC中存在的病毒DNA的CD4区域。杂交后，产物在中性聚丙烯酰胺凝胶上溶解并进行自动射线照相（见材料和方法）。（A） 动物096，幼稚，受到高剂量HIV-2的挑战287; （B） 动物147，幼稚，受到低剂量HIV-2的攻击287; （C） 动物292，用高剂量HIV-2免疫韩国并受到高剂量HIV-2的挑战287; （D） 动物350，用高剂量HIV-2免疫韩国并受到低剂量HIV-2的攻击287; （E） 动物407，用低剂量HIV-2免疫韩国并受到高剂量HIV-2的挑战287; （F） 动物404，接种低剂量HIV-2韩国并受到低剂量HIV-2的攻击287。通道上方的数字对应于样本所指的时间点（感染后一周）。不锈钢，单股32P标记探针；HD，同双工带；MW，分子量标记。总的来说，数据显示，当使用CD4探针时，只有一种变体是可检测的，并且随着时间的推移它是保守的。

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HIV-2包膜V1-V2区PBMC衍生病毒DNA序列的HTA。面板显示了在32P标记的ssDNA探针和引物290和244的产物扩增了接种后不同时间从动物获得的PBMC中存在的病毒DNA的V1和V2区域（见材料和方法）。（A） 动物096，幼稚，高剂量HIV-2攻击287; （B） 动物147，幼稚，受到低剂量HIV-2的攻击287; （C） 动物292，用高剂量HIV-2免疫韩国并受到高剂量HIV-2的挑战287; （D） 动物350，用高剂量HIV-2免疫韩国并受到低剂量HIV-2的攻击287; （E） 动物407，用低剂量HIV-2免疫韩国并受到高剂量HIV-2的攻击287; （F） 动物404，接种低剂量HIV-2韩国并受到低剂量HIV-2的攻击287。通道上方的数字对应于样本所指的时间点（感染后一周）。请注意，在许多动物中，迁移到同源双链位置附近的条带要么不可见（A，动物096在4到12和18 wpi；C，动物292在4、6、52和72 wpi，D，动物350在2到72 wbi；E，动物407在8到68 wpi时；F，动物404在2到56 wpi），要么非常微弱（A，生物096在1、2、3和14 wpi处；B，动物147在4和18 wbi处；C，8 wpi时动物292；E、 动物407在2、4和6 wpi）。不锈钢，单股32P标记探针；HD，同双工带；MW，分子量标记。面板A、C和E，来自感染高HIV-2的动物287接种体，显示许多条带；从接受低剂量HIV-2的动物身上，在面板B、D和F中可以看到较少的条带287接种物。

V1-V2区的DNA异质性与激发剂量相关。

当使用V1探针时，我们发现幼稚动物和免疫动物都存在广泛的变异性（图。​（图2）。2). 在几种动物中观察到接种后不同主要变体随时间的演变（比较动物407中的变体[图。2E] 在2至8 wpi时，与52至68 wpi和动物404相比[图。2F] 2至8 wpi与52至56 wpi），与作用于V1和V2区域的外源压力（如免疫选择）引起或逃避的变化一致。然而，我们无法确定变异数与免疫缺陷疾病进展之间的特定相关性。注意动物292（图。​（图2C），2C） 在疾病和CD4淋巴细胞下降中得到保护，表现出与动物096相似的变异模式（图。​（图2A），2A） 经历了CD4快速下降和疾病进展。此外，没有发现与保护或缺乏保护相关的显性单一基因型。

