人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）是逆转录病毒慢病毒亚家族的成员。像所有逆转录病毒一样，慢病毒编码堵住,波尔，以及环境价值基因。然而，慢病毒也含有几个附属基因。副基因虚拟专用单元是HIV-1特有的，编码病毒蛋白U（Vpu）(44)，一种16-kDa I型完整膜磷蛋白，可在体内外形成寡聚结构(32,43). 间接免疫荧光表明Vpu主要定位于高尔基复合体(29)，但一些Vpu也与质膜相关(17). 该蛋白包含一个疏水的N末端结构域和一个C末端亲水的细胞质结构域，N末端结构域作为膜锚定物(32).
Vpu在HIV-1复制中扮演两个角色。首先，Vpu在无细胞系统中促进HIV-1受体CD4的特异性降解(8)和体内(41,47). CD4的降解通过将其从与CD4的复合物中释放出来，从而增强HIV-1包膜糖蛋白的运输和后续处理，该复合物将两种蛋白都困在内质网中(28). Vpu与CD4胞质域的直接相互作用对于CD4降解是必需的，但还不够(4). 突变分析表明，Vpu的亲水细胞质结构域是Vpu介导的CD4降解所必需的(40). Vpu的第二个功能是增强病毒颗粒的释放(19,29,43,45,48). Vpu对病毒颗粒释放的影响似乎由内质网后室介导(41). 虽然Vpu的细胞质结构域对CD4的降解很重要，但Vpu跨膜结构域足以部分增强病毒的释放(40). 因此，基于不同的细胞内作用位点和遗传标准，Vpu的双重作用在机制上是不同的。HIV-1 Gag蛋白足以形成未成熟的病毒衣壳，并且这些衣壳完全能够促进Vpu介导的释放增强，这表明颗粒释放过程中Vpu的最终靶标是Gag固有的(30).
对HIV复制中起作用的宿主细胞蛋白质的鉴定为深入了解HIV-1生物学的复杂性提供了重要的信息。CD4作为T细胞上主要病毒受体的鉴定为病毒进入提供了一个基本范例(10). 趋化因子受体是参与免疫系统细胞趋化性的蛋白质，被HIV-1协同作用，允许与CD4一起进入宿主细胞(2,13). 尿激酶型纤溶酶原激活物是一种参与巨噬细胞组织侵袭的蛋白酶，它结合并裂解HIV-1包膜糖蛋白gp120，增强HIV-1在巨噬细胞中的感染性(24). 亲环素是与免疫抑制药物环孢菌素A（CsA）结合的蛋白质，是免疫亲素超家族的成员，包括促进蛋白质折叠的成员(18). 亲环素A、B和C与HIV-1 Gag相互作用，亲环素A并入病毒(15,31,46). 亲环素A并入病毒颗粒是膜融合和反转录之间复制的早期步骤所必需的(5). Furin是一种枯草杆菌素样内蛋白酶，介导HIV-1包膜糖蛋白前体gp160裂解为gp120和gp41，这是病毒感染所需的过程(22).
我们使用酵母双杂交系统筛选CD4阴性B淋巴细胞cDNA表达文库中能够与Vpu相互作用的细胞蛋白。该筛选产生的主要cDNA是一种新的cDNA，编码一种在人类组织中广泛表达的41-kDa蛋白。该蛋白质包含四个34氨基酸重复基序拷贝，称为四肽重复序列（TPR）。TPR蛋白家族由多种功能的蛋白质组成，包括细胞器靶向蛋白质(11,25)，参与有丝分裂的蛋白质(26,42)，嗜免疫性(6,36)和核磷酸酶(7). 我们的结果表明，这种新的Vpu结合蛋白（UBP）与Vpu和Gag在功能上相互作用。UBP似乎是Vpu和Gag之间的中介，可能在病毒组装或释放中发挥作用。
材料和方法
DNA构建。
要构建pKT106虚拟专用程序从pGB107中扩增出基因(16)，HIV-1感染性分子克隆pNL4-3的衍生物(1)使用引物vpu1（5′-AGTACATCATGCAACCTA-3′）和vpu2（5′-TCCACAGCATCCCCATA-3′）。308-bp扩增产物经凝胶纯化并用Nde公司我和巴姆HI并克隆到质粒pAS1-CYH2（pAS1的衍生物[12]含有环己酰亚胺敏感性基因）Nde公司我和巴姆嗨。pVpui9-1是一个含有ubp公司具有完整5′端的cDNA。五个的序列分析ubp公司cDNA分析表明，pVpui9-1的cDNA缺失了47 bp的3′非翻译区，包括聚腺苷酸化信号和聚（A）尾。图中的顺序。由pVpui9-1的cDNA插入加上其他cDNA的3′端的47 bp得到。pKT173是通过克隆1412-bpXho公司我-精神分裂症pVpui9-1的I片段，包含整个ubp公司将区域编码到pCITE-2a（Novagen）中Xho公司我和精神分裂症I.pKT199在耦合的体外转录翻译系统中表达Vpu，通过插入一个310-bpNde公司我-巴姆HI片段从pKT106切割成pCITE-2aNde公司我和Bgl公司二、。pGEX-UBP是通过插入2204-bp来创建的Xho公司I片段从pVpui9-1进入萨尔pGEX-4T-1（Pharmacia）的I站点。