Dendritic Cells Route Human Immunodeficiency Virus to Lymph Nodes after Vaginal or Intravenous Administration to Mice

Carole Masurier; Benoît Salomon; Nadia Guettari; Catherine Pioche; François Lachapelle; Martine Guigon; David Klatzmann

doi:10.1128/jvi.72.10.7822-7829.1998

《维罗尔杂志》。1998年10月；72(10): 7822–7829.

数字对象标识：10.1128/jvi.72.10.7822-7829.1998年

预防性维修识别码：PMC110098型

PMID：9733818

阴道给药或静脉给药小鼠后，树突状细胞将人类免疫缺陷病毒导向淋巴结

卡罗尔·马苏里,¹ 贝诺·萨洛蒙,^1,^† 纳迪娅·盖塔里,¹ 凯瑟琳·皮奥切,¹ 弗朗索瓦·拉查佩尔,² 马丁·吉贡,¹和大卫·克拉茨曼^1,^*

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摘要

我们建立了一个小鼠模型，研究树突状细胞（DC）参与人类免疫缺陷病毒（HIV）从接种点到淋巴结（LN）的传播。皮下注射后24小时内，小鼠骨髓源性DC迁移至引流LN。将这些细胞与热灭活（Hi）HIV 1型（HIV-1）孵育后，仅在排出的LN中检测到HIV RNA序列。注射感染性HIV的DC后，在排出的LN中恢复的病毒仍然能够有效感染人类T细胞。HIV-1阴道激发后，注射后24小时可在髂部和骶部引流LN中检测到病毒。静脉激发后，注射后30分钟即可在外周淋巴结中检测到病毒。先前研究表明，髓系相关LN DC群体的特异性耗竭可以吸收血液大分子并将其转移到LN中，从而阻止了HIV向LN的转运。总之，我们的数据证明了DC在阴道或静脉注射后（不需要感染）对HIV传播至LN的关键作用。因此，尽管小鼠不会感染HIV，但这种小动物模型可能有助于测试针对HIV的预防策略。

了解导致慢性人类免疫缺陷病毒（HIV）感染的早期事件对于解读HIV病理生理学以及设计针对该病毒的治疗和疫苗接种策略至关重要。HIV感染主要通过两种途径发生：性传播和直接静脉接种。慢性感染的建立需要污染病毒有效地感染其目标细胞之一，即表达CD4的T淋巴细胞(22,55)，单核细胞(13,44)和树突状细胞（DC）(8,23,25,53). 最近，一系列的争论指出了一种通过性传播（涉及CD4）建立原发性艾滋病毒感染的情况⁺T淋巴细胞和DC(23,36,43,49,50). 假设接种部位的DC首先感染HIV，然后迁移到引流淋巴结（LN），在那里将病毒传播到副皮质区的T细胞。随后，病毒会强烈复制，并传播到整个淋巴系统。这种情况是根据以下事实推断出来的：（i）粘膜中含有朗格汉斯细胞（LC），这是一种未成熟的DC，已知其在暴露于抗原或炎症信号后会从其常驻区域迁移到排泄的LN(17——19,24,31,32,34,46); （ii）猴免疫缺陷病毒（SIV）感染细胞在实验性SIV阴道接种猕猴后不同时间点的性质和位置观察(50); 以及（iii）在体外观察中，DC和T细胞的结合物代表了生产性HIV感染的最佳环境，因为DC将HIV传递给T细胞，同时具有强大的激活信号，允许有效的感染和复制(9,42). 尽管这种情况似乎很可能发生，但DC的作用尚未得到明确证明。如前所述(50)，在SIV阴道接种后，第一批感染的细胞出现在固有层中，目前还没有解释病毒是如何穿过多层上皮的，而多层上皮通常是传染源的物理屏障。在静脉注射的情况下，艾滋病毒如何到达淋巴结也不得而知。

我们旨在更详细地分析DC在HIV感染早期事件中的作用。由于使用灵长类动物和感染性病毒的研究很难进行，我们研究了使用小鼠模型的可能性。事实上，尽管小鼠细胞不会感染HIV，但小鼠可以作为研究DC传播HIV的良好模型。首先，小鼠DC具有很好的特征，可以很容易地用特定抗体进行追踪(51). 第二，在染色和回注后，可以很容易地监测这些细胞的迁移(三,16,21,26,37)，并且有关于小鼠DC循环途径的可靠实验数据(2). 最后，以前有报道称，虽然小鼠DC不可感染HIV，但可以像人类DC一样有效地将HIV传播到人类T细胞(9). 这表明DC可以向T淋巴细胞传播HIV颗粒，这些颗粒不是由DC自身产生的，而是由DC吸附或内化的。