病毒DNA V1-V2区的变异与HIV-2的剂量之间似乎存在明显的相关性287用于挑战（表​（表2；2; 图。​图2）。2). 在2、4和8 wpi时，猕猴接种了低剂量的HIV-2287（幼稚动物147和HIV-2韩国-经验丰富的动物350和404[表2])HTA上的平均条带数分别为2.3、2.0和1.8条，而接种高剂量HIV-2的动物287（幼稚动物096和HIV-2韩国-经验丰富的动物292和407）在相同的早期时间点显示出平均4.3、3.8和3.7条不同的谱带。在最后一个可用的时间点（18 wpi代表147，72 wpi对应350，56 wpi表示404，18 wpi0代表096，72 wbi代表292，68 wpi象征407），可以看到条带数量上的类似差异，低剂量动物平均有2.3条不同的条带，高剂量动物平均3.7条不同的带（总的来说，P（P）=0.0009（通过Wilcoxon秩和检验）。同样，平均秒N个在给予高接种物的动物中的值显著更高（高接种物为0.78±0.01，低接种物为0.67±0.01，P（P）=0.02[表2]).

表2

可通过HTA和秒N个DNA克隆的HTA通道值

动物接种
HTA可识别的病毒DNA变体数量
秒N个HTA车道
艾滋病病毒2型韩国（SFU）艾滋病病毒2型287（TCID）50)2 wpi4 wpi8 wpi迟到一2 wpi4 wpi8 wpi迟到
096无10554–5440.830.840.840.83
147无1013–43–42–320.690.700.680.69
292104105544–540.800.800.790.70
35010410121–2220.710.720.690.65
40710三105三三2–3三0.720.680.820.70
40410三1011–211三0.640.640.700.64
一定义为147和096的18wpi，350和292的72wpi、404的56wpi和407的68wpi

受保护猕猴的血浆RNA中出现单个V1-V2变异体。

从其他研究中尚不清楚病毒DNA序列的检测是否必然导致对感染期间病毒变异的性质或过程的准确评估(15,24,33,34,36,47,56,58). 为了研究从淋巴细胞衍生病毒DNA中回收的准种的数量、类型或变化是否完整准确地反映了病毒的异质性，采用RNAzol法分离血浆RNA，逆转录并用PCR扩增，并用HTA分析合成的cDNA（见材料和方法）。对每只动物检测第2、4、8和16周的扩增产物。总的来说，病毒RNA序列的异质性再次与病毒接种相关（对比图。​图3A，三A、 C、E和图。​图3B，三B、 D和F）。在给予低剂量HIV-2的动物中，2、4、8和16wpi时的平均变异数分别为1.7、1.0、1.3和1.3287（表​（表3，三动物147、350和404）和5.3、3.3、5.3和4.0287（表​（表3，三动物096、292和407）。总的来说，这一趋势是显著的(P（P）=0.0004（通过Wilcoxon秩和检验）。归一化熵也有显著差异（表​（表3）三)在接种高剂量疫苗的动物之间(秒N个=0.68±0.00），动物感染低HIV-2287接种物(秒N个= 0.62 ± 0.01,P（P）< 0.02). 在幼稚（动物147）和HIV-2中韩国接种少量HIV-2的经验丰富的动物（动物350和404）287早期（第2-8周）RNA和DNA样本的异质性具有可比性。在一些动物的稍后时间点，也可以通过PCR检测到病毒RNA，包括原始对照组096和147的16wpi（图。​（图3A三A和B）和第52至68周以及第52至56周，分别针对未受保护的免疫动物407和404（图。​（图3E三E和F）。相反，猕猴接种了较高剂量的HIV-2韩国两者都显示出血浆RNA病毒变体数量迅速减少到单个HTA带（图。​（图3C三C和D），在第16周，对照动物096在接种了较高的HIV-2后未表现出这种趋势287（图。​（图3A）三A） 或用低剂量HIV-2免疫的动物404和407韩国，其中存在多个波段。这种印象也反映在动物292在第2周至第16周的熵值从0.68降至0.56，受保护动物的平均值为0.63，未受保护动物为0.66（表​（表3，三,P（P）= 0.05). 即使使用了之前时间点所用血浆量的10倍，我们也无法在第16周后从受保护动物292和350（20、26、35、44、52和72 wpi[数据未显示]）中扩增病毒RNA。因此，保护似乎与限制免疫动物292和350中V1-V2区病毒RNA序列的变异有关。尽管检测到持续高水平的病毒DNA，但这些动物也能通过24wpi将循环病毒清除至80-200拷贝/ml以下(29).

