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《维罗尔杂志》。1998年10月；72(10): 7830–7839.
数字对象标识：10.1128/jvi.72.10.7830-7839.1998年
预防性维修识别码：项目经理110100
PMID：9733819

白细胞介素-1β转化酶抑制剂Serp2在粘液瘤病毒的病理生物学中起关键作用

弗雷德里克·梅苏德·佩蒂特,1 杰奎琳·盖菲,1 Maxence Delverdier公司,2 Marie-France阿马尔代尔,2 罗伯特·派,1 格德·萨特,三和斯蒂芬·贝尔塔尼奥利1,*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

最近，黏液瘤病毒被证明编码了蛇蛋白超家族的另一个成员。这种病毒基因叫做蛇2Serp2蛋白与白细胞介素-1β（IL-1β）转化酶（ICE）特异性结合，从而抑制蛋白酶对前IL-1β的裂解（F.Petit、S.Bertagnoli、J.Gelfi、F.Fassy、C.Boucraut-Baralon和A.Milon，J.Virol.70:5860-58661996）。在这里，我们探讨了Serp2在粘液瘤病（一种欧洲兔子的致命传染病）发展中的作用蛇2基因和插入大肠杆菌gpt作为选择标记的基因。通过替换大肠杆菌gpt完整的基因塞尔维亚语2打开阅读框。Serp2−兔成纤维细胞和兔CD4中野生型动力学复制的突变病毒+T细胞系（RL5）。感染野生型或Serp2后，观察到主要组织相容性复合体I的细胞表面水平中度降低−突变型粘液瘤病毒，两者都在鸡胚绒毛尿囊膜上产生白色麻点。欧洲兔感染后，Serp2−从粘液瘤病的临床病程和感染动物的存活率来看，与野生型粘液瘤病毒相比，突变病毒被证明具有高度的减毒作用。病理组织学检查显示，野生型粘液瘤病毒感染导致血管水平的炎症反应被阻断。相反，Serp2感染后发生快速炎症反应−变异病毒。此外，接种Serp2突变病毒的动物淋巴结中的淋巴细胞显示出快速凋亡。我们推测，粘液瘤病毒在欧洲兔体内的毒性可部分归因于宿主炎症过程的损伤和淋巴细胞凋亡的预防。东道主防御能力的削弱与蛇2基因功能，可能涉及抑制IL-1β转化酶依赖性途径。

病毒在免疫活性宿主体内生存需要多种防御策略来逃避抗病毒和炎症反应。痘病毒是最大的动物病毒之一，已开发出特定而有效的策略，包括干扰细胞因子和生长因子、抑制补体级联、减少炎症和抑制细胞免疫识别，以在受感染宿主内有效传播(三,38,47,57,60).

痘病毒的基因组是一个线性大的双链DNA分子，除了毒力因子外，还编码DNA复制和转录所需的所有酶。虽然必需基因位于基因组的中心部分，但负责毒力和宿主范围（通常不是必需的）的基因大多位于末端附近(17,65,66). 一些病毒蛋白通常通过模拟细胞因子或细胞因子受体来帮助规避宿主免疫反应。痘病毒产生肿瘤坏死因子（TNF）受体的同源物(27,56)，白细胞介素-1β（IL-1β）受体(2,59)γ-干扰素（IFN-γ）受体(4,5,61,69)和趋化因子抑制剂(25,55). 痘病毒还能够通过抑制加工所需的酶来阻止一些重要细胞因子的产生。这就是正痘病毒SPI-2蛋白（也称为CrmA）是IL-1β转化酶（ICE）抑制剂的属成员(33,48,50,58,64).

之前，我们描述了Serp2的克隆和特性，Serp2是一种新的粘液瘤病毒编码的与CrmA密切相关的蛇蛋白(46). 粘液瘤病毒（MV），该属的一个成员Leporipox病毒，是粘液瘤病的罪魁祸首，这种疾病对欧洲兔子来说是致命的(美洲大羚羊). 感染后几天的潜伏期过后，皮内接种的主要部位演变为以组织变性和坏死为特征的病变。病毒传播导致皮肤、头部和生殖器区域的症状普遍化，并导致鼻粘膜和结膜粘膜的革兰氏阴性感染(20,37). 该病的特点是细胞免疫的一般性功能障碍和宿主细胞因子网络的多次中断，最常见的结果是由于极度虚弱和继发性呼吸道感染导致死亡。

许多MV蛋白被描述为毒力因子，包括M-T1(25)，M-T5(39)，M-T7(40)，M-T2(69)、SERP-1(34,67)，M11L(45)和粘液瘤生长因子(45); 其中大多数是直接干扰宿主免疫系统效应器的蛋白质。Serp2在粘液瘤病毒体外和体内复制中的重要性尚未得到研究。我们在这里报道了Serp2作为MV的另一个关键毒力因子的特性。Serp2开放阅读框的破坏导致MV突变，该突变在体外和体内正常复制，但在欧洲兔子感染后高度减弱。在接种Serp2的动物中，MV毒力的丧失与炎症和凋亡反应的显著增加相关−变异病毒。我们先前的体外实验结果很好地解释了这些体内发现，这些结果表明Serp2可以特异性抑制ICE。