我们在这里表明，在外围接种时，感染性HIV确实可以通过小鼠DC传播到排出的LN，并且DC对于在静脉注射时将HIV传播到LN也至关重要。这些结果表明，DC在HIV感染的建立中起着重要作用，而HIV感染并不一定需要其生产性感染。

材料和方法

动物。

DBA/2和（C57BL₆×CBA/J）F₁小鼠购自IFFA-Credo（法国阿尔布雷斯）。来源于（C57BL）的人CD4（hCD4）转基因小鼠₆×CBA/J）F₁小鼠取自P.Lorès(29). 实验时，小鼠的年龄为7至14周。胸苷激酶（TK）嵌合体小鼠来源于在DC中表达单纯疱疹病毒1型TK（HSV-1 TK）的LTR-TK转基因小鼠，如前所述(47,48).

DC的准备。

DC从DBA/2或hCD4转基因小鼠的骨髓（BM）中获得，如前所述(20)，稍作修改。简单地说，从股骨和胫骨收集BM细胞，用氯化铵溶解红细胞，用抗CD4（GK-1.5；ATCC TIB207）、抗CD8（H35 JP）、抗主要组织相容性复合体（MHC）II类（M5/114）的杂交瘤上清混合液对淋巴细胞和Ia阳性细胞进行免疫磁性去除；ATCC TIB120）、抗B220（RA3-6B2）单克隆抗体（MAb）和羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）包被Dynabeads（M-450；挪威奥斯陆戴纳）。在耗尽步骤后，将细胞培养在7×10⁵37°C条件下，24孔板中每毫升RPMI 1640中的细胞数/毫升，补充5%未实现胎牛血清（FCS）、20μg/ml庆大霉素、50μM 2-β-巯基乙醇和2000 U重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）（Genzyme，Cambridge，Mass.）。在第2天和第4天，90%的培养基被含有GM-CSF的培养基取代。第6天，收集培养基，通过有力的移液管去除生长DC的松散粘附聚集体，然后进行计数(47). DC以2×10传代培养⁵至3×10⁵细胞/ml，置于新鲜的含有GM-CSF的培养基中，置于六孔板中过夜，然后采集并计数。

LN被切割成小碎片，并在37°C条件下，在添加1.6 mg胶原酶（IV型；Sigma Chemical Co.，Saint Quentin Fallavier，法国）/ml和200μg DNase I（Boehringer Mannheim，德国曼海姆）/ml的RPMI 1640中培养30分钟。通过反复移液分离细胞，在37°C条件下重新培养10分钟，并清洗。然后将细胞悬液与200μg/ml DNase I在室温下孵育15分钟，并重新悬浮在染色缓冲液中（磷酸盐缓冲液–3%FCS–0.02%叠氮化物），以进行流式细胞术分析。

通过流式细胞术分析，评估BM衍生和LN DC群体CD11c和MHC II类分子的表达，这些分子是小鼠DC的经典标记(35,46,54). 为此，5×10⁵骨髓衍生细胞和1×10⁶LN细胞在350×克持续5分钟，并在10℃重悬⁷缓冲液中每毫升细胞数，用饱和浓度的抗体进行单或双标记。用藻红蛋白结合F（ab′）显示的未标记MAb N418（仓鼠Ig；ATCC HB224）分析CD11c的表达₂山羊抗仓鼠IgG（加州旧金山Caltag实验室）。用异硫氰酸荧光素（FITC）共轭F（ab′）显示的MAb M5/114（大鼠Ig；ATCC TIB120）分析MHC II类表达₂山羊抗鼠IgG（Caltag实验室）或MAb 14.4.4S（加州圣地亚哥PharMinen），FITC结合或生物素结合，由链霉亲和素三色（Caltag-Laboratories）揭示。最终清洗后，将细胞固定在1%多聚甲醛中，并在FACScan流式细胞仪（Becton Dickinson）上进行分析。

在一些实验中，使用FACStar Plus（Becton Dickinson）对MHC II类和CD11c双染色DC进行分类，并在整个过程中保持在4°C。在488 nm的波长下，用5 W氩激光器（Coherent，Palo Alto，Calif.）以150 mW的功率进行激发。细胞以3000个事件/秒的速度进行分类，中止率约为事件的10%。

细胞系。

CD4⁺人类淋巴细胞系HUT-78购自美国型培养物收藏中心（马里兰州罗克维尔），并在RPMI 1640中保存，补充10%未实现的FCS（法国布鲁马州达彻尔）。

HIV菌株。

嗜淋巴性HIV 1型（HIV-1）毒株HIV-1_{拉丁美洲国际}(52)和嗜巨噬细胞HIV-1_钡-L-分别从Diagnostics Pasteur（法国Marne-la-Coquette）和B.Asjö获得。HIV-1_{拉丁美洲国际}用病毒上清液感染活化的外周血单个核细胞（PBMC）测定的滴度为10⁴50%组织培养感染剂量（TCID₅₀)/ml.HIV-1中p24抗原的浓度_{拉丁美洲国际}病毒上清液为5μg/ml。

活病毒上清液用于皮下注射（25μl=250 TCID₅₀)或用于培养实验（100至300μl[3×10⁶至10×10⁶细胞/ml]=1000至3000 TCID₅₀).