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来自HIV-2包膜V1-V2区域的血浆病毒RNA衍生序列的HTA。面板显示了在32P标记的ssDNA探针和引物290和244的产物扩增了接种后不同时间从血浆中获得的病毒RNA的V1和V2区域（见材料和方法）。（A） 动物096，幼稚，受到高剂量HIV-2的挑战287; （B） 动物147，幼稚，受到低剂量HIV-2的攻击287; （C） 动物292，用高剂量HIV-2免疫韩国并受到高剂量HIV-2的攻击287; （D） 动物350，用高剂量HIV-2免疫韩国并受到低剂量HIV-2的攻击287; （E） 动物407，用低剂量HIV-2免疫韩国并受到高剂量HIV-2的挑战287; （F） 动物404，接种低剂量HIV-2韩国并受到低剂量HIV-2的攻击287泳道上方的数字对应于样本所指的时间点（感染后一周）。不锈钢，单股32P标记探针；HD，同双工带；MW，分子量标记。与来自高HIV-2感染动物的V1-V2区域、面板A、C和E的病毒DNA序列类似287接种物最初显示许多条带，而在接种低剂量HIV-2的动物的B、D和F组中看到的条带较少287接种物。注意，在接受高剂量HIV-2的受保护292只动物中，C组中看到的条带数量减少了8至16 wpi287相比之下，接种物在动物407和404中持续存在多条带，这些动物没有保护CD4下降，并且在同一时间点（A），在未受保护的幼稚动物中仍存在多条谱带。

表3

可通过HTA和秒N个RNA克隆的HTA凝胶条带值

动物接种
HTA可识别的血浆RNA病毒变体数量
秒N个HTA车道
艾滋病病毒2型韩国（SFU）艾滋病病毒2型287（TCID）50)2 wpi4 wpi8 wpi16 wpi2 wpi4 wpi8 wpi每小时16个
096无10554770.800.710.750.70
147无10121110.600.600.560.57
29210410544210.650.690.550.57
35010410111110.600.620.730.63
40710三10572740.770.620.750.65
40410三10121220.630.600.600.58

选择克隆进行序列分析。

为了证实HTA揭示的结果，确定负责V1-V2区域内准物种产生的突变的性质，包括对受保护动物与未受保护动物血浆RNA中出现的单一变体的表征，为了确定在不同时间点发现的类似迁移带是否代表相同变体（保守物种）或相似发散变体的巧合进化，对选定的克隆进行了克隆和测序。初级猕猴096（高剂量HIV-2）的PCR-扩增V1-CD4片段EHO公司)以及保护猕猴292和350（高剂量和低剂量HIV-2287分别从病毒DNA中克隆，包括早期（第8周）和晚期（第18周或72周）时间点的样本。对于血浆RNA，只考虑了292只动物（第8周和第16周）和096只动物（16周）。

在用巢式PCR扩增V1-V2区域后，用HTA对每只动物在每个时间点的30到40个克隆进行筛选（见材料和方法）。对所有经HTA证明可区分的克隆以及一些看起来非常相似的克隆进行了测序。图​图4a4a显示了所有可区分的序列，包括那些包含早期或晚期移码或终止密码子的序列，以及HTA发现的一些类似序列（例如，096/18/39-62和克隆292/16/05-06-09）。所有序列在V1-V2区显示出一个独特的基因型，突变的数量和位置在分离株之间是可变的。