材料和方法

细胞和病毒。

MV株T1和洛桑，Serp2−突变病毒、Shope纤维瘤病毒（SFV）、痘苗病毒MVA和重组痘苗病毒-尼日利亚石油公司生长在兔肾细胞系RK13中，该细胞系保存在补充有10%胎牛血清的Dulbecco最低必需培养基中。回复体MV-Serp2转速入选HGPRT−HeLa细胞(30). 兔CD4+T淋巴细胞，RL5(29)在添加10%胎牛血清的RPMI 1640（Gibco BRL）中维持。

MV-Serp2的构建−突变和回复病毒。

MV（中压）蛇2如前所述，将该基因克隆到Bluescript噬菌体表达载体中(46). 以该质粒的DNA为模板，PCR扩增DNA片段MV-蛇2L和MV-蛇2R.使用以下引物：5′血清2-15′-Xho公司I-CAG CTC GAG CGT CGG CAG TCT TCG TTT CTC CCCG-3′；5′蛇2-25′-Pst（磅/平方英尺）I-CAG CTG CAG GCC CTC GTT CCT CAC GTC CACG-3′，3′蛇2-15′-克拉I-CAG ATC GAT CCC GTA CGA GTA CGG GTA CTCC-3′和3′蛇2-25′-萨克I-CAG GAG CTC CGC GTA CGG GGG ACT GTT TAA ACG CG-3′。放大MV-蛇2L和MV-蛇2R DNA用Xho公司我/Pst（磅/平方英尺）我和克拉我/萨克一、 分别插入pRBgpt两侧的表达盒中大肠杆菌鸟苷磷酸核糖转移酶(通用测试)痘苗病毒早期启动子7.5K控制的基因(18). 产生的质粒称为p蛇2:通用测试用于转染MV感染细胞。MV服务2−抗霉酚酸突变株MV的筛选(19).

MV-Serp2转速含有野生型Serp2开放阅读框的回复病毒是通过转染含有蛇2MV-Serp2基因−-感染RK13细胞并使用反向通用测试HeLa细胞的选择(28)分离回复体。病毒DNA的PCR和Southern blot分析用于通过插入p7.5 gpt表达盒来确认Serp2开放阅读框被破坏，MV-Serp2制剂中没有可检测到的野生型病毒−变异病毒，以及蛇2MV-Serp2中的基因转速回复病毒。使用带有抗Serp2抗体的标记蛋白的免疫沉淀来确认感染野生型或MV-Serp2的细胞提取物中存在34-kDa蛋白转回复病毒，以及MV-Serp2提取物中没有任何特定蛋白质−变异病毒感染细胞。

细胞培养中的单步生长分析。

RL5电池（5×105)感染了MV菌株T1或MV-Serp2−在5次多次感染2小时的条件下，去除未吸附的无血清病毒，用无血清培养基清洗细胞三次，添加生长培养基，并在37°C下培养细胞。在接种后的多个时间点收获培养物，并通过冷冻-解冻和短暂超声处理释放病毒。通过RK13细胞单层上的标准斑块滴定法测定这些裂解物中的病毒滴度。单步生长实验一式三份。

细胞凋亡分析。

为了确定Serp2是否能抑制TNF-α介导的凋亡，2×104微量滴定板中的HeLa细胞感染野生型或MV-Serp2−在含有10μM BrdU（溴脱氧尿苷）的RPMI中，多重感染的MV为100。感染后15小时，将细胞冲洗两次，并添加添加了血清的新鲜培养基。添加TNF-α（10 ng/ml；Boehringer-Mannheim）和环己酰亚胺（40μg/ml；Sigma），并根据制造商的建议，在8 h后通过细胞DNA片段化酶联免疫吸附试验（ELISA）（Boehring er-Manhneim）评估细胞凋亡。通过添加裂解缓冲液收集细胞，这将导致从细胞质向上清液释放片段DNA。在室温下培养30分钟后，然后在250×克将上清液转移到预先涂有抗DNA抗体的ELISA板上10分钟，使用抗BrdU过氧化物酶结合液及其底物，在450 nm处用分光光度计测定每个样品中的BrdU含量。将存在TNF-α和放线菌酮的模拟感染细胞用作阳性对照，并将在不存在TNF--α的情况下与放线菌亚胺培养8 h的细胞用作阴性对照。

抗体结合和流式细胞术分析。

RL5电池（2×106)感染了MV株T1、MV-Serp2−、MV株洛桑、SFV、痘苗病毒MVA或重组痘苗病毒-尼日利亚石油公司在5次多次感染2小时的情况下，去除未吸附的病毒，用无血清培养基冲洗细胞三次，然后用补充有血清的培养基冲洗；然后在感染后24h收获培养物。细胞在补充有1%血清的RPMI中漂洗两次，并重新悬浮在100μl RPMI或结合缓冲液（137 mM NaCl，12 mM NaHCO）中三，2.6 mM氯化钾，2 mM氯化镁2，5.6 mM葡萄糖；pH值7.4）(11). 将25μg/ml浓度的CD4单克隆抗体（Spring Valley Laboratories）添加到RPMI细胞中，并将25μg/ml浓度的I类主要组织相容性复合体（MHC）单克隆抗体添加到结合缓冲液中的细胞中。在4°C下培养20分钟后，在添加异硫氰酸荧光素结合的山羊抗鼠抗体之前，在RPMI中冲洗细胞。将混合物在4°C下再孵育20分钟。然后将细胞在RPMI中漂洗两次，并在磷酸盐缓冲液中再次悬浮，以便在荧光活化细胞分选仪Calibur流式细胞仪（Becton Dickinson）上进行分析。数据采集自20000个细胞，并使用CellQuest软件进行分析。使用同型免疫球蛋白G1的实验用作非特异性结合对照。对所有抗体和所有病毒进行一式三份分析。