在56°C下将病毒热灭活（Hi）1小时后进行其他实验。在这种情况下，因为病毒接种物不能被评估为TCID₅₀每毫升的病毒量是以纯上清液或稀释上清液的体积表示的。

艾滋病病毒1型_钡-L-，滴度为10⁵TCID公司₅₀/用病毒上清液感染活化的PBMC测定ml，在类似的Hi后使用。

DC的体内示踪。（i） s.c.注射BM衍生DC。

通过注射PKH2（宾夕法尼亚州马尔文市Zynaxis）染色的细胞来分析BM衍生DC的迁移模式，PKH2是一种无毒的荧光色素，以前用于小鼠抗原呈递细胞的迁移研究(37). 最终浓度为5×10的BM衍生DC悬浮液⁶至10×10⁶在室温下用2μM（最终浓度）PKH2在稀释剂（Zynaxis）中培养细胞/ml 5分钟。加入两倍体积的RPMI 1640和10%胎牛血清以停止反应，然后将细胞清洗三次。

5×10皮下注射PKH2染色细胞和对照细胞⁵细胞/25μl注入麻醉（2.5%三溴乙醇）DBA/2小鼠的脚垫中。注射后6和24小时，采集同侧和对侧腘窝和腹股沟LN，冷冻在OCT培养基中（法国维伦纽夫·阿斯克Labonord），在低温恒温器上切片（5μm），并在荧光显微镜下观察。

（ii）在阴道粘膜上应用FITC。

通过使用先前发表的用于研究表皮LC迁移的技术，研究了阴道粘膜中常驻LC的迁移(31,46). 将25至30μl溶于磷酸盐缓冲盐水中的0.8%FITC（异构体1；Sigma Chemical Co.）通过在麻醉小鼠的阴道穹隆上插入一个22号1/2动物喂食套管（法国斯特拉斯堡Polylabo）进行非创伤性应用。将动物保持静止30至45分钟。12和24小时后采集阴道粘膜和骶骨、髂骨、腰椎和腹股沟LN进行流式细胞术分析。

共培养实验。

直流（3×10⁶至10×10⁶)与100μl感染性或Hi HIV-1孵育_{拉丁美洲国际}上清液置于最终体积为1ml的完全培养基中，在37°C下培养2小时，并在RPMI中洗涤两次，然后洗涤5×10⁴DC与5×10共培养⁵RPMI 1640–10%FCS中HUT-78细胞10天。对照组为非脉冲直流电。

同样，HIV脉冲DC与5×10共培养⁵在RPMI 1640中加入每毫升100 ng葡萄球菌肠毒素A（SEA），并辅以10%AB+正常人血清、谷氨酰胺（2 mM）和1%抗生素（GIBCO-BRL，佩斯利，苏格兰）的情况下，通过玫瑰花结从PBMC中分离出T细胞10天。对照组为脉冲T细胞或与未脉冲T细胞共培养的未脉冲DC。

将LN机械脱酸后获得的细胞与5×10⁴和1×10⁵在含有谷氨酰胺和抗生素的RPMI 1640–10%FCS中，腘窝和腹股沟淋巴结的HUT-78细胞。细胞膨胀10天，然后维持在10天⁵细胞通过双周培养基变化至80天。

通过酶联免疫吸附试验（ELISA）（诊断巴斯德）测定不同培养上清液中病毒p24的生成动力学。

体内HIV-1实验。（i） s.c.注射。

在第一组实验中，感染性或Hi HIV_{拉丁美洲国际}将上清液（25μl/只）皮下注射到麻醉DBA/2小鼠的脚垫中。注射后24小时，取同侧、对侧腘窝和腹股沟LN，冷冻提取RNA。

在另一组实验中，3×10⁶至10×10⁶BM-derived DC首先与300μl传染性或Hi-HIV孵育_{拉丁美洲国际}或HIV_钡-L-上清液置于最终体积为1ml的完整培养基中，37°C下培养2小时。两次洗涤后，5×10⁵将细胞/25μl皮下注射到麻醉小鼠的足垫内。注射后24小时，取同侧、对侧腘窝和腹股沟LN，冷冻提取RNA。注射BM衍生DC前结合的病毒量通过p24 ELISA测定。