pHIV-UBP是通过克隆一个1705 bp的长末端重复序列（LTR）产生的，表达HIV-1长末端重复片段（UBP）Xho公司我-Nru公司pVpui9-1的I片段包含整个ubp公司将区域编码到pBG139(19)被切断的萨尔我和斯图I.pJL90是通过放大堵住pNL4-3中的基因带有引物1（5′-CGGGATCCGAGAGCGTGCGGTATTAAG-3′）和2（5′-GCTCTTAGACCTGTACTAAGAGCTTC-3′）。PCR产物经凝胶纯化，用巴姆HI和Xba公司一、 并插入用相同的两种酶切过的pQE30（Qiagen）中。pHIVTF（stop）是通过pMSMΔEnv2的PCR扩增构建的，它包含一个突变，该突变在反式脂肪酸肽的第二个氨基酸之后立即产生一个提前终止密码子(33)带有敏感引物23233（5′-GGCGAGAGAACCAAGG）和反义错配引物8264Afl公司II（5′-CAAAGAGTGACTTAAGGGAGCTAAAG）。用反义引物23234（5′-CCTATAGCTTTATGTCCGCAG）和义错配引物8265对pMSMΔEnv2进行PCR扩增，得到第二个片段Afl公司II（5′-CTTAGCTTCCTTAAGTCACTCTTG）。这些碎片被消化Afl公司二、 用引物23233和23234进行结扎和扩孔。扩增片段用Spe公司我和Bcl公司一、 这个922-bp的片段被连接到pMSMΔEnv2中，该pMSM△Env2也被Spe公司我和Bcl公司I.pHJ121是通过引入萨尔我-Nhe公司pBG135的I片段(19)包含突变的虚拟专用程序pHIVTF（停止）中的基因也被切割萨尔我和Nhe公司一、。
的顺序ubp公司编码区和侧翼未翻译区。最长的完整核苷酸序列ubp公司从双杂交系统Vpu筛选获得的cDNA显示为推导出的开放阅读框氨基酸序列。每行左边的数字表示核苷酸位置。四个TPR基序带有下划线，多聚腺苷化信号带有双下划线。
两个混合系统库屏幕。
酿酒酵母190日元(垫子一leu2-3112 ura3-52 trp1-901 his3-200 ade2-101 lys2-801 gal4Δgal80Δura3:：GAL-lacZ lys2:：GAL-his3 cyh第页)首先用pKT106转化为Trp原营养体，表达Vpu融合到GAL4 DNA结合域（DBD）。含有该质粒的细胞在Trp-减合成完全培养基中生长，并用克隆到质粒pACT中的人类B淋巴细胞cDNA文库转化(12)，将各种cDNA编码蛋白表达为与GAL4转录激活域的杂交。如前所述进行转换(39). 双转化酵母细胞生长在缺乏His、Leu和Trp的合成完整培养基上(37)并且含有25 mM 3-氨基-1,2,4-三唑（Sigma），并且生长的酵母菌落受到5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d日-吡喃半乳糖苷（X-Gal）集落过滤法(12). 来自His的cDNA质粒+分离X-Gal分析中染蓝的菌落，并测试其单独激活转录的能力，那些激活的菌落作为假阳性被丢弃。通过限制性酶切和测序分析阳性候选克隆。
体外蛋白质结合分析。
对于谷胱甘肽S公司-转移酶（GST）-UBP/Vpu结合试验、GST和GST-UBP融合蛋白在大肠杆菌，分别使用质粒pGEX-2T和pGEX-UBP。根据制造商的说明，使用谷胱甘肽-脑葡萄糖（法玛西亚）纯化蛋白质。使用Bradford分析（Bio-Rad）定量蛋白质浓度。Vpu由质粒pKT199表达，使用Tn个T兔网织红细胞裂解物体外转录翻译系统（Promega）符合制造商的说明。在23μCi的Tran存在下进行反应35S-label（ICN）用于放射性标记蛋白质。在孵育期后进行多个25μl反应并合并。将20微升混合的Vpu与30 pmol的GST单独或GST-UBP混合，并使用结合缓冲液（50至200 mM NaCl、20 mM Tris-HCl[pH7.9]、1 mM EDTA、5%甘油、0.02%Nonide P-40[NP-40]）将结合反应混合物的总体积增加至200μl、每毫升2μg亮肽、每毫升100μg苯甲基磺酰氟[PMSF]、0.05%牛血清白蛋白[BSA]）。结合反应混合物在4°C的摇床上孵育2 h，然后在室温下孵育1 h。向每个反应混合物中添加25-μl床体积的谷胱甘肽-脑葡萄糖珠，并在室温下在摇床上再孵育反应混合物2 h。珠子在1毫升结合缓冲液中洗涤三次，并重悬在30μl标准十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）蛋白质样品缓冲液中。样品在沸水浴中加热4分钟，在微型离心机中以14000 rpm旋转5分钟，然后加载到SDS–15%聚丙烯酰胺凝胶上。
