小鼠白血病病毒R区的二级结构对刺激长末端重复驱动基因表达很重要

摘要

R区是逆转录病毒长末端重复序列（LTR）中的序列，存在于主要病毒转录物的5′端和3′端。它们在病毒复制中起着重要作用。具体来说，它们对病毒基因组RNA反转录到DNA中的第一次聚合酶跳跃至关重要(26). 除了在逆转录中的作用外，LTR R区域对各种逆转录病毒的转录活性也很重要。研究得最好的例子是人类和猿猴免疫缺陷病毒（HIV和SIV）R区内的反式激活反应（TAR）元件(6,41). R区序列也影响其他逆转录病毒的转录，包括人类T细胞白血病病毒1型（HTLV-1）、牛白血病病毒、网状内皮组织增生病毒（REV）组成员鸡合胞病毒（CSV）、小鼠白血病病毒（MuLVs）和小鼠乳腺癌病毒（MMTV）(13,14,17,19,20,23,30,35,39,40). 在所有这些情况下，R区序列的缺失导致报告基因在相应的病毒LTR的控制下表达减少。许多这些病毒本身并不编码任何反式激活蛋白，其影响可能是由识别病毒序列的细胞因子介导的。对于HTLV-1和牛白血病病毒，R区的作用似乎也独立于病毒编码的反式激活蛋白(14,20,35).

对各种逆转录病毒R区序列作用机制的研究表明，这些序列可以影响病毒RNA产生的各个步骤。在HIV和SIV的情况下，转录的TAR序列在慢病毒RNA的5′端形成干环结构(6). 病毒编码的Tat蛋白与新生RNA中的TAR元件结合(12,43,45). Tat-TAR相互作用通过影响启动和聚合酶过程促进转录(7,11,21,24,25,28,29,44,50,52,54). 在MuLVs SL3和Akv病例中，R区前28个核苷酸的缺失影响了细胞质RNA的稳态水平(13). 这是由于在RNA聚合或加工过程中对转录起始和某些后起始步骤的影响(13). MMTV研究表明，该病毒15 bp短R区的突变降低了转录起始水平(39). 因此，不同逆转录病毒的R区可以通过涉及转录起始和/或起始后步骤的不同机制发挥作用。

与HIV和SIV的TAR元件一样，干环结构可能在其他病毒R区转录的RNA中形成，这些可能对这些序列的作用很重要。CSV R区的前35个核苷酸预计能够折叠成Δ的二级结构克=-24.7千卡/摩尔(40). 还建议在SL3和Akv R区的关键5′28核苷酸中形成干环结构(13). 尽管Δ克该干环的估计值仅为-7.5 kcal/mol，它的存在得到了以下观察结果的支持：预测参与碱基配对的核苷酸在所有MuLV、猫白血病病毒（FeLV）和C型灵长类病毒中精确保守(13).

本研究旨在探讨预测的二级结构对MuLV R区的活性是否重要。我们还测试了MuLV R区在影响RNA聚合酶的过程中是否与HIV的TAR元件类似。此外，我们检测了其他逆转录病毒的LTR R序列是否可以替代MuLV R区域来驱动报告基因的表达。

材料和方法

质粒。

SL3和SL3 R区缺失质粒（图。​（图1）1)之前描述过(13). 我们之前的研究表明，无论是R区的一部分还是含有R、U5的400-核苷酸片段，R区都会影响LTR-报告质粒的活性，并且大多数5′非翻译序列存在于质粒中(13). 本研究中使用了仅包含部分R区的SL3-CAT（氯霉素乙酰转移酶）质粒，因为存在方便的Bss公司HII和Hin公司dIII限制位点（图。​（图1C）1C） 促进了各种质粒的构建。为了生成每个突变Bss公司HII-至-Hin公司用含有适当突变的片段替换SL3-CAT的dIII片段。为了产生这些片段，合成了含有突变的互补寡核苷酸。设计的寡核苷酸包含Bss公司HII和Hin公司两条链杂交后的dIII内聚末端。将双链片段插入SL3-CAT的相应位点。通过测序证实了每个质粒的成功构建。通过使用合成寡核苷酸的类似策略，将异源逆转录病毒的R区序列插入SL3 LTR。HIV-1CAT和猴病毒40Tat质粒由Rosen等人描述(41,42).

