《维罗尔杂志》。1998年10月；72(10): 7860–7870.
病毒DNA的封装需要腺病毒L152/55-Kilodalton蛋白
密歇根州安阿伯市密歇根大学医学院微生物学、免疫学和综合癌症中心系，邮编：48109-0942
*通讯作者。邮寄地址：密歇根大学，1500 E.医学中心博士，6310 CCGC，密歇根州安娜堡，48109-0942。电话：（734）763-9162。传真：（734）647-9271。电子邮件：ude.hcimu@lairepmi. †现住址：加利福尼亚州斯坦福大学医学院微生物与免疫学系，邮编94305-5124。
摘要
先前的工作表明，腺病毒L152/55-kDa蛋白是病毒颗粒组装所必需的，尽管其在组装过程中的确切作用尚不清楚。然而，52/55-kDa蛋白的早期表达表明，它可能在感染早期发挥其他作用。为了揭示52/55-kDa蛋白在早期可能发挥的作用，并更好地描述其在组装中的作用，构建了一种不能表达52/55-kDa蛋白的突变腺病毒（H5pm8001）。对DNA复制和晚期蛋白质合成的开始和程度的分析表明，H5pm8001感染的293细胞与5型腺病毒（Ad5）感染的细胞同时进入感染晚期。有趣的是，H5pm8001感染细胞的复制病毒DNA和晚期蛋白水平略低，这表明尽管不需要，但52/55-kDa蛋白在感染期间确实会增强这些活性。对主要晚期启动子和IVa2启动子产生的转录物的分析表明，与Ad5感染细胞相比，感染后18小时H5pm8001感染细胞的转录物略有减少，这在以后并不明显。对H5pm8001细胞中形成的颗粒的分析显示，可以形成空的衣壳，这表明52/55kDa蛋白不起支架蛋白的作用。随后对这些颗粒的表征表明，它们缺乏任何相关的病毒DNA。这些发现表明，52/55 kDa蛋白需要介导病毒DNA和空衣壳之间的稳定结合，并表明其在DNA包被过程中发挥作用。
腺病毒感染后期，形成两个丰富的颗粒，可以通过CsCl平衡离心分离(39). 这些颗粒中较重的是成熟病毒，而较轻的颗粒是空衣壳。空衣壳的蛋白质组成分析表明，尽管它们缺乏所有核心成分，但它们含有己糖、戊糖碱、纤维以及蛋白质VI和VIII的前体形式(29,39,51,58). 此外，在空衣壳中还发现了成熟病毒中未发现的其他几种蛋白质，它们可能在组装过程中起支架蛋白的作用(29,51,55,58). 脉冲相实验结合对温度敏感突变体感染细胞期间形成的缺陷颗粒的分析，揭示了第三类含量较少的颗粒，称为组装中间体(14,15). 通过可逆交联对这些粒子的进一步表征表明，它们可以分为两种组分，称为重中间体和轻中间体。轻中间体与空衣壳具有相同的蛋白质组成，但与病毒基因组的一小部分相关。重中间体含有全长病毒基因组，缺乏所有支架蛋白。动力学分析表明，组装中间体和成熟病毒粒子之间存在前体/产物关系，组装中间体中的放射性标记可以被追踪成成熟病毒粒子(14,15). 通过对H2ts1的分析，发现了第四种被称为年轻病毒粒子的颗粒，H2ts1在病毒蛋白酶基因中含有温度敏感突变(29,63,64). 在非允许温度下感染H2ts1的细胞积聚病毒颗粒，其中包含与核心蛋白V和VII相关的全长病毒基因组。年轻病毒粒子与成熟病毒粒子相同，只是几种病毒蛋白以前体形式存在（IIIa、VI、VII、VIII和末端蛋白），而蛋白质X、XI和XII不存在。总的来说，这些发现表明病毒形态发生的第一步是病毒蛋白（一些为前体形式）与支架蛋白结合形成空衣壳。病毒DNA的结合是下一个可检测的步骤，并导致轻中间体的形成。然后DNA被包被，支架蛋白被降解或释放以产生重中间体。年轻的病毒粒子是由病毒核心蛋白的结合形成的，最后一步是病毒蛋白酶裂解前体蛋白以产生成熟的病毒粒子。
对一种在L1 52/55-kDa蛋白（H5ts369）中含有温度敏感突变的腺病毒的特征分析表明，该蛋白是病毒组装所必需的(23). 当HeLa细胞在非允许温度下感染H5ts369时，轻中间产物积累。对这些中间产物的分析表明，它们与病毒基因组的左端有关，表明52/55-kDa蛋白在DNA包被中起作用。后来的发现表明，早期组装中间产物有许多52/55-kDa蛋白的拷贝，这些结构在成熟为病毒时逐渐失去52/55-kDa蛋白(22). 这导致了Hasson等人(22)提示52/55-kDa蛋白可能以类似于几种噬菌体组装途径的方式作为支架蛋白（参考文献综述5).