对于使用细菌中表达的Gag进行GST-UBP/Gag相互作用分析，His-tagged HIV-1 Gag前体和GST-UBP融合蛋白在大肠杆菌分别使用质粒pJL90和pGEX-UBP。用异丙基-β从细菌表达质粒中诱导蛋白质-d日-按标准方法测定的硫代吡喃半乳糖苷(38). 诱导后2 h造粒细菌，用TEK缓冲液（20 mM Tris-HCl，100 mM KCl，1 mM EDTA[PH7.4]）洗涤一次，然后再悬浮在裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl，100mM KCl、1 mM EDTA，5 mM二硫苏糖醇，1 mM-PMSF，0.5%NP-40[PH7.4]）中。将细菌颗粒冻融并超声四次，每次15秒。在14000 rpm的微型离心机中通过离心10分钟来造粒不溶性材料。上清液中的总蛋白浓度通过Bradford染色结合程序（Bio-Rad）测定。将上清液调节为20%甘油，并储存在−80°C下。将His-tagged Gag蛋白（约0.1μM）与GST-UBP融合蛋白或GST蛋白（约0.5μM）在4°C的300μl Triton缓冲液（50 mM Tris-HCl，300 mM NaCl，0.5%Triton X-100[PH7.4]）中在摇动平台上孵育1小时。孵育后，50μl床体积的谷胱甘肽-脑葡萄糖珠（法玛西亚）添加到每个反应混合物中，然后再继续培养半小时。在微型离心机中通过10-s离心将谷胱甘肽-Sepharose珠粒化，然后用500μl Triton缓冲液洗涤三次。用20μl 4×蛋白质样品缓冲液（8%十二烷基硫酸钠、50 mM Tris、40%甘油、24.8 mg二硫苏糖醇/ml、0.4%溴酚蓝、5%2-巯基乙醇[pH6.8]）重新悬浮洗涤过的谷胱甘肽-脑葡萄糖珠，调节至最终体积80μl，然后在沸水浴中加热5 min。在微离心机中造粒珠子后，使用抗Gag多克隆抗血清对上清液进行SDS-PAGE和Western blot分析。
在使用HeLa细胞中表达的Gag进行GST-UBP/Gag结合分析时，细胞保存在含有7%小牛血清的Dulbecco改良Eagle's培养基中。转染前一天，将80万个细胞接种到直径为100 mm的培养皿中。通过磷酸钙共沉淀转染HeLa细胞，然后用两种方法之一进行甘油休克虚拟专用单元+蛋白酶−前病毒结构[pHIVTF（stop）]或虚拟专用单元−蛋白酶−前病毒结构（pHJ121）。在转染后48至60 h，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞一次，并用150μl Triton裂解缓冲液（0.5%Triton X-100，50 mM Tris，300 mM NaCl[PH7.5]）溶解细胞。在冰上孵育30分钟后，以7000 rpm旋转裂解物6分钟，使细胞碎片颗粒化，将上清液转移到新试管中，并在−20°C下储存。通过使用p24抗原捕获酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（Coulter Corporation）测定Gag浓度。结合试验的条件与上述细菌表达Gag蛋白的结合试验条件相同。
免疫亲和柱层析。
用亲和凝胶10（Bio-Rad）和纯化的抗His-UBP兔血清免疫球蛋白G（IgG）构建免疫亲和柱。将IgG在4°C的耦合缓冲液（0.1 M HEPES[pH8.0]）中与基质偶联4 h，置于玻璃柱中，并用柱洗缓冲液（10 mM磷酸钠[pH6.8]）广泛洗涤。用PBS洗涤HeLa细胞两次，然后用细胞裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl[pH7.4]，300 mM NaCl，10 mM碘乙酰胺，0.5%Triton X-100，0.2 mM PMSF，0.5 mM亮氨酸蛋白酶）进行裂解。通过重力流将细胞裂解物放置在柱上，并使用10个床层体积的洗涤缓冲液对柱进行洗涤。用100 mM甘氨酸（pH 2.5）洗脱结合蛋白，并收集1 ml组分。将含有蛋白质的组分在280 nm处的光密度下进行混合，并在Centricon浓缩器（Amicon）中浓缩至100μl体积。然后通过蛋白质印迹分析这些组分的UBP和Vpu。
北方印迹法。
25毫微克2-kb人β-肌动蛋白cDNA或2204-bpXho公司pVpui9-1的I片段用[α-32P] dCTP（Amersham），根据制造商的指示，使用随机定时标记工具（Boehringer Mannheim）。使用Sephadex G-50柱（Boehringer Mannheim）从反应中去除未结合核苷酸。根据制造商的指示，将每个标记反应中的所有标记探针用于单独的杂交反应，以探测多个人类组织Northern blot（MTN blot II；Clontech）。
抗体生产和纯化。