（ii）阴道粘膜涂敷。

二十五微升高型HIV-1_{拉丁美洲国际}如上所述，将上清液注入麻醉小鼠的阴道穹隆进行FITC。24小时后，采集阴道粘膜和骶骨、髂骨、腰椎和腹股沟LN并冷冻以提取RNA。

（iii）静脉注射。

150微升HIV-1_{拉丁美洲国际}上清液经静脉注入麻醉小鼠的眶后窦。30分钟后，分别采集外周淋巴结（轴淋巴结、肱淋巴结和腹股沟淋巴结），然后将其混合到对应于小鼠左右淋巴结的两个池中。采集肾脏作为对照。所有样本均冷冻以提取RNA。

逆转录聚合酶链反应。

在RNA提取液（RNA-BTM；Bioprobe，Montreuil，France）中溶解对照细胞和HIV脉冲细胞。冷冻的LN和肾脏在同一溶液中用手术刀切开。

对于逆转录-PCR（RT-PCR），1μg LN的总细胞RNA或半总细胞RNA逆转录如下。在20μl反应混合物中，使用1 mM每个脱氧核苷三磷酸（Pharmacia LKB Biotechnology）、0.04 U随机引物P（dN）6（Pharmachia LKB biotechnoology）、40 U核糖核酸酶抑制剂（Pharmasia LKB生物技术）、10 mM二硫苏糖醇和200 U Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶（Gibco BRL，马里兰州盖瑟斯堡）。在42°C下进行RT反应1小时。每次扩增反应直接使用5μl等分RT混合物。PCR操作如下。在50μl反应混合物中，0.5μM引物SK38和SK39用于HIV-1堵住序列（Perkin Elmer Cetus，Emeryville，CA）或1μM hCD4引物（Eurogentec，Angers，France），每个脱氧核苷三磷酸200μM（Pharmacia LKB Biotechnology），1.5mM氯化镁₂和1 U塔克使用1×缓冲液的DNA聚合酶（Goldstar DNA聚合物；Eurogentec，Seraing，Belgium）。hCD4引物为：5′-ATGAACCGGGAGTCCTT-3′；反义引物，5′-ACTATCCTGGAGCTCCAGCT-3′。反应混合物在鳄鱼II DNA热循环器中培养（法国伊利科奇阿普里根）。对于HIV-1堵住引物在94℃下5 min后，在94℃进行35次变性60 s，在58℃下退火60 s，并在72℃下延伸60 s，然后在72℃完成延伸10 min。对于hCD4引物，在94°C下5分钟后，在94℃下进行35次变性30秒，在64℃下退火30秒，并在72℃下延长60秒，然后在70℃下延长10分钟。以5μl 1:200稀释PCR产物作为模板，在相同条件下进行第二次扩增。PCR产物用HIV-1 SK19探针（Perkin-Elmer Cetus）进行Southern blot杂交分析。对于定量RT-PCR，使用Amplicor HIV-1 Monitor（Roche Diagnostic Systems，Neuilly-sur-Seine，France）进行了一些修改：此定量不是用血浆进行的，而是用RNA提取液（RNA-BTM；Biospeb）从LN提取的2μg RNA进行的并用无核糖核酸酶DNA酶处理（法国梅兰Boehringer Mannheim）。

结果

小鼠BM衍生DC能有效地将HIV-1感染传递给人类T细胞。

在GM-CSF存在下培养7天的BM细胞可常规生成小鼠DC(20). 在这种培养条件下，40%至70%的细胞为DC，其特征是其形态和表型，即CD11c标记和高水平MHC II类分子的表达(20,30,47).

我们验证了这些BM衍生DC可以有效地将生产性HIV感染传递给人类T细胞，正如之前报道的小鼠脾DC一样(9). 感染HIV-1或HIV-1后_{拉丁美洲国际}DC与HIV敏感的人HUT-78细胞共培养。细胞被有效感染（图。（图1A），1A），表明与鼠BM衍生的DC结合的病毒仍然具有传染性。同样，当这些细胞在超抗原存在下共同培养时，DC可以将HIV感染传递给人类静止T淋巴细胞（图。（图1B）。1B） ●●●●。相反，在没有DC的情况下，与HIV-1和超抗原一起孵育的静息T淋巴细胞不复制HIV-1。