尽管52/55kDa蛋白在病毒组装中的作用得到了明确证明，但其他观察结果表明，52/55kDa蛋白在感染早期可能具有额外的功能。与基因产物晚期家族的其他成员不同，编码52/55-kDa蛋白的mRNA在感染开始后很早就被检测到(9,57). 随后的分析表明，存在不同的调节机制，确保52/55-kDa蛋白在早期的表达。首先，与感染后期不同，当主要晚期启动子（MLP）的转录进入基因组的右端时(1,17,65)，早期转录终止于L3 poly（A）位点下游(30,47). 第二，L1-poly（A）位点的聚腺苷酸化被侧翼序列激活，这些侧翼序列有助于早期向该位点补充加工因子(12,16,18). 第三，紧邻IIIa剪接受体上游的内含子剪接阻遏物的存在导致早期几乎完全剪接到52/55-kDa蛋白外显子(33). 52/55-kDa蛋白在病毒DNA复制开始之前或在任何病毒结构蛋白产生之前出现，这表明它可能与感染过程早期的某些活动有关。
此前，我们报道了52/55-kDa蛋白在感染期间与IVa2蛋白相互作用(21). 因为IVa2蛋白是MLP的晚期特异性转录激活物(62)，这表明52/55kDa蛋白可能的早期作用可能是通过与IVa2蛋白相互作用来调节晚期基因表达的适当时间激活。然而，对组装中间体和成熟病毒的分析表明，IVa2蛋白是这些颗粒的组成部分(67)，使得与52/55-kDa蛋白的相互作用对病毒组装很重要。虽然H5ts369的表型在早期并不表明52/55-kDa蛋白的作用，但温度敏感性突变可能不会影响病毒颗粒组装前所需的52/55-kDa蛋白任何假定功能。此外，对H5ts369的分析无法区分52/55-kDa蛋白作为支架蛋白或在DNA包裹中的作用(22). 为了在早期确定52/55-kDa蛋白是否具有重要作用，以及进一步表征52/55-kDa蛋白在病毒组装中的作用，我们构建了一种不能表达52/55-k Da蛋白的突变腺病毒。对这种突变病毒的分析表明，52/55-kDa蛋白不需要进入感染后期，这表明它在早期并不提供必要的功能。在没有52/55-kDa蛋白的情况下形成的组装中间体的特征表明，它不起支架蛋白的作用，而是介导病毒基因组的包被。
材料和方法
质粒构建物。
腺病毒5型（Ad5）核苷酸编号来自已公布的序列(10). pTG3602包含一个全长Ad5基因组克隆，并且已经在前面进行了描述(6). 从氨基酸2到416的52/55-kDa开放阅读框（ORF）是通过克隆Nsi公司我/Hin公司dIII片段（核苷酸[nt]11054至11565）和Hin公司dIII型/Sma公司I片段（nt 11565至13065）进入Pst（磅/平方英尺）我和Hin公司pGEM-3Zf（−）的cII位点（威斯康星州麦迪逊市Promega Corp.）。用消解得到的载体速度一、 钝端T4 DNA聚合酶，连接到巴姆HI链接器（8-mers；Promega Corp.）并与巴姆你好。产生的2-kb巴姆然后将含有52/55-kDa ORF的HI片段克隆到巴姆pGEM-3Zf（−）的HI位点创建pGL1。
pBK-tripL1是通过一系列克隆步骤生成的，我们将根据要求提供详细信息。简单地说，我们从晚期腺病毒感染的293细胞cDNA文库中扩增了编码52/55-kDa蛋白的cDNA的5′端(21)，使用PCR。所用引物分别对应于与三分先导（nt 6051至6069）第一外显子互补的5′引物（a）和与52/55-kDa蛋白ORF（nt 11367至11350）互补的3′引物。A） ●●●●。该产品与52/55-kDa ORF的其余部分结合，并克隆到Nhe公司我和Xba公司pBK-CMV的I位点（Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA）以产生pBK-tipL1（图。A） ●●●●。
突变体52/55-kDa ORF的辅助细胞系分离和构建。（A） 用于生成293-L1细胞的52/55-kDa蛋白表达载体（pBK-tripL1）的示意图。文中指出了用于克隆的引物A和B的位置，以及Mlu公司我的网站位于nt 11312。缩写：trip，三方领导人cDNA；L1 ORF，52/55-kDa ORF；pA，聚腺苷化位点；巨细胞病毒。开口盒表示位于52/55kDa ORF下游的腺病毒序列。（B） 293-L1细胞的免疫印迹分析。用52/55-kDa蛋白的多克隆兔抗体检测从293-L1或293细胞制备的全细胞裂解物。Ad:+，裂解物在感染后20 h从腺病毒感染的293细胞中制备；−，未感染细胞裂解物。裂解液（μg），装载的裂解液量。（C） 突变体52/55-kDa ORF的示意图。底部显示了构建突变体时使用的引物结合位点（C、D、E和F）和限制性内切酶裂解位点（M、H和X）的位置。M、，Mlu公司我；H、，Hin公司dIII；X、，Xba公司I.图的上部显示了52/55-kDa蛋白ORF（nt 11096至11116）N末端的核苷酸序列。编码的氨基酸显示在每个三联体的下方，52/55-kDa ORF中的密码子位置显示在下方。箭头表示引入该区域的点突变。下划线的核苷酸对应于Spe公司I由这些突变产生的位点。*，这些操作产生的终止密码子的位置。
采用PCR策略对52/55kDa蛋白ORF进行突变（图。C） ●●●●。利用引物C（5′-CAGGTACTGTATCCCCACC-3′）和D（5′-CTACTAGTCTACTCTCACTCTCCCTGCTG-3′）合成了从nt10321延伸至11115的5′片段（CD）。利用引物E（5′-GTAGACTAGTAGCAGACATGCAGGGC-3′）和F（5′-CTTAGACTCGCCCTC-3′）合成了一个从nt 11100延伸至12298的3′片段（EF）。引物D和E在其5′端是互补的，并将nt 11102和11113之间的序列从CAA GAG CAG CGC更改为T型AA G公司A类C T型AG公司 T型A类G.粗体核苷酸表示这些引物引入的突变，下划线核苷酸表示Spe公司我的网站是在变异中创建的。片段CD和EF被消化Spe公司一、 连接并PCR扩增，使用引物C和F生成ΔL1片段（图。). 这个Xba公司我/Hin公司从ΔL1片段中分离出dIII片段（nt 10589至11565），用于替换病毒克隆中野生型基因的相应区域千磅B片段（nt 8537至14290）生成pKpnBΔL1。