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预测克隆的氨基酸序列。所示为HIV-2包膜V1-V2区DNA（A）和RNA（B）克隆的预测氨基酸序列。校准编号是指HIV-2中的位置287包络片段序列。每个克隆由动物编号指定，后面是代表感染后一周的两位数字，两位数字表示克隆，“D”或“R”表示来源为PBMC衍生的病毒DNA或血浆病毒RNA。包括HIV-2相应区域的序列进行比较EHO公司（EHOV1V2）和HIV-2的包膜克隆287（287V1V2）。使用MULTALIN进行多层次比对(12). •, 身份；−，间隙；∧，移码；*，停止密码子。糖基化位点（N）以粗体显示。

替换频率分析。

为了确定序列集内差异的显著性，在源自每只动物的DNA和RNA数据以及不同动物之间的预测序列中，比较导致氨基酸变化和停止信号的突变数量。总的来说，6.7%的碱基（1718）与亲代HIV-2不同EHO公司/艾滋病病毒2型287序列，远远超过PCR扩增期间可能出现的～0.1%。这包括594个颠倒、1124个转换、881个缺失和502个插入，其中21626个碱基保持不变。对DNA和RNA克隆中碱基替换率的分析表明，a的突变数量略有增加，G的变化明显增加，C的替换与随机概率预测的没有明显差异。T的突变数量也明显不足，类似的非随机突变(P（P）<0.001（χ）2分析）在所分析的所有序列子集中都发现了模式（包括仅DNA、仅RNA、8-wpi克隆、72-wpi的克隆以及每只动物的克隆子集）。

对观察到的替换对预测氨基酸序列的影响的分析表明，大多数突变并不沉默（～85%非同义[图。4]). 通过使用观察到的插入、删除和替换频率构建一组1000个序列，这一发现与随机概率预测的结果显著不同（15.6%对23.9%，P（P）< < 0.001). 受保护动物292（18.4%）的DNA和RNA克隆中同义突变的比例显著高于给予高剂量HIV-2的幼年动物096287(P（P）<0.01），但仍显著低于偶然预期的分数(P（P）< 0.05). 当我们将096个序列的总集合与从292个早期（292/08）获得的DNA克隆进行比较时，这一观察结果成立[P（P）<0.05]），后期DNA克隆（292/72[P（P）<0.05]），或后期的RNA克隆（292/16[P（P）<0.05]）或当我们比较后期从096获得的DNA克隆与292个克隆的总集合时(P（P）<0.025）或292序列的所有子集(P（P）分别<0.05、0.05和0.05）。这一结果主要归因于292例晚期DNA中非同义突变的频率降低，以及096例晚期非同义变异的发生率非常高。

分析表明，移码和停止只存在于DNA序列中；半胱氨酸、酪氨酸和色氨酸残基是保守的；天冬酰胺突变导致糖基化位点的引入是常见的。突变通常是保守的，尤其是碱性（R）和亲水性（S，T）氨基酸。在测序的克隆集合中，1316个残基被替换，5516个保持不变，113个被插入，284个被删除，包括59个DNA序列中的11个移码和67个停止，但从RNA获得的16个克隆中没有移码或停止(P（P）<0.05，Fisher精确测试）。半胱氨酸仅被另一个残基（克隆292/08/04D，位置48）和高度保守的残基（625个残基）替换一次。三个酪氨酸残基（75、80和98位）和两个色氨酸残基（15和79位）也高度保守（对于酪氨酸，185个位置中的3个被取代；对于色氨酸，142个位置的一个插入和七个取代[P（P）<0.001）。相比之下，引入天冬酰胺的氨基酸替换很频繁（207个变化），在75个克隆中的74个克隆中，在相对于HIV-2的位置67处产生一个新的预测糖基化位点EHO公司/艾滋病病毒2型287顺序。75个克隆中的63个克隆中还发现了一个潜在的意义未知的生长激素2型基序。天冬酰胺（N）频繁突变的重要性尚不确定，因为这在受保护和未受保护的动物中都很常见。