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图1

小鼠BM衍生DC将生产性HIV感染传递给人类T淋巴细胞和人类T淋巴细胞。用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定了骨髓来源DC与HUT-78细胞（A）或人T淋巴细胞（B）共培养时HIV复制的动力学，以检测p24的产生。（A） HUT-78细胞与Hi或感染性HIV-1共培养_{拉丁美洲国际}-脉冲直流电或非脉冲直流电作为控制。（B） T淋巴细胞与HIV-1共培养_{拉丁美洲国际}-SEA刺激DC或T淋巴细胞。对照组是在SEA存在下用T淋巴细胞进行的非脉冲DC。

皮下注射后，小鼠骨髓源性DC迁移至排出的LN。

已知外周树突状细胞在抗原刺激后会迁移到排泄的淋巴结。经s.c.注入后，BM衍生DC同样可以迁移至排水LN。注射后6 h，在同侧腘LN引流液中已经发现标记有PKH2示踪剂的荧光BM衍生DC，并且在24 h时其数量增加（图。（图2A）。2A） ●●●●。同侧腹股沟、对侧腘窝和腹股沟LN均未检测到荧光细胞。因此，体外生成的BM衍生DC保留了其从皮下注射部位迁移到引流LN的能力。

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图2

小鼠骨髓来源的DC在皮下注射后将HIV引导至排出的LN。（A）将小鼠BM衍生的PKH2染色DC注射到DBA/2小鼠的脚垫24小时后，在荧光显微镜下观察到腘窝淋巴引流的切片。注意存在大量荧光细胞。放大倍数，×200。（B）注射含有5×10的25μl后24 h用RT-PCR检测非转基因小鼠LN中HIV（左）和hCD4（右）RNA⁵HIV-1高_{拉丁美洲国际}-将来自hCD4转基因小鼠的脉冲DC注入脚垫。流行，流行LN；腹股沟淋巴结。

小鼠骨髓源性DC在皮下注射后将HIV转运至排出的LN。

然后，我们用DC与嗜淋巴性HIV-1孵育重复这些实验_{拉丁美洲国际}.皮下注射HIV-1后24小时_{拉丁美洲国际}-将直流电脉冲注入脚垫，HIV堵住在五只小鼠中的三只的同侧腘淋巴结中检测到RNA序列，但在同侧腹股沟或对侧腘和腹股沟淋巴结中未发现RNA序列（表（表1）。1). 在嗜巨噬细胞HIV-1的实验中_钡-L-，艾滋病毒堵住RNA序列也仅在同侧腘窝LN中发现（数据未显示）。

表1

HIV检测堵住皮下注射Hi-HIV 24小时后引流LN中的RNA_{拉丁美洲国际}-脉冲直流电或Hi-HIV_{拉丁美洲国际} 上清液

治疗	阳性小鼠数量^一/没有。受试小鼠的
	堵住				人CD4
	同侧的		对侧		同侧的		对侧
	流行音乐^b条	英^b条	流行音乐	英	流行音乐	英	流行音乐	英
来自正常小鼠的未分类HIV脉冲DC	3/5	0/5	0/5	0/5	纳^c（c）	纳	纳	纳
hCD4转基因小鼠产生的HIV脉冲DC
未分类	3/7	第0页，共7页	0/7	0/7	6/7	0/7	0/7	0/7
已排序	2/3	0/3	0/3	0/3	1/3	1/3	0/3	0/3
总计	8/15	0/15	0/15	0/15	7/10	1/10	0/10	0/10
HIV-1上清液
未稀释	6/6	ND（无损检测）^d日	ND（无损检测）	ND（无损检测）	纳	纳	纳	纳
稀释1:300	0/7	ND（无损检测）	ND（无损检测）	ND（无损检测）	纳	纳	纳	纳

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^一的正数堵住或通过RT-PCR检测hCD4 RNA。

^b条流行，流行LN；腹股沟淋巴结。

^c（c）不适用。

^d日ND，未完成。

用表达hCD4的转基因小鼠的BM产生的DC也进行了类似的实验。使用这些小鼠的想法是，细胞表面的hCD4表达可能有利于HIV的结合，尽管它不能使这些细胞感染HIV(29). 此外，转基因可以作为先天性标记物，在注射到非转基因小鼠中后追踪细胞。注射之前与HIV-1孵育的hCD4 DC后_{拉丁美洲国际}，都是HIV堵住在七只注射小鼠中的三只的同侧腘窝淋巴结中检测到hCD4 RNA（表（表1；1; 图。图2B）。2B） ●●●●。在类似的实验条件下，注射经Hi-HIV孵育的纯化小鼠LN T细胞后，未检测到病毒RNA_{拉丁美洲国际}（未显示数据）。

通过流式细胞术细胞分选获得的纯化DC也证实了这些结果。在这些条件下，三只小鼠中有两只HIV阳性堵住同侧腘窝LN中的RNA，其中一只小鼠的hCD4 RNA也呈阳性（表（表1）。1). 总之，这些发现表明，与HIV-1体外孵育的小鼠BM衍生DC可以将病毒引导至排出LN。