His-tagged UBP、His-tag HIV-1 Vpu胞质域和His-tagHIV-1 Gag蛋白在大肠杆菌并根据制造商的说明，在变性条件下用Ni-硝基三乙酸琼脂糖（Qiagen）进行纯化。将蛋白样品与1×PBS进行通宵透析。用透析后的His标记蛋白制备兔多克隆抗血清。粗抗Gag血清用于Gag Western blots。根据制造商的说明，使用DEAE Affi-Gel蓝（Bio-Rad）或蛋白A-琼脂糖（Bio-Rad）从抗UBP或抗Vpu兔血清中纯化IgG。对于UBP蛋白印迹，使用固定在Ni-硝基三乙酸琼脂糖上的His-UBP进一步纯化抗UBP抗体。
蛋白质印迹。
为了检测哺乳动物细胞中的UBP或Vpu，细胞在NP-40裂解缓冲液（100 mM NaCl，20 mM[Tris pH7.9]，1 mM EDTA，0.5%NP-40）中进行裂解，并在微型离心机中进行低速离心以去除细胞碎片。将清除的细胞裂解物与标准SDS-PAGE蛋白样品缓冲液混合，并在SDS–15%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。免疫亲和柱样品在SDS–10至20%聚丙烯酰胺梯度凝胶上电泳。通过在转移缓冲液（27.2 mM Tris，192 mM甘氨酸，20%甲醇）中使用微型转斑点电印迹仪（Bio-Rad），在4°C 150 mA恒流下将蛋白质转移至Immobilon-P膜（Millipore）2 h。在封闭缓冲液中隔夜封闭膜（5%干乳，20 mM Tris，0.01%NaN三). 然后将膜在含有1:2000稀释的IgG纯化或抗原亲和力纯化兔多克隆UBP抗体或IgG提纯兔多克隆Vpu抗体的封闭缓冲液中在室温下培养4小时。在清洗缓冲液中清洗膜三次（20 mM Tris，100 mM NaCl，0.3%吐温20，0.005%NaN三)随后在含有碱性磷酸酶结合山羊抗兔IgG（γ链特异性）抗体（Sigma）1:10000稀释液的封闭缓冲液中在室温下培养2小时。如前所述洗涤膜，然后在室温下在5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-硝基蓝四氮唑（Sigma）中孵育15分钟。
除抗原亲和力纯化抗荧光素酶兔多克隆抗体（Promega）的1:5000稀释液用于初级培养外，荧光素素酶的Western blot分析如上所述进行。
对于GST-UBP/Gag结合分析，使用Trans-Blot Cell电印迹仪（Bio-Rad）将聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质转移到硝化纤维素膜上。将膜在封闭缓冲液（5%干乳–PBS中的3%BSA）中封闭40 min，然后在含有5%干乳和1%BSA以及1:200稀释的兔多克隆抗Gag抗体的PBS中培养1 h。在1×洗涤缓冲液（PBS中0.05%吐温20）中洗涤膜20分钟，在含有5%干乳和1%BSA的PBS中培养，并用1:2500稀释的35S标记的山羊抗兔IgG抗体。荧光图像分析用于定量测定蛋白质印迹。
DNA测序和序列分析。
使用Sequenase双脱氧核苷酸测序试剂盒（美国生化）对cDNA进行部分测序。最长的ubp公司在自动测序装置（Applied Biosystems）中对pVpui9-1的cDNA进行测序。使用国家生物技术信息中心BLAST电子邮件服务器对数据库进行序列相似性搜索(三). 序列基序的准确位置通过使用MacVector序列分析程序（国际生物技术）和手动分析确定。序列一致性和相似性是手动计算的，或者使用威斯康星州遗传计算机集团的Bestfit程序进行计算。
p24抗原捕获ELISA颗粒释放试验。
5×10的三重培养物5HeLa细胞在电镀后1天通过磷酸钙共沉淀与1μg pGB108（和环境价值−HIV-1分子克隆NL4-3的衍生物[16])或pBG135（a虚拟专用单元−GB108的衍生物[19])以及14μg pHIV-UBP或pTAR-luc（一种表达HIV-1 LTR中萤火虫荧光素酶的质粒）。转染后36小时，收集等分培养液并进行低速离心以去除细胞碎片，将上清液转移到新试管中。细胞在PBS中清洗，刮入1ml PBS，并转移到离心管中。细胞在6000 rpm的微型离心机中造粒5 min，细胞颗粒在50μl NETN缓冲液（0.5%NP-40，1 mM EDTA，20 mM Tris[PH8.0]，100 mM NaCl）中溶解。将裂解液进行低速离心，并将上清液转移到新试管中。用p24抗原捕获ELISA（Coulter）测定培养基样品和细胞裂解液中p24抗原的含量。
结果
Vpu与一种新型细胞蛋白的相互作用。
两条证据与Vpu和一个或多个细胞因子之间的相互作用一致。Vpu可以显著增强逆转录病毒颗粒的释放，其差异与HIV-2、visna病毒和Moloney小鼠白血病病毒一样(21)尽管程度低于HIV-1颗粒。此外，Vpu介导的病毒释放增强依赖于细胞类型。Vpu是从某些细胞（如HeLa细胞和CD4细胞）有效释放病毒颗粒所必需的+T淋巴细胞系，但不是来自其他细胞，如COS-1或CV-1猴肾细胞(20)或BALB/c小鼠淋巴母细胞瘤细胞(23).