为了合成反义核糖探针，将腺病毒基因组的不同区域克隆到pGEM-3Zf（−）中。pGL3pA包含从pGEML1跨越L3 poly（A）位点（nt 22237至22667）的Ad2序列(12). pGL3pArev含有相同的反向序列。pGHwt包含跨越L1 poly（A）位点（nt 13976至14146）的Ad2序列。pGE53/Pst包含跨越从克隆E53分离的IVa2编码区（nt 4060至4245）的Ad5序列(21). 通过T7 RNA聚合酶转录pGL3pA、pGL3p Arev、pGHwt和pGE53/Pst，分别产生与L3、E2A、L1和IVa2/E2B mRNA互补的转录物。
细胞系。
低压293单元(20)如前所述进行维护(21). 通过将pBK-tripL1转染到293细胞中，生成了稳定表达52/55-kDa蛋白的细胞系。约5×105293个细胞在转染前48小时被置于直径为6厘米的培养皿中。转染前4至6小时，向细胞注入4.5 ml完整培养基。磷酸钙DNA沉淀物如前所述制备，每毫升沉淀物使用10μg pBK-tipL1和10μg pGEM DNA(34). 向细胞中添加沉淀（0.5 ml），16 h后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗细胞两次，并用新鲜培养基培养。20小时后，对细胞进行胰蛋白酶消化，并增加稀释度，以允许在G418存在的情况下单个菌落生长，第二天以0.5 mg/ml的浓度添加G418。每隔3至4天用含有G418的新鲜培养基培养细胞，直到可以检测到菌落为止。收集、扩增菌落，并通过免疫印迹分析52/55-kDa蛋白的表达。分离后，通过限制稀释亚克隆了一个表达52/55-kDa蛋白最高水平的阳性细胞系，命名为293-L1。
病毒。
如前所述，在293个细胞上制备Ad5储备(19). H5ts369在52/55-kDa蛋白中含有一个温度敏感性突变，在32°C的293个单层上生长(23). 菌斑分析在37°C下进行，H5ts369分析在32或39.5°C下培养除外。
为了构建H5pm8001，我们采用了Chartier等人描述的细菌重组方案(6). pKpnBΔL1用千磅一、 分离出KpnBΔL1片段（nt8537-14290）。10毫微克纯化的KpnBΔL1片段和10 ng pTG3602，在个人电脑I站点（nt 13258）被共同转换为大肠杆菌BJ5183和电镀在含有氨苄西林的介质上。由于BJ5183质粒DNA的产量太低，无法直接分析，因此将其用于转化DH5α细胞。对从该转化中分离出的质粒（pTG3602ΔL1）的限制性分析表明Spe公司I位点被引入52/55-kDa蛋白ORF中，没有发生重排。293-L1细胞转染1μg派克靴I消化pTG3602ΔL1并监测细胞病变效应（CPE）的发展。11天后，CPE变得明显，此时制备病毒裂解物并在293-L1和293细胞上标记。293个细胞上未检测到斑块。从293-L1细胞中提取两个分离的斑块，并在两个细胞系上进行替换。同样，在293细胞上未检测到斑块，从293-L1细胞中提取的几个分离斑块被用作H5pm8001生长的主砧木。通过修改Hirt描述的程序，从斑块裂解物中制备DNA(26). 将菌斑裂解液调整为0.6%十二烷基硫酸钠（SDS）-10 mM EDTA，并在室温下培养15分钟，然后添加氯化钠至1.5 M，并在4°C下培养过夜。样品在微型离心机中以最高速度旋转10分钟。向上清液中添加10微升（含50毫克简化蛋白酶/ml）和5微升（含有10毫克核糖核酸酶a/ml），样品在37°C下培养1小时，用苯酚萃取两次，用氯仿-异戊醇（24:1）萃取一次，沉淀、洗涤，并在100μl TE（10 mM Tris，1 mM EDTA，pH 8）中重新悬浮。在E1A裂解缓冲液中制备蛋白质样品，并如前所述通过免疫印迹进行分析(21).
病毒生长分析。
一百万个细胞被镀在一个直径为35mm的板上，并允许在一夜之间附着。第二天，通过抽吸培养基并在0.5 ml Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）–2%胎牛血清（FBS）中添加感染倍数（MOI）为0.1的病毒感染细胞。吸附病毒90分钟后，添加2 ml完整培养基。通过用PBS洗涤细胞两次并在0.25 ml DMEM–2%FBS中重新悬浮，然后进行三次冻融循环，制备病毒裂解物。如上所述，在293-L1或293细胞上标记裂解产物。
感染时间进程分析。
用于分析RNA的感染106细胞，而分离DNA和蛋白质的感染需要5×105细胞。将细胞进行胰蛋白酶解，以250×克5分钟后，在完全培养基中重新悬浮，并在血细胞仪中计数。细胞再次以250×克5分钟，10分钟后重新悬浮7DMEM中的细胞/ml–含2%FBS的病毒，MOI为10。允许病毒在37°C下吸附20分钟，偶尔混合，然后添加1 ml完整培养基和平板。在感染后的指定时间，用PBS清洗细胞两次，然后收获细胞。对于免疫印迹分析，如前所述，通过在25μl E1A裂解缓冲液中裂解细胞来制备全细胞裂解物(21). 前面已经描述了识别52/55-kDa蛋白的兔多克隆抗血清以及针对IVa2和72-kDa DNA结合蛋白的小鼠单克隆抗体的制备(21,37,54). 纤维蛋白多克隆兔抗体是P.Hearing和C.Anderson赠送的礼物。
使用上述改良的Hirt程序制备病毒DNA，并通过Southern印迹法进行分析。样品用消解千磅我和Spe公司一、 在0.8%琼脂糖凝胶上电泳，转移到Zetaprobe膜上（加州Hercules的Bio-Rad实验室），并在0.5 M NaHPO中预混合4–1 mM EDTA–7%十二烷基硫酸钠（pH 7.2），在65°C下保持1小时。使用pTG3602和随机引物标记试剂盒（马里兰州盖瑟斯堡生命科技公司）合成放射性标记的Ad5特异性探针，并在使用前立即煮沸。去除预混合溶液，并去除含有探针（10）的新鲜溶液6cpm/ml）加入到膜中，并在65℃下孵育过夜。在室温下用2×SSC（1×SSC为0.15 M NaCl加0.015 M柠檬酸钠）冲洗两次膜，用40 mM NaHPO冲洗两次4（pH 7.2）–1 mM EDTA–5%十二烷基硫酸钠，65°C下30分钟，使用40 mM NaHPO两次4（pH 7.2）-1 mM EDTA–1%十二烷基硫酸钠，在65°C下放置30分钟，吸干，暴露于薄膜中。结合探针的数量在磷成像仪中进行了定量（加利福尼亚州森尼维尔市分子动力学公司）。