为了进一步验证DC在HIV-1向淋巴结转移中的作用，通过注射HIV-1进行了类似的实验_{拉丁美洲国际}将不同浓度的上清液单独放入小鼠脚垫中，24小时后分析同侧和对侧腘窝和腹股沟LN中是否存在HIV RNA。表表11表明HIV堵住在注射高浓度HIV-1的所有六只小鼠的腘窝引流LN中检测到RNA信号_{拉丁美洲国际}上清液。相比之下，在注射了1:300稀释的这种Hi-HIV-1的所有七只小鼠的引流LN中都没有检测到信号_{拉丁美洲国际}上清液。之所以分析这种稀释度，是因为它对应于与Hi-HIV-1孵育后与DC结合的病毒量_{拉丁美洲国际}由p24 ELISA测定的上清液和两次洗涤液。这证明了DC的重要作用，DC似乎能够将非常少量的病毒路由到LN。

HIV在传播到LN后仍然具有传染性。

对传染性病毒的类似实验使我们能够评估它在抵达LN后是否仍然具有传染性。注射感染性HIV-1后_{拉丁美洲国际}收集引流的腘窝LN细胞，并与HIV敏感的人HUT-78细胞共培养。在注射了HIV-1的四只小鼠中，有一只检测到这些细胞产生了HIV感染_{拉丁美洲国际}-脉冲直流电和四只小鼠中的一只注射25μl高浓度HIV-1_{拉丁美洲国际}上清液（图。（图3）。三). 因此，HIV在从注射部位转移到小鼠排泄的LN后24小时内仍然具有传染性。

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图3

HIV经DC进入引流LN后仍具有传染性。25微升HIV-1_{拉丁美洲国际}上清液（正方形）或25μl含5×10⁵艾滋病病毒1型_{拉丁美洲国际}-将脉冲直流电（三角形）注入正常小鼠的脚垫。20小时后，收集LN，并将细胞与HUT-78细胞共培养。用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定p24产生的HIV复制动力学。

阴道用药后，HIV被输送至引流LN。

先前的报道表明，阴道粘膜的LC可以吸收抗原并迁移到引流LN(39,41). 与这些研究一致，我们仅在阴道粘膜应用FITC 24小时后，在引流骶骨和/或髂骨LN中观察到FITC阳性细胞。在腹股沟LN中未观察到阳性细胞（图。（图4A）。4A） ●●●●。在LN-DC亚群（l-DC）中检测到染色细胞（图。（图5）5)之前显示为衍生自LC(46).

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图4

阴道用药后，HIV被引导至引流LN。（A） FITC应用于小鼠阴道粘膜24小时后LN细胞的荧光激活细胞分选仪分析。如前所述，FITC-荧光细胞几乎只能在以CD11c和MHC II类分子表达为特征的LN DC（l-DC）亚群中检测到(46)（另请参见图。图5）。5). 数据显示为来自未注射小鼠髂骨淋巴结（左侧面板）和来自FITC-接种小鼠髂骨和腹股沟淋巴结（分别为中间和右侧面板）的l-DC的FITC荧光直方图。结果来自2×10的分析⁵至3×10⁵LN细胞。在约30%的l-DC训练的髂LN中检测到FITC染色。显示了四个独立实验中的一个代表性实验的结果，每组两到三只小鼠。（B）接种25μl HIV-1 24 h后，用RT-PCR检测小鼠阴道粘膜和腹股沟、髂骨和骶骨淋巴结中的HIV RNA_{拉丁美洲国际}上清液进入阴道拱顶。

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图5

转基因小鼠中s-DC的特异性废除。显示了对照组和DC缺失小鼠腹股沟淋巴结的荧光激活细胞分选仪分析。通过对在DC中优先表达HSV-1 TK自杀基因的转基因小鼠进行7天GCV治疗，可获得s-DC缺失(47,48). 如前所述，根据CD11c标记和MHC II类分子的表达对s-DC和l-DC亚群进行分析(46).