MV-Serp2感染家兔−变异病毒。

8岁雄性新西兰大白兔(美洲大羚羊)从当地供应商处获得，并根据欧洲共同体动物护理理事会的指导原则安置在生物防护设施中。右耳皮内注射5×10三每只动物的病毒PFU。在静脉注射T61（Distrivet）麻醉后，处死濒死的兔子。对于组织学研究，六只兔子分别接种MV T1菌株或MV-Serp2−如上所述。在接种后4、8和11天，每组两只动物被处死。两只模拟感染的兔子被处死并用作对照。

组织学检查。

所有动物都接受了彻底的尸检。取注射部位（耳；原发部位）和眼结膜、腮腺淋巴结、脾脏、肺和睾丸的组织材料，保存在10%中性福尔马林中，以便进一步分析。固定后，常规将组织加工成石蜡块，在4μm处切片，并用苏木精和伊红染色进行显微镜检查。组织学损伤评估和分级如下：+，最小；++，灯光；+++，中等；++++，标记；和+++++，严重。TUNEL法检测腮腺淋巴结和脾脏淋巴细胞凋亡。对于这种反应，用两个接受皮质类固醇治疗的幼年小鼠胸腺作为阳性对照。根据制造商的建议，在37°C下用20μg/ml蛋白酶K（Boehringer-Mannheim）预处理15分钟的常规组织切片，用地高辛标记的dUTP和末端脱氧转移酶（ONCOR）培养。样品用抗地高辛过氧化物酶偶联抗体染色。然后，定位的过氧化物酶催化从显色底物（含镍的3,3′-二氨基联苯胺）产生信号。根据放大倍数为400倍的每个显微视野中凋亡小体的数量，采用以下分级形式：+，最小凋亡，25至50个凋亡小体；++，轻度凋亡，50-75个凋亡小体；+++，中度凋亡，75至100个凋亡小体；++++，明显凋亡，75～100个凋亡小体；+++++，严重凋亡，125～150个凋亡小体。

组织切片免疫染色。

在37°C下，使用磷酸盐缓冲盐水（pH 7.6）中0.1%胰蛋白酶30分钟，重新激活耳朵（原发部位）石蜡包埋切片和腮腺淋巴结中的病毒抗原。在中和内源性过氧化物酶后，在与特异性第一抗体（兔超免疫血清抗MV）孵育之前，将样品在山羊免疫前血清中孵育。执行此步骤是为了最小化Dako（试剂盒K492）提供的二级抗体（生物素化山羊抗兔免疫球蛋白G）产生的背景。添加辣根过氧化物酶-链霉亲和素复合物，并通过DAB（3,3′-二氨基联苯胺四氢氯化物）显示，形成棕色沉淀。用迈尔苏木精对细胞核进行复染。

结果

MV-Serp2的构造和特征−突变体和回复体。

Serp2开放阅读框作为单拷贝基因存在于MV基因组中(46)位于生态RI-F限制性片段。为了构建MV突变病毒，我们通过靶向插入Eco来破坏Serp2开放阅读框通用测试标记基因受痘苗病毒p7.5启动子控制，通过同源重组精确到Serp2编码序列中的一个位点，导致编码序列中30 bp的缺失。使用标准主导选择方法(12,19,68)，我们分离出一个MV-Serp2−突变病毒能够在麦考酚酸存在下复制。作为对照，我们构建了一个源自MV-Serp2的回复病毒−其中恢复了完整的Serp2开放读取帧，称为MV-Serp2转速.

确保正确中断蛇2MV-Serp2中的基因及其真实恢复转速用特异性引物5′PCR分析病毒DNA蛇2-1和3′蛇2-2.野生型和MV-Serp2扩增DNA的琼脂糖凝胶电泳转速-特定模板DNA显示的片段大小（1130 bp）与完整Serp2编码序列的预期分子量相对应（数据未显示）。相反，MV-Serp2可扩增出2850 bp的DNA片段−DNA，表明由于整合通用测试表达盒。此外，该分析证实了MV-Serp2的遗传纯度−突变病毒，如未能扩增与野生型Serp2编码序列大小相对应的可检测DNA带所示。此外，病毒DNA的Southern blot分析揭示了野生型MV-Serp2的特征性限制模式−和MV-Serp2转速基因组（数据未显示）。因为只有30个基点蛇2开放阅读框缺失，我们想确保蛋白质不能产生，即使是截短的形式。用特异性抗Serp2抗血清进行免疫沉淀(46)在感染野生型或MV-Serp2的RK13细胞的提取物中发现了一种34kDa的多肽，与Serp2相对应转速病毒，但在感染MV-Serp2的细胞的提取物上看不到特异性条带−突变体（数据未显示）。

比较绒毛尿囊膜上形成的麻点。

鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）被广泛用于研究痘病毒感染的急性炎症反应。在该系统中，野生型牛痘病毒会导致出血，而缺乏这种病毒的突变株则会导致出血临界电流基因产生以炎症细胞涌入为特征的白痘(22,48). 为了比较CAM上产生的损伤，9天龄的胚胎蛋感染了10个5野生型MV或MV-Serp2的PFU−突变体。在33°C下孵育5天后，对CAM进行检查，发现感染任何一种病毒的CAM上有白色小麻点（直径约1 mm）。未发现出血。此外，两种病毒形成的麻点在数量或其他形态上没有差异。