通过Chomczynski和Sacchi方法分离RNA(8)但所有体积都减少了75%。将RNA沉淀，再悬浮在0.1 ml TE中，并通过测量260 nm处的光密度进行定量。聚乙烯（A）+如前所述，从16μg总RNA中纯化RNA(13). 四分之一聚乙烯（A）+RNA在甲醛变性凝胶上电泳并转移到Zetaprobe尼龙膜上。预杂交、杂交和洗涤与上述Southern分析相同。用于合成核糖探针的质粒用Hin公司dIII用苯酚提取一次，用氯仿-异戊醇（24:1[32P] UTP、10μM UTP和0.5 mM（每个）ATP、CTP和GTP，然后添加1 U无RNase DNase I，并在37°C下再培养15分钟。用苯酚和氯仿-异戊醇（24:1）分别提取一次核糖体，并在G50快速旋转柱中纯化（Boehringer Mannheim Corp.，Indianapolis，India）添加到膜之前。
透射电子显微镜。
按照上述时间进程分析进行电子显微镜分析感染。感染后40 h，用PBS冲洗细胞两次，在2%缓冲戊二醛中固定1 h，用1%缓冲四氧化锇后固定1 h、脱水，并用Epon环氧树脂渗透。然后对所得块进行切片，用柠檬酸铅和醋酸铀酰对含有超薄切片的网格进行双重染色，并使用60 kV操作的Philips CM-100透射电子显微镜进行检查。
组装中间体的净化。
H5pm8001感染在MOI为5时进行；所有其他感染的MOI均为10。H5ts369感染在39.5°C下进行；其他所有温度均为37°C。感染后48小时，2×108细胞以250倍离心克，用PBS清洗，并在5 ml 10 mM Tris中重新悬浮，pH值为8。细胞通过三个冷冻和解冻循环进行裂解，并在1500×克持续15分钟，将上清液分层到28毫升梯度梯度上，梯度梯度由14毫升1.45克/厘米三CsCl溶液低于14 ml 1.2g/cm三CsCl溶液。病毒在SW28转子中以72000×克2小时后，收获并分层放置在预制件上（1.2至1.45 g/cm三)CsCl梯度并在SW41转子中以68500×克离心16h后，从梯度中收集组分，并使用Bio-Read蛋白检测试剂盒分析蛋白质含量，以确定病毒颗粒的位置。用折射计测定单个组分的密度。
为了分析蛋白质成分，将颗粒直接加入样品释放缓冲液中(21)，在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并使用凝胶代码银染色试剂盒（皮尔斯化学公司，伊利诺伊州罗克福德）或免疫印迹法直接观察。将病毒颗粒的DNA稀释到0.3 ml的蛋白酶消化缓冲液（2 mg简化的蛋白酶/ml，50 mM Tris，1 mM EDTA，0.5%SDS，pH 7.5）中，并在37°C下培养1 h，偶尔混合，从而从病毒颗粒中分离出DNA。样品用苯酚萃取两次，用氯仿-异戊醇（24:1）萃取一次，沉淀，用70%乙醇洗涤，干燥，并在水中重新悬浮。南方分析如上所述。
结果
293-L1辅助细胞系的构建。
以前的工作已经证明，腺病毒52/55-kDa蛋白是组装病毒颗粒所必需的(23)表明52/55-kDa蛋白缺失突变病毒的繁殖需要分离互补细胞系。为了生成表达52/55-kDa蛋白的细胞系，图。A转染293细胞。我们在ORF的5′端包含一个腺病毒三分体先导的cDNA，目的是在腺病毒感染期间增加52/55-kDa蛋白的表达。三部分先导是一个210-bp的序列，在感染后期剪接到MLP产生的所有mRNA的5′端，已被证明可以增强这些mRNA从细胞核的转运及其随后的翻译(2,28,36). 图B显示，52/55-kDa蛋白在293-L1细胞制备的裂解物中可检测到，293-L1细胞是用pBK-tripL1转染293细胞后分离的克隆细胞系，而在未转染细胞中未检测到。与晚期Ad5感染的293细胞裂解物相比，该细胞系中表达的52/55-kDa蛋白水平至少是正常腺病毒感染期间的10%。为了证实293-L1细胞中52/55-kDa蛋白的表达水平足以用有缺陷的52/55-kDa蛋白来补充病毒，我们检测了H5ts369在非许可温度下在293-L1细胞上生长的能力。虽然H5ts369在293细胞中的复制严格依赖于温度，但H5ts3659在非允许温度下在293-L1细胞中的生长几乎与在允许温度下的生长一样好（表). 这些结果表明，293-L1细胞表达52/55-kDa蛋白的水平接近腺病毒感染时的水平，这足以补充表达缺陷52/55-kDa蛋白病毒。
表1
| 细胞系 | 滴定度（PFU/ml）一
|
|---|
| 32摄氏度 | 39.5摄氏度 |
|---|
| 293升1 | 1.3 × 1010 | 1.1 × 1010 |
| 293 | 1.5 × 1010 | 6.3 × 105 |
隔离下午8001
我们采用了Chartier等人描述的细菌重组系统(6)在52/55-kDa蛋白ORF（pTG3602ΔL1，图。C） ●●●●。除了在18、20和21位引入终止密码子外，这些突变还产生了一个Spe公司我的网站。我们通过将突变ORF克隆到pBK-CMV表达载体并将其转染到293细胞中，证实了这些突变阻断了52/55-kDa蛋白的表达。对转染细胞裂解物的分析没有发现任何可检测的52/55-kDa蛋白，而转染野生型ORF的细胞产生易于检测的水平（数据未显示）。通过消化pTG3602ΔL1和派克靴I并将其转染至293-L1细胞。两轮斑块纯化后，从几个分离的斑块中制备病毒DNA，并通过PCR分析是否存在Spe公司52/55-kDa蛋白ORF中的I位点（图。). pTG3602或pTG3601ΔL1的扩增产生预期的1-kb片段，跨越52/55-kDa蛋白ORF的5′端，但只有从pTG3603ΔL_1扩增的产物可被消化Spe公司I（比较12号和14号车道）。对来自两个独立菌株的许多不同斑块的分析表明，所有菌株都具有预期的Spe公司我在52/55-kDa蛋白ORF中定位，证实已分离出重组腺病毒的克隆群体。这些结果表明，已分离出一种含有52/55-kDa蛋白ORF预期突变的突变腺病毒，命名为H5pm8001。