然后我们研究了阴道粘膜的常驻LC在阴道激发后是否会将HIV-1引向LN。艾滋病病毒1型_{拉丁美洲国际}阴道激发24小时后，在四只小鼠中的两只小鼠的引流淋巴结中检测到，但在任何腹股沟和腰椎淋巴结中均未检测到（图。（图4B）。4B） ●●●●。总之，这些结果表明，阴道粘膜的LC可以将HIV引向其排出的LN。

DC参与静脉接种后HIV向LN的转运。

我们最近发现外周LN的髓系相关DC亚群（s-DC）（图。（图5）5)具有吸收血液大分子并将其输送至LN的能力(46). 因此，我们旨在分析它们是否也能将病毒颗粒从血室输送至LN。

我们注射了HIV-1_{拉丁美洲国际}将上清液静脉注射到正常小鼠中，30分钟后，我们研究了HIV堵住RT-PCR检测外周LN池和肾脏中的RNA。因为在这种情况下，病毒接种物会立即在血室中稀释，所以我们注射了比上述实验中更大体积的病毒上清液（150μl）。艾滋病毒堵住八分之六的外周淋巴结中，RNA信号较强，八分之二的外周血淋巴结中RNA信号较弱（表（表2）。2). 在所有病例中，由于血液含量高而被选为阳性对照组织的肾脏也被发现对HIV呈阳性堵住RNA。尽管这不太可能，但阳性LN信号可能是由于血液污染引起的。为了排除这个假设，我们用s-DC特异性缺失的小鼠重复了这些实验。我们使用了在DC中优先表达HSV-1 TK基因的转基因小鼠模型(1,27,28,46——48). 更昔洛韦（GCV）在HSV-1 TK表达细胞中特异性代谢为毒性类似物，可杀死分裂的HSV-1表达TK的DC。如图所示。图5，5，7天GCV治疗显著影响s-DC，其减少约10倍（从对照小鼠总LN细胞的0.2%到0.4%，到DC缺失小鼠的0.03%到0.05%）(46). 相比之下，根据其周转率，这种治疗并不影响l-DC，并且整个LN结构也没有受到影响(第27页). 确定s-DC在Hi-HIV中的作用_{拉丁美洲国际}我们前往LN，进行了Hi HIV静脉注射_{拉丁美洲国际}s-DC缺失小鼠。如表所示表2，2，无HIV堵住在八个LN细胞池中的五个中检测到RNA，而在八个池中的两个中检测出弱信号，在八个库中的一个中检测出来强信号。这些结果通过使用定量RT-PCR试剂盒进行临床HIV-1检测得到证实，并对来自对照组和DC缺失小鼠的总外周LN细胞进行RT-PCR（表（表2）。2). 在第二个独立实验中也得到了类似的结果。

表2

HIV检测堵住静脉注射150μl Hi-HIV后30分钟，对照组和DC缺失小鼠外周LN中的RNA_{拉丁美洲国际} 上清液

老鼠	堵住逆转录聚合酶链反应^一		定量RT-PCR（HIV RNA拷贝/10μg总RNA）^b条
老鼠	游泳池L	池R	定量RT-PCR（HIV RNA拷贝/10μg总RNA）^b条
控制	+	+	461
	+	+/−	1,523
	+	+	762
	+/−	+	299
直流电耗尽	+	−	无法检测
	+/−	−	无法检测
	−	+/−	无法检测
	−	−	无法检测

在单独的窗口中打开

^一在RT-PCR分析之前，分别采集左右轴、肱骨和腹股沟LN，并将其混合到两个池中（L和R），强信号；+/-，弱信号；−，没有信号。

^b条对每只小鼠的总LN（L池+R池）进行定量RT-PCR。

总之，这些结果表明DC可以在血液中吸收HIV-1并将其输送至LN。

讨论

猕猴阴道接种SIV(50)揭示了DC在引发原发性感染中的作用。这些实验清楚地表明，在最初的病毒攻击后，病毒在排出的LN中迅速（不到2天）被检测到。第2天，病毒已经传播，如在脾脏和非训练性LN中检测到的病毒所示(50). 因此，这些事件的动力学和定位与已知的DC迁移模式以及与T细胞的生理相互作用密切相关。因此，通过推断，假设接种部位的DC感染了HIV，迁移到LN，并将HIV感染传播到局部T细胞，然后成为病毒传播的接种点。然而，这些实验也对DC的确切作用提出了疑问。首先，SIV感染的细胞仅在宫颈阴道粘膜的固有层中检测到，而在上皮中没有检测到。因此，病毒是如何渗入固有层的，其他细胞是否参与了SIV感染的初始步骤？其次，这些感染细胞还没有被正式鉴定为DC。第三，在所研究的四只动物中，只有一只在阴道训练LN中检测到SIV。因此，尚需正式证明哪些DC是性接触HIV后的最初感染细胞，是否对其系统传播负责。然而，对于大型动物和感染性病毒，这些实验很难进行，而且费用昂贵。这使我们研究了使用老鼠更详细地分析其中一些事件的可能性。