MV服务2−突变体在兔肾细胞和CD4中高效复制+T细胞系。

MV-Serp2的能力无缺陷−在体外培养的兔RK13成纤维细胞中进行单步生长曲线分析。在培养的兔RL5 CD4中也发现了类似的结果+T细胞系（数据未显示）。

MV服务2−突变体在细胞培养感染后不能诱导细胞凋亡。

由于我们之前已经证明Serp2具有ICE抑制活性，并且最近被称为caspases的ICE家族在凋亡的执行中起着核心作用，因此我们有兴趣研究MV-Serp2感染后的凋亡细胞死亡−变异病毒。

自MV-Serp2以来−可以在RL5中以野生型动力学复制，这些细胞不可能成为研究Serp2抗凋亡作用的良好模型。事实上，当使用DNA片段ELISA时，我们发现感染野生型或MV-Serp2的RL5细胞没有凋亡−中压。

MV服务2−突变病毒抑制TNF-α介导的细胞凋亡。

以类似的方式，我们还研究了HeLa细胞，这些细胞容易受到TNF-α介导的凋亡。我们测量了感染野生型MV或MV-Serp2后的细胞DNA片段（ELISA测试）−用TNF-α和环己酰亚胺处理后。在没有TNF-α的情况下，模拟感染的细胞没有凋亡迹象。用TNF-α和环己酰亚胺孵育诱导细胞凋亡，如治疗后8小时所测。野生型MV感染细胞无明显凋亡，与MV-Serp2感染细胞结果一致−，表明Serp2对抑制TNF诱导的HeLa细胞凋亡不是必需的（数据未显示）。

Serp2对细胞表面抗原水平的影响。

由于已经证明，感染MV株洛桑后24小时，I类MHC表面表达降低(11)，我们研究了Serp2开放阅读框的破坏是否会影响这些抗原在细胞表面的表达。在检查了模拟感染的RL5细胞用针对I类MHC的单克隆抗体显示出强阳性表面染色后，我们发现用野生型MV菌株T1或MV-Serp2感染的RL5细胞表面MHC I的下调没有显著差异−变异病毒（数据未显示）。这些结果表明Serp2与T淋巴细胞表面MHC I抗原的下调无关。

也有报道称，感染MV后，CD4表面抗原水平显著降低(8). 以类似的方式，我们还调查了蛇2破坏所描述的表型。模拟感染的RL5细胞显示出抗CD4抗体的强阳性表面染色。感染野生型MV株T1或洛桑后，表面CD4水平略有下降；用MV-Serp2感染RL5细胞后也可以进行同样的观察−突变体。表达HIV的痘苗病毒感染RL5细胞-尼日利亚石油公司导致CD4分子严重下调，并作为阳性对照（数据未显示）。这些结果表明Serp2对RL5细胞表面CD4抗原的下调没有影响。

MV-Serp2是欧洲兔的重要毒力因子。

感染野生型MV（T1株或洛桑株）的欧洲兔子迅速发展成一种常规的100%致命性疾病，称为粘液瘤病。ICE不仅能够激活CPP32（一种重要的细胞死亡蛋白酶），还可以释放具有生物活性的IL-1β，这是一种能提醒免疫系统邻近细胞的促炎性淋巴因子。这种信号可能使炎症细胞激活并在细胞自杀被用作抗病毒防御的部位聚集(70). 因此，Serp2的假定抗ICE活性促使我们确定蛇2体内MV毒力的破坏。三组动物感染了野生型MV(n个=4），MV-Serp2−变异病毒(n个=10）或MV-Serp2转速(n个= 4). 我们观察到，感染MV-Serp2的兔子的毒力显著降低−与感染野生型MV或MV-Serp2的兔子相比转速，分别（表​（表1）。1). 感染后第4天，感染MV-Serp2的兔子的接种部位为弥漫性炎症−与感染野生型MV或MV-Serp2的兔子相比，其体积更大，界限更小转速其中有一个红色软结节，称为原发性粘液瘤。在感染后第7天，当兔子接种野生型MV或MV-Serp2时转速表现出典型的粘液瘤病症状，家兔被MV-Serp2感染而卧倒−头部、身体或腿部无继发性粘液瘤等皮肤损伤。他们表现正常，仅出现轻度结膜炎。到感染后第11天，所有8只兔子都感染了野生型MV或MV-Serp2转不得不牺牲，而在MV-Serp2中−-受感染的兔子，结膜和呼吸道出现了革兰氏阴性感染的临床症状，但通常的健康状态保持不变（图。​（图1）。1). 呼吸系统症状在第10天到第15天之间恶化，但没有观察到典型的粘液瘤。十只动物中有七只感染了MV-Serp2−变异病毒在30天内完全恢复。只有三只兔子因呼吸道感染而被处死（第14、15和25天），感染MV-Serp2的动物的总存活率为70%−病毒。相反，两组对照兔的死亡率均为100%。