鉴定可能在Vpu（酵母双杂交系统）活性中起作用的细胞蛋白(14)最初用于筛选人类CD4阴性B淋巴细胞cDNA表达库中与Vpu相互作用的蛋白质。双杂交系统基于酵母转录因子GAL4的DNA结合域和转录激活域的并置。Vpu作为与GAL4-DBD的融合蛋白表达，cDNA文库编码的蛋白质作为与GAL4激活结构域的融合蛋白表达。如果一个特定的cDNA编码蛋白与Vpu相互作用，则GAL4的两个结构域紧密结合，GAL4功能恢复。这会激活整合到酵母染色体中的两个GAL4应答报告基因：他的3基因，赋予酵母在缺乏组氨酸的培养基上生长的能力，以及大肠杆菌lacZ基因，在X-Gal菌落过滤试验中使菌落染蓝。
我们在两个杂交系统中筛选了150万个酵母转化体与Vpu相互作用，获得了13个His+β-半乳糖苷酶+克隆。在没有GAL4-DBD-Vpu和其他标准的情况下，根据转录激活情况排除假阳性，将其缩小到五个候选cDNA表达质粒。部分序列分析和限制性内切酶分析表明，这五个cDNA包含相同序列的不同长度。含有最长cDNA的质粒pVpui9-1也在双杂交系统中进行了测试，该质粒编码GAL4 DBD与两种与Vpu无关的蛋白（小鼠肿瘤坏死因子受体相关因子2和人类ADP核糖基化因子1）之间的融合蛋白。cDNA编码的蛋白质没有与这些蛋白质结合，表明Vpu与pVpui9-1表达的蛋白质之间的相互作用在酵母中是特异的（数据未显示）。图显示了最长cDNA的完整序列。对序列数据库的搜索发现，仅与功能未知的部分cDNA序列相匹配（登录号：。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“Z13137”，“term_id”：“24708”，“term_text”：“Z13137”}}Z13137号和{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“D58427”，“term_id”：“968061”，“term_text”：“D58427“}}天58427)表明这是一个新的cDNA序列。我们将此序列及其编码UBP的蛋白质称为Vpu结合蛋白。这个ubp公司编码区长1146 bp，对应于一个382残基蛋白，预测分子量为41.25 kDa。这个ubp公司mRNA包含一个异常长的3′非翻译区，长度为987bp。如下文所述，UBP是TPR蛋白家族的成员，包含四个TPR基序。
为了验证双杂交系统证明的Vpu-UBP相互作用，进行了体外结合试验。UBP被表达为与GST酶的一部分融合蛋白。然后测试GST-UBP融合蛋白与体外翻译的35标有S的Vpu（图。A） ●●●●。在75 mM NaCl下，Vpu与GST-UBP（车道3）的结合水平显著高于通过磷光图像分析测量的GST单独背景（车道2）。Vpu-UBP相互作用对盐浓度的敏感性在不同的实验中略有不同，但背景上的最高折叠结合始终在50至100 mM NaCl范围内（数据未显示）。
Vpu与UBP在体内外的相互作用。（A） GST-UBP融合蛋白和GST单独表达并纯化，如材料和方法所述。使用Bradford分析（Bio-Rad）测量蛋白质浓度。等量的GST-UBP（第3道）或GST单独（第2道）在含有35在体外翻译的Vpu中标记S。在谷胱甘肽Sepharose珠上回收GST或GST-UBP，并通过SDS-PAGE和荧光图像分析检测Vpu。通道1显示了结合反应中使用的输入Vpu的1%。（B） 模拟转染的（m）HeLa细胞（1区）或转染有虚拟专用单元−（pBG135；车道2）或虚拟专用单元+（pGB108；lane 3）前病毒DNA构建物按照材料和方法中所述进行抗UBP免疫亲和柱层析分析。来自免疫亲和柱的洗脱物显示在泳道4-6中（泳道4，模拟；泳道5，pGB108；泳道6，pBG135）。细胞裂解物和柱部分用抗UBP（顶部）或抗Vpu（底部）抗血清进行Western blot分析。His-tagged公司大肠杆菌-表示Vpu显示在第7车道。
用抗UBP抗体构建的免疫亲和柱在体内验证了Vpu与UBP的结合。第108页(16)是一个环境价值−HIV-1感染性分子克隆NL4-3的衍生物。第BG135页(19)是一个虚拟专用单元−GB108的衍生物。HeLa细胞裂解物，代表mock（泳道1），pBG135（泳道2，Vpu−)，或pGB108（Vpu 3车道+)将转染剂置于柱上。从色谱柱中洗脱出来的蛋白质显示在两个面板的通道4至6中。正如预期的那样，当通过Western blotting分析时，所有三种条件下的洗脱液都显示UBP富集（图。B、 顶部，车道4至6）。当检测免疫亲和柱部分的Vpu时，仅在一条通道中出现一条与转染pGB108的细胞相对应的明显带（图。B、 底部，车道5）。UBP和Vpu均未与免疫前兔血清制成的免疫亲和柱结合，表明抗UBP柱纯化Vpu是由于与UBP的特异性相互作用（数据未显示）。这些结果表明，UBP和Vpu在体内稳定相互作用。