斑块分离物的PCR分析。从斑块分离物中制备病毒DNA，并使用引物B和C进行PCR分析（图。). 样品要么直接分析（车道−），要么调整为5 mM MgCl2并用0.5 U的Spe公司在1.2%琼脂糖凝胶上电泳之前，I（lanes+）。pTG3602ΔL1和pTG3602分别指示来自突变体或野生型质粒的扩增。未感染，从未感染的293-L1细胞制备的DNA扩增。Lane M，1-kb分子量标记。
为了证实病毒基因组上的突变阻断了52/55-kDa蛋白的表达，我们将两个H5pm8001分离株感染到293或293-L1细胞中，并检测全细胞裂解物中是否存在52/55-kDa蛋白。图A显示，正如预期的那样，在所有测试的293-L1细胞裂解物中检测到52/55-kDa蛋白。然而，当293个细胞被H5pm8001的任一分离物感染时，未检测到52/55-kDa蛋白（第2和第3道），这证实了下午8001确实阻断了52/55-kDa蛋白的表达。为了证明H5pm8001确实感染了细胞，对裂解物进行了病毒E2A 72-kDa DNA结合蛋白（72K蛋白）的检测。图B显示，所有感染细胞裂解物对72K蛋白均呈阳性，证实52/55-kDa蛋白的表达存在特异性阻滞。
H5pm8001感染293和293-L1细胞的免疫印迹分析。从未感染（−）或H5pm8001感染（+）293和293-L1细胞制备全细胞裂解物。用所示抗体通过免疫印迹分析每种裂解物的50微克。（A） 用52/55-kDa蛋白抗体进行分析。（B） 将A组中的印迹剥离，并用E2A 72-kDa DNA结合蛋白（72K）抗体进行重制。
H5pm8001的生长特性分析表明，病毒生长明显依赖于52/55-kDa蛋白的共表达。图表明当293个细胞感染H5pm8001时，病毒产量不超过10三PFU/ml，即使允许感染持续5天。相反，当293-L1细胞感染H5pm8001时，产量为108仅在48小时后即可获得PFU/ml。当将生长在293-L1细胞中的H5pm8001在293和293-L1细胞上的定位效率进行比较时，观察到3-4个对数的差异。比较plaquing效率时观察到的较小差异很可能是由于与293-L1细胞中存在的52/55-kDa蛋白编码序列重组而产生的野生型回复体的出现。为了支持这一点，对在293-L1细胞中长时间传代后制备的H5pm8001裂解物进行PCR分析表明，这些裂解物中的一部分病毒已经失去了Spe公司当这些裂解物被用于感染293细胞时，可通过免疫印迹检测到位于52/55-kDa ORF的I位点和52/55-kDa蛋白（数据未显示）。用于下述实验的所有H5pm8001库存经PCR检测为野生型腺病毒阴性，在293细胞上的滴度比293-L1细胞上的至少低4 log，在292细胞中未产生可检测的52/55-kDa蛋白。
H5pm8001的生长特性。用H5pm8001感染293或293-L1细胞，每隔24小时制备病毒裂解物，共5天。然后在293和293-L1细胞上测定这些裂解物的滴度。棒状物的标记对应于制备裂解物的细胞系，然后是对其进行效价的细胞系。在24小时或120小时时未对293/293样品进行分析。
病毒基因表达和DNA复制下午8001-感染细胞。
如上所述，52/55-kDa蛋白在感染期间的早期表达表明，它除了在组装中显示的作用外，还可能具有其他功能。特别是，因为IVa2蛋白是MLP的转录激活物(62)，52/55-kDa蛋白和IVa2蛋白之间的相互作用可能对感染期间基因表达的适当调节很重要。因为DNA复制是进入感染晚期和MLP激活的先决条件(60)，我们比较了感染H5pm8001或Ad5的293个细胞中病毒DNA复制的开始和程度。图结果显示，在Ad5和H5pm8001感染后12小时检测到复制的病毒DNA。尽管在该实验中，H5pm8001在感染后12小时产生的DNA比Ad5更多，但在其他实验中，这种差异并不明显。尽管感染后12小时H5pm8001 DNA相对丰富，但到感染后18小时，Ad5感染始终包含更多的病毒DNA（与第9和第12通道相比）。在两个独立的实验中，对感染后18小时的病毒DNA数量进行了定量分析，结果表明，与H5pm8001感染的293个细胞相比，Ad5细胞中积累的DNA平均多4倍。当293-L1细胞感染H5pm8001时，这种差异并不明显（将通道1至3与通道7至9进行比较）。这些结果表明，尽管H5pm8001感染的293细胞中病毒DNA复制的开始没有受到影响，但病毒DNA的积累水平并没有达到野生型Ad5感染中的水平。
病毒DNA复制分析。用H5pm8001或Ad5感染293或293-L1细胞，并在感染后指定小时（hpi）制备病毒DNA。DNA用千磅我和Spe公司Southern使用放射性标记的Ad5特异性探针进行了分析。箭头指示千磅B片段（nt 8527至11311）被Spe公司从H5pm8001感染中分离出的DNA中含有I。
接下来，我们想确定52/55-kDa蛋白的缺失是否会导致病毒基因表达的任何重大缺陷。在本实验中，用免疫印迹法检测H5pm8001感染或Ad5感染293细胞在感染后不同时间制备的蛋白裂解物中是否存在早期和晚期病毒蛋白。图A显示，正如预期的那样，在H5pm8001细胞裂解液中未检测到52/55-kDa蛋白，而在Ad5感染后的12小时内可检测到该蛋白。使用E2A 72K蛋白抗体对早期基因表达进行分析，结果显示H5pm8001感染细胞和Ad5感染细胞293之间没有重大差异（图。B） ●●●●。对IVa2表达的分析表明，尽管在两种病毒感染中同时检测到IVa2，但在H5pm8001感染细胞中积累的IVa2明显较少（图。C、 将车道4至7与车道10至13进行比较）。类似地，两种病毒感染后18小时均可检测到纤维蛋白，但H5pm8001感染中的纤维蛋白生成量始终低于Ad5感染（图。D、 将车道4至7与车道10至13进行比较）。这些结果表明，52/55kDa蛋白不是晚期蛋白表达所必需的，但对于达到野生型感染期间所见的晚期蛋白合成水平是重要的。
病毒蛋白在H5pm8001感染的293细胞中的表达。使用52/55-kDa蛋白（52/55K）（A）、E2A 72-kDa DNA结合蛋白（72K）（B）、IVa2蛋白（C）和纤维蛋白（D）抗体，通过免疫印迹分析在感染后指定时间感染H5pm8001或Ad5的293细胞制备的25微克全细胞裂解物。hpi，感染后小时数。面板B中迁移速度较快的带是72K蛋白的降解产物(54). 分子量标记的位置显示在左侧。