表1

MV-Serp2的致病性−欧洲兔子

天毒力影响：
野生型MV和MV-Serp2转速一MV服务2−突变体b条
 0四只兔子接种野生型MV株T1和四只兔子注射MV-Serp2转皮下注射5000 PFU10只家兔皮下接种5000 PFU
 4接种部位的原发病灶：隆起、柔软、红色，约2厘米接种部位的原发病灶：红色，弥漫，约3厘米
 7被抛弃；俯卧；鼻粘膜和结膜粘膜革兰氏阴性菌感染；面部和耳朵多发继发性病变；睾丸水肿正常肥胖；定期活动；轻度结膜炎；未检测到革兰氏阴性菌感染；耳朵的弥漫性炎症
11被抛弃；共济失调；呼吸困难；结膜和呼吸道严重革兰氏阴性菌感染；继发性病变坏死；由于症状加重，所有兔子都被处死了定期活动；化脓性眼睑结膜炎和鼻腔分泌物；耳朵明显发炎；背部和鼻子无继发性粘液瘤（6/10）或微小粘液瘤
15鼻粘膜和结膜粘膜革兰氏阴性菌感染；无继发或微小粘液瘤；第14天处死一只兔子；第15天处死一只兔子
30症状完全消退，但第25天因呼吸道细菌感染而处死的一只兔子除外
一兔子存活率：0 of 4和0 of 4
b条兔子存活率：7/10
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接种后10天家兔的临床病程。感染野生型MV（A和B）的兔子的头部、背部和腿部出现继发性皮肤损伤坏死，睾丸水肿（A），耳朵出现原发性和继发性粘液瘤，导致姿势异常，鼻子和眼睛周围出现粘液瘤以及眼睑结膜炎（B）。感染MV-Serp2的兔子−突变体（C和D）无继发性皮肤损伤，生殖器区域水肿小（C）；它们还显示耳朵有明显的弥漫性炎症和眼睑结膜炎（D）。

野生型病毒和MV-Serp2病变的组织学分析−-受感染的兔子。

鉴于MV-Serp2毒力的显著差异−突变型和野生型MV，我们对感染过程中不同时间从原发（耳）和继发（眼结膜和腮腺淋巴结）感染部位采集的组织材料进行了更详细的组织学检查。其他样本点（脾、肺和睾丸）用于检测与病毒系统性传播相关的可能组织学损伤。在所有动物中，无论感染后的什么时间，这些组织均未观察到损伤。表中总结了完整分析的结果​表2。2.

表2

野生型MV或MV-Serp2感染兔皮损的组织学观察− 突变体

现场病变强度（病变地形图）一地点：
第4天p.i。
第8天p.i。
第11天p.i。
野生型MV服务2−野生型MV服务2−野生型MV服务2−
主要b条
 血管周围皮炎伴：
  表皮海绵肿和水泡++++++（f）+++++++
  水肿++（f）+（f）+++++（d）++++（d）++（d）
  局灶性间质微出血+++++++
  局灶性血栓形成++
  炎症浸润：
   嗜异细胞（血管周围和间质）++（s）+++++（s）+++++++（s）
   组织细胞、淋巴细胞（间质）+++（s）++++
  活化的成纤维细胞++++++++++++++
  间质性粘蛋白病+++++++++++++++
次要c（c）
 浅表性血管周围结膜炎：
  炎症浸润：
   嗜异性白细胞++（f）++++（f）+（s）++++（米）++（s）
   单核细胞（组织细胞、淋巴细胞）++（s）++
  局灶性淋巴增生++++
  局灶性淋巴滤过++
  活化的成纤维细胞+++++++++++
  间质性粘蛋白病+++++++++++
 淋巴腺炎伴：
  淋巴结形成+++（f）+++++（米）+++++（e）
  局部微出血++
  局灶性组织细胞增多症+++++++++（e）+++++（e）++
  嗜异性菌渗透+++++++++（s）+++（s）
  活化的成纤维细胞+++++++++
  间质性粘蛋白病++++++++
一病变强度：+，最小；++，灯光；+++，中等；++++，标记；+++++，严重。病灶地形图：散在；f、 焦点；m、 多焦；e、 广泛；d、 漫反射。p.i.，接种后。 
b条样本取自接种地点的病灶。 
c（c）样本取自眼结膜和腮腺淋巴结的病变。 

接种后第4天，感染野生型MV的动物的注射部位出现轻度血管周围皮炎，伴有局部水肿和分散的嗜异性。在MV-Serp2注入现场−突变体，炎症反应在性质上相同，但强度较小。每例患者均出现浅表性血管周围结膜炎，但野生型病毒的症状略为明显。值得注意的是，一只兔子接种了MV-Serp2−在所有其他兔子的眼结膜固有层中，突变体表现出轻微的淋巴消耗，而小淋巴结节则存在。

在腮腺淋巴结中，两种病毒引起的病变差异显著。野生型MV感染后出现明显的淋巴结炎，伴有组织细胞增生和嗜异性细胞浸润，而MV-Serp2引起的病变−突变病毒的特征是大量局部淋巴细胞耗竭。后一项发现很可能是病毒感染引发细胞剧烈死亡的结果，即使这一过程无法在常规组织切片上确定。

在接种后第8天，所产生的病理模式的差异变得更加明显。在原发部位，与野生型病毒相关的病变是明显的血管周围皮炎，伴有弥漫性水肿、局灶性间质出血、嗜异性细胞积聚和发育良好的粘液瘤（即活化的成纤维细胞和间质粘蛋白病）。相反，与MV-Serp2相关的病变−突变体表现出两个显著的差异：它们的强度要小得多，随后的炎性细胞反应进展得更快，单核细胞（组织细胞和淋巴细胞）的浸润就证明了这一点。这些观察结果也适用于结膜病变。接种野生型MV的家兔腮腺淋巴结显示出明显的淋巴结炎伴继发性粘液瘤。接种MV-Serp2的兔腮腺淋巴结−突变体表现出严重的淋巴消耗，未观察到继发性粘液瘤。