识别表达ubp公司RNA，我们对八种人类组织（脾、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、结肠、小肠和外周血白细胞）的RNA进行了Northern blot分析，使用ubp公司cDNA探针。实验结果表明ubp公司RNA在这些组织中表达（图。A） ●●●●。此外，检测到的RNA的长度（2600个核苷酸）与ubp公司cDNA（2221bp），考虑到在ubp公司mRNA。
（A） Northern印迹分析ubp公司来自人类细胞的RNA。顶部，来自人脾脏（泳道1）、胸腺（泳道2）、前列腺（泳道3）、睾丸（泳道4）、卵巢（泳道5）、小肠（泳道6）、结肠（泳道7）和外周血白细胞（泳道8）的mRNA，用探针探测ubp公司cDNA探针；底部，剥离并用β-肌动蛋白控制探针重制时的相同斑点。nt，核苷酸。（B） UBP的体外翻译。质粒KT173用于在耦合转录-翻译系统（Tn个T；Promega）在场[35S] 蛋氨酸和[35S] 半胱氨酸和蛋白质通过SDS-PAGE分析并通过磷光图像分析检测。（C） UBP在HeLa细胞中的内源性表达和过度表达。由于pHIV-UBP中UBP的高水平表达依赖于Tat，质粒pHIV-UBP与表达HIV-1Tat（pGB108）的质粒共转染[16]). 使用IgG纯化的兔多克隆抗UBP抗体对模拟转染HeLa细胞（第1道）、仅转染pGB108的HeLa电池（第2道）和转染pHIV-UBP和pGB108（第3道）的HeLa-细胞的裂解液进行Western blot分析。
要确定ubp公司我们构建了pKT173，一个表达ubp公司噬菌体T7启动子的编码区。pKT173用于编程进行体外偶联转录-翻译反应。如图所示。B、 产生了约42kDa的蛋白质。确保ubp公司cDNA包含整个编码区，我们构建了pHIV-UBP，一个表达ubp公司该质粒用于在HeLa细胞中过度表达UBP。转染后48 h裂解细胞，并用兔多克隆UBP抗血清对裂解产物进行Western blot分析。如图所示。C、 在转染pGB108和pHIV-UBP（第3通道）的细胞中产生了凝胶上流动性略有不同的两种UBP物种，这两种物种与模拟转染（第1通道）和GB108转染（第一通道）细胞中的两种内源性UBP物种混合。因此ubp公司cDNA似乎包含一个全长开放阅读框。COS-1和CEM（a CD4）裂解产物的Western blot分析+T细胞系）细胞表明UBP也在这两种细胞类型中表达（数据未显示）。HeLa细胞中两种UBP的起源尚不清楚。两个物种中较大的可能是翻译后修饰的结果。或者，两种UBP中较小的一种可能是UBP的稳定降解或蛋白质水解产物。此外，在HIV-UBP转染细胞的裂解液中可检测到两条25-28kDa的小条带。虽然这些物种的起源尚不清楚，但这些条带很可能代表了UBP的降解产物。由于UBP的高表达，在HIV-UBP转染细胞中更容易检测到。
UBP是TPR蛋白家族的一个新成员。
推导出的UBP氨基酸序列用于在序列数据库中搜索与UBP相似的多肽。这项研究的结果确定了一组非常不同的蛋白质，包括一种功能未知的蛋白质秀丽隐杆线虫，一种功能未知的蛋白质酿酒酵母，两种免疫亲素（CyP-40[36]和FK506结合蛋白59[FKBP59][6])，两种细胞器靶向蛋白（Pxr1p[11]和MAS70[25])，一种核丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（PP5[7])和参与有丝分裂的蛋白质（nuc2+[26]和CDC23[42]). UBP与其中四种蛋白质的比较如图所示。A.搜索得到的大多数蛋白质都包含34氨基酸长重复序列基序TPR的多个拷贝(26,42). UBP包含四个TPR基序，其中三个串联（图。和A） ●●●●。UBP和从搜索中鉴定的大多数蛋白质之间的相似性几乎仅限于TPR基序。然而，功能未知的蛋白质来自秀丽线虫和酿酒酵母包含与UBP相似的扩展区域，包括TPR基序以外的序列，表明这些蛋白质可能是人类UBP的同源物。这个秀丽线虫蛋白质与UBP的同源性为45%，相似性为63%，排列中有六个缺口。这个酿酒酵母蛋白质与UBP的同源性为37%，相似性为56%，排列中有8个缺口（数据未显示）。UBP的TPR基序与其他蛋白质的TPR模序和TPR一致序列的比对(26)如图所示。B.UBP的TPR基序与一致序列相匹配，甚至优于先前发表的TPR蛋白的TPR基序。
TPR蛋白家族包含具有多种活性的成员，并且该基序在物理上具有良好的特征。TPR基序可能采用由25-30个氨基酸的两亲性α-螺旋组成的二级结构，随后是短脯氨酸诱导的转向。这种结构的形成已经通过圆二色性和对蛋白质nuc2+的有限蛋白水解证明葡萄裂殖酵母(26). 这些α螺旋被认为通过疏水面在分子内或分子间相互作用。TPR可能参与调节蛋白质之间的相互作用。事实上，免疫亲和素FKBP59的TPR基序(34)过氧化物酶体靶向蛋白Pxr1p(11)和核磷酸酶PP5的小鼠同源物(9)已经证明与蛋白质相互作用有关。