预测氨基酸序列的模式分析。

为了确定是否有任何特定的基序与疾病进展和保护有关，分析了肽序列组的特征（图。​（图4）。4). 通过直接检查对齐序列和使用签名模式分析(26)，我们确定了一些在早期和晚期或动物之间出现频率不同的基序。VESPA项目确定了许多模体中的残留物，这些模体也通过直接检查发现（QPST、PSTSS、EAN、GR和TILK[见下文]）。

在V1区，第8周DNA克隆中的氨基酸簇（PSTSS，残基26-30）的变化频率高于第18周或第72周（Fisher精确分析，P（P）=0.019），未受保护的动物096以18 wpi的频率最低（14个克隆中只有1个；P（P）= 0.035). 相反，其他簇（GR，残基19-20；QPSTSP，残基26-31；ILKEDN，残基36-41）主要在以后的时间出现在DNA克隆中(P（P）分别为0.022、0.038和0.003），表明未受保护动物的发病率最高（见克隆096/18/19、-20、-22、-26、-42、-45、-46和-54）。

其他基序（PQPLLREDN，残基33至41）虽然在早期和晚期出现的频率几乎相同，但在第8周和第18周未受保护动物的所有DNA克隆中均不存在，仅在RNA克隆096/16/17R中出现一次(P（P）= 0.005). 在给予最高剂量挑战病毒的动物中，TTP基序（残基31至33）在受保护动物292（292/08/03和-04、292/72/12、-15和-20）中的复发频率较高，而它仅存在于未受保护动物的两个克隆中（096/08/03至-15）(P（P）= 0.079). 相反，基序RGDESKQYR（残基68至76）的出现频率明显较高(P（P）=0.002）。该基序的前三个残基可能代表整合素结合（RGD）位点。在V2区，氨基酸簇（EAN，89至91）出现在所有动物的克隆中，但在后期获得的克隆中出现的频率高于早期获得的克隆(P（P）= 0.065). EGSKVGIK中的三氨基酸插入物（残基88至95）在早期和晚期都存在，对于受到高剂量HIV-2攻击的受保护动物来说似乎是独一无二的287（2004年8月29日至-09日和2015年7月29日到-20日）。

来自RNA的克隆显示出与上述DNA克隆相似的差异。RNA克隆096/16/08至-18显示氨基酸基序（残基21至22），类似于DNA克隆096/08/28和克隆096/18/19、-20、-26、-42、-45、-46、-53和-54中发现的氨基酸基序。以类似的方式，RNA克隆096/16/3至-12和-17在V1区域（氨基酸26至33）与DNA克隆096/08/02、-03和-25以及克隆096/18/15具有很大的相似性。在动物292中，在早期（克隆5、7、8和9）和晚期（克隆1、-2、-5、-6和-9）的RNA序列中也观察到DNA序列中已经存在的基序PSTSS（残基26至30）。该基序在早期总是以AS氨基酸基序开头，这也是在受保护动物的DNA克隆以及基序PQPLLREDN（残基33至41）中发现的特征。这种基序在早期总是存在于RNA克隆中，主要存在于受保护动物中，而DNA克隆中只存在于受保动物中(P（P）= 0.0052). TTP基序（残基31至33）仅在晚期才出现在所有RNA克隆中，并且更常见(P（P）=0.026）在受保护动物中292，而在未受保护动物的096克隆中（096/16/03至-12）。在V2区，氨基酸簇EGSKVGIK（残基88至95）在受保护动物292的DNA克隆中是唯一的，也存在于该动物的RNA克隆中（292/08/09）。在RNA克隆中，同样存在于DNA克隆中但频率较低的GKN基序（残基90至92）似乎完全替代了相同位置的EANNSG基序（保留基89至94）(P（P）=0.0006，DNA与RNA克隆的频率）。因此，虽然它们的意义尚不清楚，但在DNA和RNA克隆的V1和V2区域都发现了与保护有关的氨基酸特征。