虽然小鼠细胞不能感染HIV，但小鼠模型似乎适合解决其中一些问题，部分原因是小鼠骨髓来源DC和黑猩猩DC的迁移模式相似(5). 事实上，我们的结果表明，即使在没有生产性感染的情况下，无论给药部位如何，小鼠DC也能够将HIV从外围转运到排出的LN。

应该强调几点。首先，通过细胞分选纯化DC，证明DC在皮下注射后HIV传播中的作用。其次，在100%的注射小鼠中未检测到HIV-1 RNA的事实很可能是由于检测技术的敏感性，这可能在未来得到改进。此外，应该指出的是，在进行的10个独立实验中，我们从未在单个非训练LN中检测到任何病毒信号。感染性HIV-1的实验也是如此_{拉丁美洲国际}可以在8只受试动物中的2只的排泄LN中发现。在LN中检测到活的传染性HIV-1，即使是在一次情况下，也表明它可以从外周转移到LN，同时保持其传染性。第三，嗜淋巴细胞株和嗜巨噬细胞株均显示了DC对HIV的转运；后者被认为是介导人类原发感染的主要菌株(4,14). 第四，我们的数据表明，树突状细胞可能在HIV-1传播中发挥主要作用，而不会产生生产性感染。这与之前的体外观察结果相一致，这些观察结果也表明DC在HIV感染T细胞的过程中发挥作用(9,11). 最后，我们的结果为SIV感染猕猴的阴道表层粘膜中没有感染DC提供了可能的解释。我们认为，在易受HIV或SIV感染的灵长类动物中，这些病毒可以被常驻粘膜LC感染，后者会将它们携带到LN而不会被感染。

值得注意的是，小鼠DC可以结合和运输HIV-1，而不会消除病毒的传染性。有趣的是，体外实验表明，与DC孵育的HIV可以逃避胰蛋白酶治疗，并对T细胞保持感染性(6,10). 因此，无论是人还是鼠，树突状细胞都有可能将病毒结合并保留在细胞膜上，在那里，病毒可以被隔离在由细胞表面树突状突起形成的隔间内(6). 或者，病毒可能被内化到细胞质小泡中。

值得注意的是，HIV与小鼠DC的结合并不需要hCD4受体。此外，如转基因hCD4获得的结果所示，其存在并没有显著影响DC对HIV的转运⁺小鼠DC。因此，HIV与DC的结合必须涉及其他机制，可能与HIV包膜蛋白的糖基化和/或DC上甘露糖受体的存在有关(45). 最近有研究表明，HIV-1能够通过CD4依赖机制与LC结合(6).

虽然HIV-1从粘膜到淋巴结的转运涉及LC或DC，但我们首次表明，HIV-1在血液到淋巴结中的转运似乎涉及另一个最近表征的DC亚群。这些细胞具有不成熟的表型，似乎与髓系相关(46). 它们吸收血液分子并将其携带至LN的独特能力表明，它们在对血液抗原和微生物的免疫反应中发挥着重要作用。在这种情况下，这一特性似乎被艾滋病毒破坏，以促进病毒传播和建立慢性感染。

总之，我们的数据强烈表明，未感染的DC通过性传播或直接静脉接种介导HIV-1感染的初始步骤。此外，根据接种部位的不同，不同的DC亚群参与HIV-1的摄取：性传播时的局部LC衍生DC（l-DC）或静脉注射后的血液DC（s-DC）。在这两种情况下，病毒都会被携带到LN，在那里，当病毒传播到CD4时，会发生广泛的病毒复制⁺根据几份报告，T细胞(12,15,38). 由此产生的病毒将导致艾滋病毒在整个淋巴系统传播。

我们建立了一个小鼠模型来研究DC在HIV-1传播中的作用。这个模型使用了一种小的、广泛可用的、价格低廉的动物。此外，分析HIV-1向LN的转运不需要感染性HIV-1，因此大大简化了实验条件。此外，现在应该可以在小鼠模型中分析从DC到LN T细胞的HIV传播。事实上，表达hCD4受体和CCR5共受体的双转基因小鼠的T淋巴细胞容易感染HIV(7). 因此，小鼠模型可能有助于测试影响HIV-1传播的不同因素（如激素浸润）(33,40)，筛选粘膜应用后可阻止HIV-1传播的分子，并测试疫苗在感染早期触发粘膜免疫攻击HIV-1的能力。

鸣谢

我们感谢Jean-Claude Gluckman对手稿的批判性阅读，感谢Roger Lacave和Michelle Rosenzwajg对一些实验的帮助。

这项工作得到了皮埃尔和玛丽·居里大学、巴黎援助出版社和国家科学研究中心的支持。C.M.得到ARDIVI和ARMO的支持，N.G.得到Sidaction的支持。

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文章来自病毒学杂志由以下人员提供美国微生物学会（ASM）