UBP与HIV-1 Gag的相互作用。
HIV-1 Gag蛋白是病毒颗粒的主要成分。由于Gag的表达足以形成粒子并对Vpu作出反应，因此Gag包含Vpu粒子释放增强活性的直接或间接靶点(30). 我们使用了多种方法来确定Vpu和Gag是否直接相互作用，并且没有获得此类相互作用的证据（数据未显示）。然而，另一种可能性是，Vpu增强颗粒释放的能力通过UBP等细胞蛋白中间产物表现出来。为了确定UBP是否与Gag相互作用，我们使用这两种蛋白质进行了体外结合试验。His-tagged HIV-1 Gag前体、GST-UBP融合蛋白和GST单独在大肠杆菌和细菌裂解物用于体外结合试验。他标记的Gag被测试与GST-UBP或单独的GST的相互作用。如图所示。A、 通过磷光图像分析测量，HIV-1 Gag蛋白与GST-UBP（通道2）特异性结合，水平显著高于GST单独背景（通道1）。在1到500 mM NaCl或KCl的盐浓度范围内可以观察到Gag和UBP之间的关联（数据未显示）。发现300 mM NaCl的浓度最适合特定结合。此外，抗UBP免疫亲和柱层析的初步结果表明，UBP与HeLa细胞中的Gag相互作用（数据未显示）。
GST-UBP与细菌和HeLa细胞中表达的Gag之间的相互作用。（A） 左侧，的裂解物大肠杆菌抗Gag抗血清Western blot分析His-Gag蛋白的表达；右图，根据材料和方法中所述，使用His-Gag（左侧面板中显示了总输入量）和GST-UBP（第2道）或GST单独（第1道）进行体外结合试验的结果。用抗Gag抗血清进行Western blot分析，检测结合试验中的Gag蛋白。结合试验中使用的细菌裂解物的总蛋白浓度通过Bradford试验测量。（B） 左图，用抗Gag-Western blot分析转染HeLa细胞裂解物的虚拟专用单元−（车道1）或虚拟专用单元+（车道2）HIV-1前病毒结构。这些裂解物用于材料和方法中所述的体外结合分析，结果显示在中间面板（3号通道，虚拟专用程序−建构；车道4，虚拟专用单元+构造）。来自HeLa细胞裂解物的Gag不单独与GST结合（通道5和6）。凝胶上方显示了HeLa细胞中是否存在Vpu表达。
转染HeLa细胞中表达的Gag蛋白也被测试其与GST-UBP相互作用的能力。HeLa细胞转染pMS156、虚拟专用单元+蛋白酶−HIV-1前病毒结构或pHJ121，a虚拟专用单元−蛋白酶−前体结构(30). 我们检测了转染这些结构的细胞的颗粒释放效率，并观察到预期效果：Vpu存在时颗粒释放效率更高（数据未显示）。然后将转染细胞裂解物用作Gag蛋白的来源，用于体外结合试验。当Gag在没有Vpu的情况下表达时，Gag与GST-UBP稳定地相互作用（图。B、 车道3）。然而，当Gag在Vpu存在下表达时，Gag无法与过量的GST-UBP相互作用，这表明Vpu的共表达消除了稳定的UBP-Gag相互作用（图。B、 泳道4）。为了观察体外转染细胞的Vpu是否与GST-UBP相互作用，从而防止转染细胞Gag与GST-UBP之间的相互作用，Gag和Vpu在单独的细胞培养物中表达，并混合裂解物，然后添加到GST-UBP中。该实验的结果是Gag能够与GST-UBP结合（数据未显示）。这一结果表明，Vpu在体外并不是简单地结合GST-UBP，而是竞争性地抑制GST-UBP-Gag之间的相互作用。因此，在HeLa细胞中，Vpu对Gag结合UBP的能力产生负面影响。综上所述，这些结果表明Gag可能在表达Vpu的细胞中以某种方式被修饰，并且这种修饰使Gag无法随后与UBP相互作用。值得注意的是，抗UBP免疫亲和柱层析的初步结果表明，UBP仅在缺乏Vpu的情况下与HeLa细胞中的Gag相互作用（数据未显示）。
UBP过表达对HIV-1颗粒释放的影响。
为了确定UBP是否影响Vpu介导的病毒释放增强，在存在或不存在Vpu表达的情况下，UBP在病毒产生细胞中过度表达。作为蛋白质过度表达对颗粒释放的非特异性影响的对照，荧光素酶在未过度表达UBP的培养物中表达。使用合适的抗血清进行Western blot分析，证实荧光素酶和UBP的过度表达（图。A） ●●●●。正如预期的那样，缺乏野生型Vpu表达导致颗粒释放减少了五倍（图。B类；比较杆1和3）。在存在Vpu的情况下，UBP过度表达导致病毒释放量减少四倍（图。B类；比较条1和条2）。在缺乏Vpu的情况下，UBP过度表达使颗粒释放量进一步减少了两到三倍（图。B类；比较杆3和4）。过度表达UBP的细胞内p24水平不低于表达荧光素酶的细胞（数据未显示），表明UBP过度表达抑制颗粒释放并非由于高水平UBP的毒性作用。这些结果表明，UBP在病毒产生细胞中的过度表达对HIV-1颗粒释放有负面影响。