系统发育分析。

为了检查不同克隆之间的关系，还使用了核酸序列的最大似然简约性（图。​（图5）。5). 来自同一种动物的一些序列具有上述类似的基序，这些序列在特定的末端分支聚集在一起（图。​（图5，5最右[D]和左[A]分支为350/08和-72，中上[C]和中下[F]分支为292/08和-72以及上分支为096/08和-18（B]）。然而，096/08和-18 DNA克隆以及292/08和-72 DNA克隆分布在整棵树的树枝上，这反映了接受高剂量攻击病毒的动物的克隆具有更高的异质性，如HTA所示。不同动物的序列被认为是高度相关的。注意，72 wpi的动物292的变异体与树中下段（E）中动物096的8 wpi和18 wpi序列组以及动物350的8 wbi和72wpi簇的序列组聚集在一起，动物292在右分支（D）中的8 wpi序列和左分支（A）中的096/18序列，因此，来自受保护或未受保护动物的克隆的聚类之间的特定关系并不明显。

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克隆的系统发育分析。PBMC衍生病毒DNA和血浆病毒RNA克隆的序列如图所示对齐。​图4，4，并使用PHYLIP 3.5软件包中的DNAML算法构建了系统发育树。克隆的指定如图所示。​图4。4这是一棵无根树，根据几对插值近似按比例绘制。请注意，虽然在给定时间点从给定动物获得的克隆存在集群，但存在一些序列并行进化的证据。此外，请注意，受保护动物292的RNA序列在16 wpi时紧密聚集。

RNA序列的系统发育分析（图。​（图5）5)此外，从动物096和292衍生的克隆有时密切相关（右下分支E和D）。然而，16 wpi的动物292的所有RNA克隆都聚集在中下部分支E中，8 wpi处的292个RNA克隆都位于右分支D中，而动物096的RNA克隆可以在树的末端分支中找到。来自未受保护动物096的RNA克隆和来自受保护动物292的RNA克隆之间的分布对比反映了HTA已经显示的受保护动物RNA序列的有限变异。

遗传变异的总范围。

为了检验总的变异程度，所有75个克隆之间的距离都是通过使用汉明距离（单位）和最大似然算法推导出来的(17). 然后比较每个克隆的平均成对距离（MPWD）以及每组所有成员之间的距离分布（图。​（图6）6)使用Wilcoxon秩和统计和Satterthwaite近似计算其他组克隆的平均值和分布t吨对两个平均数不等的样本进行测试（SAS、非参数方差分析和t吨-测试分析）。当在同一时间点比较不同动物的DNA克隆时，高剂量接种HIV-2后，未受保护动物096和受保护动物292的病毒DNA序列平均MPWD（通过对齐序列的汉明距离获得）为8wpi287未显示出显著差异（MPWD±标准偏差，0.107±0.013对0.115±0.015）。相反，来自动物350（低HIV-2）克隆的DNA序列的MPWD287接种物）在8wpi时显著小于动物096或292克隆体（0.089±0.013）(P（P）分别=0.040或0.004，t吨这与接种量较低的动物HTA上出现的较少条带数一致。同样，在72 wpi时，动物350克隆的DNA序列MPWD也显著小于动物292克隆的MPWD（0.083±0.008对0.118±0.020，P（P）< 0.001). 当比较同一动物在不同时间点的DNA克隆时，我们注意到DNA克隆的MPWD随时间的推移没有明显的趋势（比较096个DNA克隆在8wpi和18wpi，或292个和350个DNA克隆，在8wbi和72wpi）。当在同一动物相同时间点比较RNA和DNA克隆的MPWD时，动物096在16 wpi时的RNA克隆MPWD虽然较小（0.085±0.012 vs.0.106±0.025），但没有显著差异(P（P）＝0.075）与在18wpi下获得的DNA克隆的差异。相比之下，动物292的RNA克隆在8 wpi时的MWPD显著小于同期的DNA克隆(P（P）=0.045，0.091±0.022 vs.0.115±0.015），16 wpi时，动物292的RNA克隆的MWPD也显著小于动物096(P（P）<0.001，0.014±0.003对0.085±0.012）。动物292的RNA克隆的MWPD也降低(P（P）=0.082）在8和16wpi之间，与在RNA HTA中看到的带的损失一致（图。​（图3）三)在系统发育树中可以看到292/16个RNA克隆的紧密聚集（图。​（图5，5，分支E）。根据对齐序列的MWPD确定的总变异程度分析证实，同一时间点不同动物之间或同一动物内部不同时间点的DNA序列距离，即使具有统计显著性，也不表明与保护有任何关联。相反，与同一时间点的原始对照组的RNA和DNA物种相比，受保护动物中病毒RNA物种的变异减少，证实了HTA结果。