为了确定H5pm8001晚期蛋白积累的减少是否与转录减少相关，我们检测了与E2A、IVa2、L3和L1基因产物家族相对应的病毒RNA的稳态水平。对H5pm8001和Ad5感染的293细胞中E2A转录物的分析表明，这些mRNA的出现或积累时间没有重大差异（图。A） ●●●●。感染后18小时，在H5pm8001或Ad5感染细胞中检测到IVa2、L3和IIIa mRNA，并在两种感染中累积到大致相同的水平（图。B、 C和D）。虽然没有显著差异，但从该分析中可以明显看出的一个差异是，H5pm8001感染晚期开始时，晚期mRNA的丰度低于Ad5感染（图中第3和第8通道的比较）。B、 C和D）。在标准化到E2A转录物水平后，在感染后18小时，H5pm8001中的晚期mRNA比Ad5感染的细胞中少30%至40%，而在随后的时间，它们积累到相同或更高的水平。这种差异在多个独立实验中很明显，可以解释H5pm8001感染的293细胞裂解液中观察到的晚期蛋白水平较低（图。). 从该分析中明显的另一个差异是，在H5pm8001感染的293细胞中未检测到与52/55-kDa蛋白对应的mRNA（图。D和E）。尽管缺乏可检测的52/55-kDa蛋白mRNA，IIIa转录物似乎在H5pm8001感染中没有早期或更高水平的表达。这些结果表明，52/55-kDa蛋白对病毒基因表达的正确时间调控不是必需的，但它确实有助于在感染早期到晚期的过渡阶段充分激活晚期基因表达。
H5pm8001感染293细胞产生的RNA分析。聚乙烯（A）+在指定时间从感染H5pm8001或Ad5的293个细胞中制备RNA，并使用E2A mRNA（A）、IVa2 mRNA（B）、L3 mRNA（C）和L1 mRNA（D）特异性探针通过Northern印迹分析。（E） 图D中印迹的较长暴露时间表明H5pm8001感染中52/55kDa蛋白mRNA的缺乏。hpi，感染后小时数。
分析下午8001组装中间体。
由于H5pm8001能够从感染早期过渡到晚期并表达晚期蛋白，我们接下来使用透射电子显微镜检查H5pm800感染的293细胞中是否形成了组装中间体。图A显示H5pm8001感染的293细胞中可见衣壳样结构。与Ad5感染细胞中的衣壳不同，Ad5感染的细胞中含有一个深色染色的核心，H5pm8001感染的293细胞中衣壳的染色较浅，表明它们缺乏核心成分（对比图。E与B和C）。对H5pm8001感染的293-L1细胞的分析显示，大量的深染衣壳结构与Ad5感染细胞中的衣壳结构更为相似（图。D） ●●●●。H5pm8001感染的293细胞中轻染衣壳结构的外观与之前报道的H5ts369类似(23)并表明，与那些对温度敏感的突变株一样，H5pm8001衣壳不包含完整的病毒DNA补体。
H5pm8001感染细胞的透射电子显微镜。（A、B和C）感染H5pm8001的293细胞。（D） 感染H5pm8001的293-L1细胞。（E） 293个细胞感染了Ad5。面板A中的放大倍数，×25000。放大板D至E，×46000。棒材，300 nm。
通过使用CsCl梯度进行纯化和密度测定，进一步对中间体进行了表征。正如预期的那样，从Ad5感染的293细胞中纯化出两种不同的病毒颗粒：较重的颗粒（1.34 g/cm三)与成熟病毒粒子相对应，而较轻的粒子（1.29 g/cm三)代表空衣壳(39,51,55). 对H5pm8001感染的293-L1细胞的分析也显示出密度为1.34 g/cm的颗粒三和1.29克/厘米三然而，对H5pm8001感染的293细胞中的颗粒进行表征后，发现只有一个密度为1.29 g/cm的颗粒群三对293个在非容许温度下感染的细胞的H5ts369中间体的检查表明，正如先前发表的那样，这些细胞积累的颗粒比空衣壳稍密，中值密度为1.31g/cm三(23). 无密度大于1.29 g/cm的颗粒三在H5pm8001感染的293细胞中检测到，表明与H5ts369的表型略有不同。
先前的研究表明，在非许可温度下形成的Ad5空衣壳和H5ts369中间产物的蛋白质组成没有明显差异(23). 为了确定在没有52/55-kDa蛋白的情况下形成的中间产物是否与Ad5空衣壳或H5ts369中间产物有任何重大差异，我们通过银染色分析了纯化颗粒的蛋白质组成。对从Ad5-、H5pm8001-和H5ts369-感染的293细胞纯化的中间产物的分析表明，所有中间产物似乎都含有己糖、戊糖碱和纤维（图。). 如前所述，在空衣壳和H5ts369中间产物中发现的蛋白质非常相似。与H5pm8001中间产物的比较表明，这些颗粒的蛋白质组成没有重大差异；然而，一些蛋白质的相对丰度似乎发生了变化。值得注意的是，H5pm8001中间产物始终比H5ts369中间产物含有更多的pVII。此外，在H5ts369和Ad5中间体中都很容易检测到表观分子大小为70kDa的蛋白质，但在H5pm8001颗粒中含量要低得多。在所有实验中，并没有一致地检测到车道2和3中可见的90-kDa蛋白。这些结果表明，H5pm8001中间产物和感染Ad5或H5ts369期间形成的中间产物具有非常相似的蛋白质组成。
H5pm8001中间产物的蛋白质组成分析。通过两轮CsCl梯度离心纯化颗粒，并通过银染色进行分析。车道：下午8001，H5pm8001感染293细胞的中间产物；由Ad5感染的293细胞制备的MV和EC、成熟病毒和空衣壳；ts秒369，在39.5°C下从H5ts369感染的293细胞制备的颗粒。成熟病毒粒子的几种成分的特性是根据它们在凝胶中的流动性来确定的。箭头表示文本中描述的70-kDa蛋白质，分子量标记显示在左侧。
因为我们之前已经证明IVa2和52/55-kDa蛋白在感染期间相互作用(21)，我们检测了IVa2蛋白是否被纳入H5pm8001感染的293细胞的组装中间体中。从H5pm8001-、Ad5-和H5ts369-感染的293细胞制备的纯化颗粒通过免疫印迹检测IVa2蛋白的存在。图A表明在成熟病毒和Ad5空衣壳中可以检测到IVa2蛋白。对H5ts369中间产物的分析表明，IVa2蛋白被并入这些颗粒中，表明H5ts3659中的突变并不影响IVa2并入病毒。最后，对H5pm8001中间产物的分析表明，在没有52/55-kDa蛋白的情况下，IVa2蛋白被并入衣壳。有趣的是，成熟病毒显示出第二条免疫反应带，其迁移速度略快于在空衣壳、中间产物或全细胞裂解物中检测到的速度。这表明IVa2蛋白是在病毒组装过程中加工的，可能解释了之前报道的IVa2蛋白质（56kDa）大小与从病毒中分离出的50kDa蛋白质之间的差异，该病毒通过胰蛋白酶肽图谱鉴定为IVa2(50,67). 为了证实在Ad5成熟病毒中看到的IVa2的处理不是由于纯化颗粒的一般降解，我们分析了图中所示的免疫印迹。A带有纤维蛋白抗体。图B表明，在任何颗粒中均未发现纤维降解，证实了图中所示的结果。A对IVa2蛋白具有特异性。正如预期的那样，用52/55kDa蛋白抗体对这些颗粒的分析证实，它存在于Ad5和H5ts369中间体中，但不存在于成熟的病毒粒子和H5pm8001中间体中（图。C） ●●●●。