在第11天，发现了相同的主要差异，必须指出一些特征：（i）野生型病毒感染的主要部位持续存在嗜异性细胞的严重浸润，而MV-Serp2−突变体、单核细胞占优势（图。​（图2）；2); （ii）仅在接种野生型MV的兔子的次级部位可见发育良好的继发性粘液瘤；并且（iii）MV-Serp2的腮腺淋巴结中存在严重的淋巴消耗−变异接种兔子。

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接种野生型MV（A和C）或MV-Serp2后11天取自兔子的苏木精和曙红染色皮肤样品−突变体（B和D）。放大倍数：×40（A和B）；×200（C和D）。面板显示血管周围皮炎，伴有弥漫性水肿、血栓形成和血管周围嗜异性菌积聚（A）；血管周围皮炎伴轻度水肿和单核细胞间质浸润（B）；严重的血管周围和间质嗜异性细胞积聚（C）；和单核细胞间质浸润（C）。

根据这些观察结果，我们可以得出结论，在MV-Serp2诱导的病变中，炎症反应的出血性要小得多，进展更快−突变体。这种病毒导致腮腺淋巴结进行性、严重的淋巴耗竭。次要部位未见继发性粘液瘤。

淋巴细胞凋亡的组织学评估。

采用TUNEL法检测12只接种兔和2只对照动物腮腺淋巴结和脾脏淋巴细胞凋亡。腮腺淋巴结的主要结果总结在表中​表3。三两个对照显示出最小的凋亡（在×400放大倍数下，每个显微镜视野有25至50个凋亡体），主要位于生发中心。对于接种野生型MV的兔子，无论实验的哪一天，淋巴细胞的凋亡都与对照组处于相同的水平，并且显示出相同的定位（图。​（图3A）。三A） ●●●●。可见凋亡异嗜性细胞灶；用细胞学标准很容易将其与凋亡淋巴细胞区分开来。

表3

TUNEL法对野生型MV或MV-Serp2感染兔腮腺淋巴结淋巴细胞凋亡的组织学评价− 突变体

天组织学评估（病变强度）一
野生型MV服务2−
 4生发中心有一些凋亡细胞（如对照组）。局灶性广泛凋亡。
得分：同质（+）分数：可变（++/++++++）。
 8生发中心有少量凋亡淋巴细胞（与对照组相同）。局灶性广泛淋巴细胞凋亡。
得分：同质（+）分数：同质（+++++）。
11生发中心有少量凋亡淋巴细胞（与对照组相同）。凋亡小体残余的大病灶。
得分：同质（+）分数：同质（+++++）。
残留的局灶性广泛凋亡。
分数：同质（+++++）。
剩余淋巴组织中细胞凋亡的延长。
分数：同质（++）。
一病变强度：+，最小；++，灯光；+++，中等；++++，标记；+++++，严重。 
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腮腺淋巴结（TUNEL法）。面板显示接种野生型MV后8天的样本，淋巴细胞凋亡（A）最小，MV-Serp2感染−在交配后4天突变，皮质区域有局灶性广泛淋巴细胞凋亡（箭头）（B）；接种后4天，高倍镜下可见局部广泛淋巴细胞凋亡（C）；接种后11天，在淋巴衰竭的实质中残留凋亡灶（箭头所示）（D）。放大倍数：×100（A）；×40（B）；×100（C）；×40（D）。

MV-Serp2免疫家兔腮腺淋巴结−突变体发生了凋亡，与对照组相比有显著差异：在接种后第4天，淋巴结的一个区域开始了局部广泛的凋亡（图。​（图3B三B和C）。两只兔子的等级不同（轻度和重度）。也可见凋亡异嗜性细胞灶。接种后第8天，两只兔子的腮腺淋巴结均出现严重的局灶性广泛凋亡。在第11天，每只动物的腮腺淋巴结的大面积仅含有凋亡小体的残余物（图。​（图3D）。三D） ●●●●。局部广泛病灶的痕迹持续存在。在完整的剩余淋巴组织中，凋亡淋巴细胞的数量略有增加。

从这些结果中，我们得出结论，引流主要部位的淋巴结中的淋巴损耗可归因于淋巴细胞的凋亡。注射野生型MV或MV-Serp2的兔子脾脏中淋巴细胞的凋亡是相同的−突变体，与对照组相同。

组织中的病毒载量。

为了确保野生型和MV-Serp2之间显著的表型差异−突变不能归因于后一种病毒在体内复制的障碍，我们量化了接种部位和腮腺淋巴结的病毒复制水平。进行标准的免疫组织化学研究，并通过计算每平方毫米感染细胞的数量来量化用抗MV抗体染色的组织中的病毒复制水平。

在接种后第4天、第8天和第11天，野生型或MV-Serp2注射部位的病毒复制水平相同−突变体（未显示）；在腮腺淋巴结中获得了类似的结果（图。​（图4）。4). 感染野生型MV八天后，淋巴结中的细胞（主要是成纤维细胞和组织细胞，这是继发性粘液瘤的特征）被抗MV抗体阳性染色（图。​（图4A）。4A） ●●●●。使用MV-Serp2−突变后，细胞数量不同（主要是单核细胞，根据形态学标准可以定义为淋巴细胞），但根据我们的半定量测量，病毒载量处于相同的数量级（图。​（图4B）。4B） ●●●●。从这些结果中，我们得出结论：MV-Serp2−该突变体能够在体内复制到与野生型MV相当的水平。