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序列组的MPWD。显示了不同组序列的平均MPWD（开条）、平均距离的标准误差（误差条）和单个MPWD。克隆的指定如图所示。​图4，4，但未指示克隆号。使用DNAML算法的PHYLIP DNADIST程序和使用单位矩阵的FASTA比较确定了距离。RNA序列的MPWD始终低于DNA序列，并且在受保护动物292 16R的RNA克隆和未受保护动物096 16R的DNA克隆之间观察到显著差异。

讨论

遗传变异性经常被研究，目的是寻找与病毒表型和发病机制的相关性(10,57). 对同一患者或动物体内的序列分离物或直接扩增克隆进行了检测，以研究特定或独特物种与疾病进展的关系(10,28,36,47,49)以及整体变异程度在免疫发病机制中的作用(10,11,13,40,41,47,57). 虽然来自上述研究的证据表明基因型、表型和疾病进展之间存在相关性，但最近的研究发现序列差异和疾病进展缺乏相关性(51)并且发现V3环的变化表明SI表型的发展并不是预测性的(25,56). 长期非进展者与病毒载量或细胞毒性T淋巴细胞活性水平之间的相关性也比与特定病毒表型之间的相关性更为显著(11,19). 类似地，一些研究人员发现早期感染或无进展与低多样性相关(34——36,47)以及与准物种多样性增加相关的进行性疾病(24,33)即使观察到特定组或基序的收敛（例如，V3环中的SI变体）(36,47). 相比之下，其他研究人员注意到非进展者的多样性更高(15,56)或发现多样性仅与感染后时间相关(30). 变异体也被描述为在不同的组织隔室中存在显著差异(7,58).

在这项研究中环境价值通过PCR扩增基因：一个包含V1和V2区域（指定V1），另一个包含V3、V4和CD4结合区域（指定CD4）。首先用HTA分析病毒多态性，然后对V1-V2克隆进行序列分析（主要是那些通过HTA筛选可区分为唯一的克隆）。比较HTA模式的复杂性和使用病毒DNA获得的HTA凝胶图像的定量分析，并没有揭示出与疾病防护的任何相关性或随时间的任何趋势，而是表明复杂性与接种量有关。相反，HTA对血浆病毒RNA的检测显示，免疫动物中有8 wpi的病毒明显存在单一变异，这些免疫动物受到疾病保护，而未经治疗的对照动物则接种了高剂量的HIV-2287两种免疫动物均未受到CD4下降的保护，表现出多种变体的持续存在。