H5pm8001中间产物的免疫印迹分析。纯化病毒颗粒并用所示抗体进行分析。车道：下午8001，H5pm8001感染293细胞的中间产物；由Ad5感染的293细胞制备的MV和EC、成熟病毒和空衣壳；ts秒369，由39.5°C下感染H5ts369的293个细胞制备的颗粒。（A） 抗IVa2免疫印迹。（B） 抗纤维免疫印迹。（C） 抗-52/55-kDa蛋白免疫印迹。Ad，感染后20小时由Ad5感染的293细胞制备的全细胞裂解物；293，未感染的全细胞裂解物。
在非许可温度下形成的H5ts369中间产物的特征表明，这些颗粒与空衣壳不同，因为它们与病毒基因组的左端有关(23). 由于H5pm8001感染的293细胞中发现的中间产物似乎与空衣壳具有相同的密度，我们检查了它们是否与任何病毒DNA相关。从Ad5、H5pm8001和H5ts369中间产物中制备病毒DNA，用千磅我和克拉一、 并用腺病毒特异性探针进行Southern印迹分析。克拉我在靠近病毒基因组左端的nt982处切割Ad5。从H5ts369中间产物中分离出的DNA裂解显示出一条与左端衍生的DNA相对应的优势带克拉I片段，确认这些颗粒与病毒基因组左端的关联（图。，泳道3）。尽管空衣壳显示了少量相关病毒DNA，但整个基因组都被呈现出来了（第2条线）。空衣壳中DNA的检测很可能是由于这些制剂受到少量成熟病毒的污染。我们在这些制剂中检测到少量核心蛋白pVII和VII的能力证实了这一点（数据未显示）。对H5pm8001中间产物的分析未能揭示任何相关的病毒DNA，即使在长时间接触印迹后（图。B） 表明52/55-kDa蛋白是病毒基因组与空衣壳稳定结合所必需的。
与H5pm8001中间产物相关的病毒DNA分析。病毒DNA由纯化颗粒制备，用千磅我和克拉一、 并由Southern使用Ad5特异性探针进行分析。车道：下午8001，H5pm8001感染293细胞的中间产物；由Ad5感染的293细胞制备的MV和EC、成熟病毒和空衣壳；ts秒369，由39.5°C下感染H5ts369的293个细胞制备的颗粒。（B） 面板A中显示的污点暴露时间更长，通道1已拆除。箭头表示左端特定克拉我的碎片。
讨论
在本报告中，我们描述了一种腺病毒的分离和特性，该腺病毒含有一种突变，可阻断52/55 kDa蛋白H5pm8001的表达。正如预期的那样，H5pm8001的成功繁殖需要产生一种辅助细胞系，该细胞系能够提供52/55-kDa蛋白反式我们对H5pm8001在293细胞中在病毒生命周期中进展的能力的分析为52/55kDa蛋白在感染过程中的作用提供了一些见解。首先，52/55-kDa蛋白不需要进入感染后期。其次，感染后期MLP的完全激活不需要52/55-kDa蛋白。第三，空衣壳结构的形成不需要52/55-kDa蛋白，这表明它在组装过程中不起支架蛋白的作用。最后，无法检测与H5pm8001感染的293细胞中形成的衣壳相关的DNA，这有力地证明52/55-kDa蛋白对于病毒基因组与空衣壳之间的关联或封装过程本身至关重要。
52/55-kDa蛋白的早期出现表明它可能在感染早期具有额外功能(23). 此外，对各种明显旨在确保52/55-kDa蛋白早期表达的调控机制的鉴定也加强了这一论点(12,16,18,30,57,66). 然而，我们对H5pm8001感染的293细胞的分析并未揭示早期对52/55-kDa蛋白的需求：对E2A 72K蛋白或RNA的表达没有影响。此外，通过检测DNA复制和基因表达的开始，H5pm8001感染的293细胞与Ad5感染的细胞同时从感染早期向感染晚期过渡。然而，对DNA复制和晚期基因表达的分析确实揭示了H5pm8001感染和Ad5感染293细胞之间的一些差异。首先，随着感染的进展，H5pm8001感染的293细胞积累的病毒DNA较少（感染后18小时为Ad5感染细胞的25%）。这种差异在早期或H5pm8001感染293-L1细胞时不太显著或不明显。第二，用纤维和IVa2蛋白抗体进行免疫印迹测定，H5pm8001感染中合成了较低水平的晚期蛋白。对这一发现的一个可能解释是，52/55-kDa蛋白稳定了感染后期产生的蛋白质，从而使其积累到较高水平。然而，为检验这种可能性而设计的脉冲相实验表明，在H5pm8001感染或Ad5感染的293细胞中，IVa2蛋白的半衰期没有差异。第三，Northern分析显示，尽管在H5pm8001和Ad5感染中，L3、L1和IVa2 mRNA可以在感染后18小时检测到，但此时它们在H5pm8001感染中的丰度始终较低（野生型水平的60%至70%）。尽管在感染后18小时出现了明显的差异，但这些mRNAs在感染这两种病毒的后期积累到了相似的水平。
有趣的是，已经报道了含有MLP元件突变的腺病毒的类似表型。MLP的初步特征表明它是一个由TATA盒和上游启动子元件（UPE）组成的相对简单的启动子(三). UPE是一个顺式-作用序列元件，在感染后期由一种称为USF/MLTF的因子特异性结合，在将MLP从病毒基因组中的自然环境中移除的结构中，需要该元件来实现完整的转录活性(25,27,41,56). Reach等人描述了一种腺病毒（H5USF0）的构建，该腺病毒包含UPE中的点突变，可消除USF的结合，并在体外损害MLP的转录(52). 然而，对H5USF0感染的HeLa细胞中MLP的转录分析显示，在感染后12小时仅出现两倍的下降，而在感染后24小时不再明显(52). 他们的发现表明MLP的激活涉及多个部分冗余的，顺式-作用的DNA序列元件，以及对MLP的后续分析已经确定了一个CAAT盒，以及MAZ和Sp1结合位点，以及一个有助于激活MLP的下游元件（DE）(35,40,49,52,53).