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接种后8天家兔腮腺淋巴结（免疫组化）（×400）。用DAB对受感染的细胞进行可视化（箭头）。（A） 感染野生型MV。淋巴结中的细胞主要是组织细胞和活化的成纤维细胞（大细胞核，双箭头）。这些细胞和其他细胞受到感染。（B） MV-Serp2感染−突变体。大多数细胞受到感染，以单核细胞为主。

讨论

在本研究中，我们报告了阐明MV Serp2蛋白功能的数据，该蛋白与牛痘病毒CrmA蛋白的35%相同。CrmA被表征为ICE的病毒抑制剂（caspase 1），其可以通过降低活性促炎淋巴因子IL-1β和IL-18的水平以及在细胞死亡过程中优先抑制ICE/CED-3蛋白酶级联的近端成分来预防炎症和细胞凋亡的发生(33,48,50,58,64). CrmA对caspase 8或FLICE也有很高的亲和力(72)和Granzyme B(49). 更重要的是，Serp2先前也被证明与人类ICE结合，并阻止其将前IL-1β加工成生物活性形式(46). 因此，Serp2是另一个候选痘病毒编码因子，可对抗宿主防御，并可能导致MV感染相关的病理学改变。

为了评估Serp2在粘液瘤病发病机制中的作用，我们成功地设计了一个在Serp2开放阅读框中删除的完全复制能力的MV突变体。在体外培养时，突变体病毒表现出一种野生型表型，在兔子体内感染后，该病毒被高度衰减。MV-Serp2感染的临床过程−突变体的特征是在接种部位出现轻度和更多弥散的原发性粘液瘤病变，没有或仅有罕见的继发性病变，最令人印象深刻的是，感染动物的完全恢复率很高。

详细的组织学检查有三个主要发现。首先，接种野生型MV后的炎症反应似乎在血管水平上被阻止（即使在很晚的时候，嗜异性细胞仍占主导地位），而MV-Serp2突变后，炎症进入细胞期（淋巴细胞和组织细胞浸润病变）。在后一种情况下，与Serp2存在时相比，总体反应不那么强烈，出血性也更少。Serp2对IL-1β处理的抑制与这些观察结果一致。IL-1是一种有效的促炎细胞因子，可以影响许多生理系统的功能（有关综述，请参阅参考文献15). IL-1β的多效性效应包括血栓形成和炎症，其中包括免疫球蛋白超家族分子ICAM-1和VCAM-1的增加表达，它们与淋巴细胞和单核细胞上的整合素结合(14,24). 通过阻断IL-1β的处理，Serp2将降低这些细胞迁移到炎症组织的能力。此外，ICE还参与将前IL-18转化为其活性形式的过程(23,26). IL-18，也称为IFN-γ诱导因子，刺激淋巴细胞产生IFN-γ(42,44). 至于IL-1β，IFN-γ的作用是多方面的，包括巨噬细胞的化学吸引(10,43,71). 这种现象也发生在感染了一个缺乏IFN-γ受体分泌同源物的突变株后；Mossman等人(40)据报道，IFN-γ受体缺陷型MV感染导致次级位点的嗜异性/单核细胞比率倒置。我们的组织学研究结果虽然不能明确证明与哪种细胞因子缺陷有关，但与Serp2的存在导致感染部位IL-1β和IFN-γ数量减少的假设一致。

我们的第二个重要组织学观察是，在没有Serp2的情况下，淋巴细胞发生凋亡，这可以在腮腺淋巴结中进行定量。根据凋亡灶在淋巴结中的空间分布，可以合理假设凋亡发生在淋巴结本身以及从接种部位排出的淋巴细胞中。ICE被广泛认为是凋亡过程的重要介导者（参考文献综述7和41). Serp2对ICE的损伤与野生型病毒对凋亡过程的抑制相一致，但与MV-Serp2无关−变异病毒。然而，在我们的体外实验中，Serp2产生的缺陷并没有导致RL5 T辅助淋巴细胞的凋亡。该细胞系已被广泛用于研究其他MV基因。MV缺乏TNF受体同源物(53)，M11L基因(35)，和宿主范围超家族成员M-T5(39)均显示能诱导该细胞系的凋亡。为什么所有这些突变体在RL5细胞中表现出相同的表型尚不清楚。M-T5可能抵消MV感染后蛋白质合成的中断(39)，但M-T2可能不会通过其TNF结合域阻止凋亡(53). M11L是一种参与抑制炎症的跨膜蛋白，但其靶点尚不清楚(43). 另一方面，病毒产物抑制细胞凋亡的细胞类型依赖性已被广泛报道(6,13,21,51). 在这种情况下，RL5细胞显然不是检测Serp2抑制ICE介导的凋亡的最佳模型。

有几份报告称，无论是牛痘CrmA(62)或其同源痘苗病毒SPI-2蛋白(16,32)可以抑制Fas介导的细胞凋亡。然而，在我们的实验中，抑制TNF诱导的HeLa细胞凋亡并不需要Serp2。我们的发现有几个假设。第一种可能性是，尽管据报道不能与人类TNF-α结合(52)，MV TNF受体同源物负责这种抑制；另一种可能性是存在一种由MV编码的as-yet-unidentified抗凋亡因子，其作用是阻止TNF诱导的凋亡。最近有研究表明，MC159蛋白传染性软体动物痘病毒家族的另一成员，可以通过其死亡效应域抑制Fas和TNFR1诱导的凋亡(9). 因此，MV可能编码一个或多个蛋白质，阻止细胞培养中ICE的激活。