为了获得有关遗传多样性随时间变化的额外和潜在补充信息，我们克隆并测序了病毒DNA和血浆病毒RNA衍生PCR产物的子集。这允许将HTA结果与来自相同动物在相同时间点的相同扩增反应的实际序列数据进行比较。虽然PBMC衍生的DNA克隆的HTA没有揭示受保护和未受保护动物之间的不同变异模式，但HTA和序列数据都证实，接种量较低的动物的病毒DNA序列更受限制。在8 wpi时，对于给予10 TCID的动物，预测PCR产物中只存在低拷贝数50HIV-2的287HIV-2水平较低的动物最初的多样性减少287因此，接种会导致病毒复制减少或延迟(29,52)并且可以不代表独立的因素。所有动物的血浆RNA衍生序列的异质性程度均小于病毒DNA序列，并且在高剂量接种HIV-2的受保护动物中受到进一步限制287与16 wpi的原始对照组相比，每个反应中至少包含1000份病毒RNA。对病毒DNA序列随时间变化程度的过程进行的检查尚未发现。相比之下，受保护动物292血浆病毒RNA序列的变异显著地限制在8至16 wpi（图。​（图6）。6). 受保护动物292中RNA序列随时间变化的这种限制似乎与那些预测多样性的维持与缺乏进展有关，而变异的缩小与感染模型不一致(16,33——36,47). 相反，有效清除病毒与血浆病毒库的显著限制有关(24). 这并没有反映在病毒DNA序列中，可能是由于循环PBMC中非复制DNA变体的积累，强调了分析血浆病毒RNA的重要性。

总的来说，A和G的突变占主导地位，T的突变明显不足，但在这个序列集中没有发现A的过度突变的证据。毫不奇怪，在受感染的动物中，非同义突变的发生率高于预期。然而，如果这反映了免疫压力，则很难解释为什么完全清除血浆病毒血症的受保护动物292表现出最高频率的同义突变。一般来说，突变是保守的，特别是碱性（R）和亲水（S，T）氨基酸，半胱氨酸和色氨酸残基高度保守。以前对免疫发病机制变异的研究没有提供令人信服的证据，证明任何特定变异或基序与疾病进展或防止这种进展有关。虽然本研究中动物数量有限可能会限制结论，但所发现的氨基酸特征的一些差异令人感兴趣。几乎所有序列都通过8wpi获得了一个新的潜在糖基化位点。这类似于SIV V1区及其周围糖基化位点的获得，该位点在病毒体内进化过程中出现(1). 此外，在受保护动物的氨基酸序列中，一些基序更为常见。这些包括包膜V1区内的相邻基序PSTSS（残基26-30）、TTP基序（残基31-33）和PQPLLREDN（残基33-41），以及V2区内EGSKVGIK基序（残留基88-95）。虽然与保护有显著关联(P（P）<0.05（通过双尾Fisher精确检验(P（P）< 10−14)在以下组的比较中看到波尔耐药引起的残基变化序列(41).

与单独使用这两种技术相比，使用HTA和由PCR克隆的HTA筛选指导的测序似乎可以更全面和准确地描述该模型中基因组变异的范围和作用，同时避免了测序的专门使用所涉及的大量劳动，通常每只动物每一时间点约有30个克隆。虽然用于选择克隆进行测序的方法并没有对在起始材料中同样表现良好的克隆群体进行分析，但它确实允许在不需要数百个克隆测序的情况下估计群体内存在的最大变异程度。还要注意的是，无论是HTA分析还是测序都没有表明出现了一个单一的优势病毒DNA克隆，这在一定程度上改善了对所选序列数据的反对。序列数据的使用验证了HTA对总变化程度的估计。对大量动物正在进行的实验进行的类似分析，应能为这种活病毒疫苗模型中病毒变异的性质和机制及其保护意义提供更确凿的证据。

鸣谢

该项目是由国家合作疫苗开发集团（National Collaborative Vaccine Development Group）拨款5 U01 AI30238-05实现的，还部分得到了华盛顿大学西雅图地区灵长类动物研究中心分包合同（UCSD 95-6461）的猿猴疫苗评估组的支持。该项目的测序和数据分析支持也由加州大学圣地亚哥分校艾滋病研究分子生物学中心提供（拨款2 P30 AI36214-02）。意大利罗马高等卫生研究所艾滋病项目向来访的科学家安东尼娅·拉达埃利提供了资助。

我们感谢E.L.Delwart的协议和有益的讨论。我们还感谢Michael Wen、Richard Szubin和Silvestre Ramos提供的技术援助。

参考文献

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文章来自病毒学杂志由以下人员提供美国微生物学会（ASM）