DE由位于MLP下游的两个DNA序列元件DE1和DE2组成，分别与蛋白质复合物DEF-A和DEF-B结合(31,32,42,43,62). 这些复合物的纯化表明，DEF-B由IVa2同源二聚体组成，而DEF-A由IVa1和一个未知的40-kDa蛋白组成(32,62). 我们证明IVa2和52/55-kDa蛋白质相互作用(21)，结合52/55kDa蛋白的主要降解产物之一是40kDa的观察结果(22)，表明这可能是DEF-A综合体中IVa2的功能合作伙伴。虽然下游元件是体外充分激活MLP所必需的，但对含有突变DE1位点的腺病毒的分析并未显示MLP的任何转录缺陷，这表明下游元件也可能是功能冗余的(53). 然而，应该注意的是，该突变体并没有破坏DE2位点，DE2位点也包含DEF-a结合位点，因此有可能在该突变体中通过与DE2位点的相互作用提供DEF-a功能(43,53).
尽管H5pm8001与含有单个MLP元件突变的腺病毒相似，但也存在一些差异。虽然H5USF0在感染后12小时的DNA复制减少了两倍，但在以后的时间里，DNA积累到野生型水平(52). H5pm8001在感染后18小时DNA复制下降了四倍，这在早期并不明显。H5pm8001感染细胞中晚期蛋白水平较低的一个可能解释是，可用于转录机制的病毒模板较少。这种解释可以解释感染后18小时观察到的L3、IVa2和IIIa转录物水平较低，但与以后检测到的这些mRNAs的等量不一致。此外，在H5pm8001感染的后期，E2A 72K蛋白和mRNA水平未受影响，这表明，至少在这种情况下，病毒mRNA和蛋白的积累与模板浓度无关。H5pm8001和H5USF0之间最显著的差异是H5USF0突变只影响MLP的转录(52). 我们的分析表明，在H5pm8001感染的293细胞中，转录水平的降低不仅限于MLP，还扩展到IVa2启动子。IVa2转录起始位点与MLP起始位点分离210 bp，并且这两个位点是不同转录的。IVa2启动子的体外分析表明与MLP调节元件存在一定程度的重叠，影响MLP活性的突变也会影响IVa2的启动子活性(7,44–46). 有趣的是，IVa2启动子的特征没有包括延伸到DE的序列，因此不能排除这些序列以及52/55-kDa蛋白在IVa2发起子激活中的作用。
H5pm8001感染的293细胞中形成的中间产物的特征表明，形成的颗粒密度与空衣壳的密度相同（1.29 g/cm三). 这与H5ts369形成对比，H5ts3659积聚了密度为1.31 g/cm的颗粒三(23). 此外，将H5pm8001中间产物的多肽组成与Ad5空衣壳和H5ts369中间产物的肽组成进行比较，发现了一些细微的差异。Ad5空衣壳和H5ts369中间产物含有一种表观分子大小为70kDa的多肽，在H5pm8001中间产物中含量低得多。先前的报告显示腺病毒衣壳组分与hsp70相互作用，这表明该蛋白可能是同一蛋白(38,48). 从该分析中可以明显看出的另一个差异是，H5pm8001中间产物始终显示出比H5ts369中间产物或空衣壳更多的pVII。D’Halluin等人报告说，尽管pVII存在于所有梯度组分中，但它只能与年轻的病毒粒子交联，这表明它与这些粒子有特异性关联(14). 由于H5pm8001中间产物的密度和蛋白质组成与之前报道的空衣壳非常相似(39)，这表明pVII的丰度是由于与下午8001个中间体。
H5ts369的表征表明52/55kDa蛋白在组装过程中可能发挥多种作用。观察到52/55-kDa蛋白存在于组装中间体中，但在成熟病毒中不存在，这表明它可能具有支架蛋白的功能(22). 在其他病毒系统中，支架蛋白的突变或消除会导致衣壳形成完全缺失或出现异常衣壳结构(5,11,59,61). 在H5pm8001感染的293细胞中发现了正常的衣壳结构，这表明52/55-kDa蛋白很可能在衣壳组装过程中不起支架蛋白的作用。在非许可温度下，与H5ts369感染的HeLa细胞中形成的中间产物相关的病毒DNA的特征表明与病毒基因组的左端有关(23). 这表明52/55-kDa蛋白参与了DNA和衣壳之间的结合或DNA包装。先前对一种包装信号缺失的腺病毒（H5dl309-A5）进行分析的工作表明，病毒包装信号是衣壳组装所必需的。感染H5dl309-A5的细胞会积累正常水平的病毒DNA和晚期蛋白，但不会产生空衣壳(22,24). 据推测，这反映了衣壳组件与包装信号之间相互作用的要求，包装信号启动组装过程并形成空衣壳。无法检测与空衣壳相关的DNA表明衣壳组分和包装信号之间的初始相互作用相对不稳定或短暂。如果这个模型是正确的，那么H5pm8001感染的293细胞中出现的空衣壳表明52/55-kDa蛋白在包装信号和衣壳成分之间的初始相互作用之后发挥作用。
上述结果表明，52/55-kDa蛋白是病毒DNA和衣壳稳定结合所必需的。这与52/55-kDa蛋白在病毒基因组包被中的作用一致。尽管对腺病毒染色体插入空衣壳的机制知之甚少，但这一事件很可能需要包装信号结合因子和衣壳成分之间的相互作用(4). 我们推测IVa2和52/55-kDa蛋白之间的相互作用与病毒基因组的包装有关。这将是有趣的，以检查这些蛋白，单独或组合，是否有任何亲和力的腺病毒包装信号。
致谢
我们感谢帝国实验室成员在整个工作过程中提出的有益意见和建议；埃尔·罗伯逊批判性阅读手稿；Tom Shenk代表H5ts369；pTG3602的转基因S.A；以及阿妮·莱文、克洛德·凯丁格、卡尔·安德森和帕特里克·听力检查各种抗体。
这项工作得到了麻省理工学院公共卫生服务拨款GM34902和密歇根大学综合癌症中心核心拨款P30 CA46592的支持。K.E.G.的部分资助来自密歇根大学的Horace Rackham博士前奖学金。
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