自有报道以来，MV可以下调CD4的表达(8)和MHC I分子(11)在感染细胞表面，我们检查Serp2是否可以解释这种表型。事实上，我们在感染野生型或MV-Serp2的RL5细胞的CD4或MHC I抗原相对减少方面看不到任何差异−突变体。与痘苗病毒介导的人类免疫缺陷病毒1型的表达相比，MV对这两种情况下这些表面分子表达的影响较小尼日利亚石油公司基因(1,54). 检查Serp2在MHC I下调中的可能意义尤其重要，因为这可能会干扰细胞凋亡过程。感染细胞表面MHC I表达的任何减少都会导致细胞毒性T淋巴细胞无法与这些细胞结合并将其识别为靶细胞。由于Serp2不干扰MHC I的表达，体内观察到的淋巴细胞凋亡的显著差异不能归因于感染细胞膜上免疫效应物的改变。更可能的是，这种差异是由于Serp2的抗凋亡作用。

最后的组织学发现是，在感染MV-Serp2后的继发部位（眼结膜和淋巴结）没有所谓的继发性粘液瘤−与野生型MV相比，MV诱导粘液瘤形成的分子机制尚不清楚，但不应仅归因于组织中存在病毒。事实上，我们能够证明MV-Serp2−突变体可以像野生型病毒一样在接种点和腮腺淋巴结中高效复制。两种病毒的病毒载量的可比水平表明，观察到的临床和组织学差异不能简单地归因于生长较差的突变病毒。我们能够证明，感染MV-Serp2的兔子淋巴结中的淋巴细胞−突变体确实被感染了。

我们从这些观察中得出的结论是，在MV中，Serp2能够阻断早期炎症反应的进程和淋巴细胞的凋亡。这些现象似乎与caspase 1和/或另一种天冬氨酸特异性蛋白酶的抑制有关。

据先前报道临界电流牛痘病毒基因或与之相当的兔痘病毒SPI-2基因导致了临床过程的衰减，这是通过鼻内感染后小鼠的体重来测量的(63). 然而，牛痘和兔痘病毒的炎症反应不同。急性炎症反应被描述为与兔痘病毒中SPI-2基因的破坏有关，而牛痘病毒上开放阅读框的破坏似乎导致炎症细胞流入减少。使用相同的小鼠鼻内模型，其他作者报告说，灭活痘苗病毒的SPI-2基因对病毒毒力没有影响(31). 这些矛盾的结果涉及正痘病毒该属可能归因于病毒的真正差异，也可能归因于基因组中其他地方获得的突变，因为既没有产生牛痘病毒，也没有产生拉比痘回复病毒(63). 然而，在每种情况下，小鼠都是通过鼻内接种的。在这里，我们一直在使用皮内途径，这似乎更为相关，因为兔子是通过跳蚤或蚊子叮咬而受到污染的(20). 由于在回复病毒中观察到野生型表型的恢复，因此基因组其他地方获得的突变也不太可能对我们的结果负责。所以我们可以说，我们在这里所描述的确实反映了Serp2在自然感染过程中的作用。

Serp2在体内的实际靶点尚未找到。事实上，在之前的实验中，我们能够看到Serp2和人类ICE之间的复合物，并且ICE对IL-1β前体的处理受到杆状病毒表达系统中产生的Serp2的抑制(46). 然而，也有报道称，CrmA可以与ICE形成复合物（caspase 1）(50)、Cpp32（caspase 3）、FLICE（caspase8）和Mch2（caspase-6）(72); CrmA对这四种蛋白酶也有一定的抑制作用(33,72). 然而，动力学分析表明，caspase 1和caspase 8是体内CrmA的直接靶点，而caspase 3和caspase6不是(72).

最近已经证明，尽管SPI-2和临界电流这两种蛇蛋白被认为是等效的，实际上对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶有不同的影响(36). 这两种蛋白都能在体外阻断ICE活性(36). 然而，SPI-2不能阻止猪肾细胞的凋亡，而CrmA是一种有效的抑制剂。这些结果表明SPI-2和CrmA在体内具有不同的靶点。

很可能与CrmA一样，Serp2也有多个靶点。我们的体内数据支持ICE就是其中之一的假设。与仅在感染早期表达的CrmA和SPI-2不同，Serp2在早期和晚期都表达(46). 毫不奇怪，它的额外目标可能与CrmA或SPI-2的目标不同。

目前，人们对麻风痘病毒属的发病机制中重要的病毒遗传功能有了更好的了解，并且迄今为止已经确定了几个因素的特征。这些包括MV TNF受体(68); 干扰素-γ受体同源物(69); M-T5是主机系列超级系列的成员(39); M11L和粘液瘤生长因子（MGF）(45); SERP-1是一种蛇毒样蛋白，可以干扰炎症反应(34,67); 和M-T1，一种最近被描述为趋化因子结合蛋白的35-kDa蛋白(25). Serp2似乎是MV引发的免疫逃避策略的关键组成部分。进一步分析Serp2抑制ICE和/或其他半胱天冬酶的多重后果将有助于了解炎症和凋亡对消除病毒的相对重要性。

鸣谢

我们感谢G.McFadden和G.L.Smith为我们提供RL5细胞和HGPRT−HeLa细胞。我们还感谢V.Lourec对兔子的监测。

这项工作得到了国家农业研究所（Institute National de la Recherche Agronomique）的资助。

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文章来自病毒学杂志由以下人员提供美国微生物学会（ASM）