UBP过度表达对HIV-1颗粒释放的影响。模拟转染HeLa细胞（通道M）或转染pGB108（通道1和通道2，Vpu+)或pBG135（Vpu第3和第4车道−)和pHIV-UBP（2和4车道，UBP+)或pTAR-luc（车道1和3，luc+) (27). （A） 转染后36小时，用抗原亲和纯化抗荧光素酶（top）和抗原亲和提纯抗UBP（bottom）抗体对细胞裂解物进行Western blot分析。印迹上方的车道编号与面板B中条形图下方的编号相对应。（B）按照材料和方法中的描述，使用p24抗原捕获ELISA检测颗粒释放。数据表示为细胞外与细胞内p24的比值，并根据GB108+TAR-luc共转染（bar 1）进行标准化。这些数据代表了两个独立实验中的一个，实验一式三份。从两个实验中获得了类似的结果。
讨论
UBP的高表达降低了颗粒释放的效率，这一事实表明UBP具有简单的负面作用。此外，观察到Vpu与UBP形成稳定的复合物并消除稳定的UBP-Gag相互作用，这与UBP与Gag的结合有害于病毒释放的观点一致，Vpu的作用是使UBP-Gag复合物解离。然而，仔细查看图中的数据。提供了一种有趣的替代可能性。只有在缺乏Vpu的情况下才能检测到Gag和UBP之间的稳定关联；当存在Vpu时，只观察到稳定的Vpu-UBP络合物。事实上，当Gag在Vpu存在下表达时，没有发现可检测到的Gag与GST-UBP相关，这表明UBP与Gag之间的相互作用以及随后的Vpu解离导致Gag发生不可逆变化，导致Gag无法与UBP相互作用。在这种情况下，UBP是正确颗粒形成和释放所需的因素。UBP的过度表达会通过竞争性抑制Vpu对颗粒释放产生负面影响：过量的游离UBP和Vpu之间的结合会干扰Vpu解离UBP-Gag复合物的能力。
Vpu介导的HIV-1病毒释放增强的可能模型如图所示。.UBP与Gag相互作用，导致Gag-UBP络合物的瞬时形成（在没有Vpu的情况下，这些络合物是稳定的）。然后，Vpu与UBP相互作用，导致Gag-UBP复合物分离。由于产生的Gag不再能够与GST-UBP结合，因此Gag与UBP的相互作用以及随后的Vpu介导的解离似乎导致Gag的不可逆修饰（在图中，Gag*表示此修饰用于启发目的）。Gag的这种非特征化修饰可能以两种方式之一影响Vpu介导的粒子释放。首先，Gag到Gag*的转换可能直接负责增强粒子释放，因为只有由Gag*组成的粒子才能有效释放。或者，修饰Gag可以通过使Gag*不能与UBP结合来间接增强病毒释放，从而阻止抑制性Gag-UBP复合物的形成。
Vpu和UBP在颗粒释放中的作用模型。UBP与Gag相互作用形成复合体。在没有Vpu的情况下，该复合物是稳定的，可能会抑制病毒颗粒的释放。当存在Vpu时，UBP与Gag分离，允许修改Gag以形成Gag*。这种修饰改变了蛋白质，使其不再与UBP相互作用。Gag*不能与UBP相互作用或Gag本身的修饰导致病毒释放增强。
最近的实验表明，HIV-1 Gag的基质域是Vpu介导的增强粒子释放所必需的(30). 基于这些结果，我们推测UBP与Gag的矩阵域相互作用。初步实验表明，UBP与Gag的相互作用可能由基质-衣壳连接和Gag的p6结构域介导（数据未显示）。事实上，基质-衣壳连接可能参与Gag-UBP相互作用，这增加了在我们的实验中观察到的UBP过度表达对粒子释放的负面影响可能是由于Gag处理不当所致。然而，这不太可能，因为之前的研究表明，Gag处理不会影响病毒的释放。此外，Vpu对病毒颗粒释放的影响可以在未经处理的情况下发生(21,30). 基质结构域和UBP-Gag相互作用在Vpu介导的增强病毒释放中的作用正在研究中。
UBP包含四个TPR基序。众所周知，TPR会形成一个二级结构，用于调节两个TPR之间的相互作用(26). 因此，UBP的TPR基序可能介导UBP与Vpu或Gag的相互作用。Vpu和Gag不包含TPR基序。然而，FKBP59的TPR(34)，第1p页(11)和PP5的小鼠同源物(9)直接参与与不含TPR的蛋白质的相互作用。或者，UBP的TPR基序可以介导UBP与其他参与增强病毒释放的细胞蛋白的相互作用。我们目前正在进行实验，以确定解释UBP与Vpu或Gag之间相互作用的Vpu、Gag和UBP的域。
HIV-1 Gag蛋白与亲环素A、B和C相互作用，亲环素A并入病毒颗粒中(15,31,46). 亲环素和FKBP构成免疫亲素超家族。免疫抑制剂参与蛋白质折叠，一些作为免疫抑制剂CsA和FK506的细胞内受体。UBP可能不是一种免疫亲和素，因为它缺乏CsA或FK506的明显结合位点。此外，UBP未检测到并入病毒颗粒中（数据未显示）。然而，UBP功能的一种可能情况是，UBP通过介导蛋白质的适当折叠来修饰Gag。已知TPR蛋白FKBP59和CyP-40与热休克蛋白90相互作用，这些相互作用可能涉及类固醇激素受体的正确折叠(34,35).