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图1

SL3R区5′端预测的干环结构和测试其重要性的突变。（A） SL3R区5′端的预测干环。核苷酸显示从R（+1）的第一个转录核苷酸开始。碱基对用核苷酸之间的破折号表示。（B） 引入SL3的R区的突变序列。顶行显示了从SL3R区域转录的前32个核苷酸。参与碱基配对的核苷酸用圆点标记。突变序列显示在SL3序列下方。每种情况下的改变核苷酸都有下划线。左边的名字识别突变：SΔR，SL3 R区域缺失；ASC，阀杆上升侧；DES，阀杆下降侧；补偿。右边的符号表示每个突变对预测的二级结构的预期影响；方块表示碱基替换，星星表示五个连续碱基的替换。（C） 报告质粒中LTR和CAT基因序列的组织。

结果

二级结构对于MuLV R区域的活性是重要的。

为了测试二级结构对R区活性是否重要，将突变引入MuLV SL3 LTR R区的5′端。SL3的68-核苷酸长R区的前28个核苷酸预计会形成如图所示的干环结构。​图1A1A类(13). 这种干环的存在得到了与猫和灵长类MuLVs和相关逆转录病毒之间碱基配对相关的核苷酸的保守性的支持(13). 除了环中的两个核苷酸外，与碱基配对有关的核苷酸是这些病毒中唯一保守的核苷酸(13). 预测有16个核苷酸形成碱基对形成茎，8个核苷酸出现在环中（图。​（图1A）。1A） ●●●●。在茎的下降侧，三个核苷酸预计会形成隆起。目前尚不清楚凸起中间的G是否与阀杆上升侧凸起中的单个C配对（图。​（图1A）。1A） ●●●●。这种预测结构的不同部分中含有突变的双标记寡核苷酸（图。​（图1B）1B） 被合成并取代到含有连接到CAT报告基因的SL3 LTR的质粒中（图。​（图11C） ●●●●。

一个突变，SΔR，是R区28个核苷酸的缺失，从位置+4到+31，包括在内（图。​（图1B）。1B） ●●●●。这种删除包含了大多数干环结构。如前所述(13)，在瞬时转染测定中，与野生型SL3相比，该突变将LTR活性降低了约10倍（图。​（图2），2)从而证实了R区这一部分的重要性。

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图2

NIH 3T3成纤维细胞瞬时转染试验中SL3 R区突变的活性。与SL3相比，不同突变体的CAT活性显示为100%。活动代表四种独立分析的方法。误差条表示1个标准偏差。每个结构的名称和符号如图所示。​图11B。

预测的环结构中的两个核苷酸，11位的U和15位的A，在MuLVs和相关病毒中是保守的(13). 为了测试这些核苷酸的重要性，在这些位置引入了颠换突变（图。​（图1B，1B、 回路）。16位的核苷酸也发生了突变，因为这导致了新的Xba公司我的网站有助于筛查是否存在突变。这些取代对LTR活性几乎没有影响（图。​（图2）。2). 因此，这些位置的基地对R地区的活动并不重要。

为了测试茎中的突起是否参与R区的活动，我们生成了一个突变体，其中删除了茎下降侧突起中的a和U（图。​（图1B，1B、 凸起）。据推测，这使得G位于A和U之间（图。​（图1A）1A） 与位于阀杆上升侧位置4处的C配对，从而消除阀杆的凸起。这种突变对LTR活性没有影响（图。​（图2），2)表明凸起结构对R区的活动并不重要。

为了测试碱基配对对R区功能是否重要，对参与碱基配对的核苷酸进行突变。茎上升侧或下降侧的五个核苷酸被改变以破坏碱基配对（图。​（图1B，1B、 ASC和DES）。此外，我们产生了一个补偿性突变（图。​（图1B，1B、 COMP），其中茎的上升侧和下降侧均发生突变，核苷酸序列不同，但预测的二级结构保持不变。茎两侧核苷酸的突变对二级结构的破坏将活性抑制到接近R区缺失的水平（图。​（图2）。2). 然而，当两种突变结合起来以恢复预测的二级结构时，活性恢复到完整LTR水平的约50%（图。​（图2）。2). 我们将这一结果解释为，二级结构对SL3R区域的全部活动很重要。

为了区分R区的二级结构是否影响mRNA水平或对包含R区转录本的翻译产生影响，我们对细胞质RNA进行了引物延伸分析，我们通过将LTR-CAT质粒与含有新霉素耐药基因的质粒共转染，生成了稳定转化的细胞株库。首先，我们验证了这些细胞中LTR驱动的CAT活性水平（图。​（图3）三)反映了瞬时表达分析中观察到的结果。我们之前观察到，在稳定转化的细胞中，R区序列的缺失具有更大的抑制作用(13). 这意味着R区对整合到宿主染色体中的模板的影响比整合模板中的模板更大。在这里也观察到了同样的效果。SΔR突变将LTR活性降低至完整LTR序列的4%左右（图。​（图3）。三). 与瞬时表达分析中观察到的结果相比，使用稳定转化的细胞时，破坏R区二级结构的突变也有更大的影响（图。​（图3）。三). 茎的上升侧或下降侧的突变将LTR活性抑制到完整LTR水平的约1/10。恢复代偿突变体中的二级结构再次将活性恢复到完整LTR水平的约一半（图。​（图3）。三). 补偿性突变的活性大约是破坏碱基配对的任一突变的五倍。这一发现证实了二级结构对R区活性的重要性，并表明它在整合到宿主细胞基因组的模板中很重要。

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图3

稳定转化的NIH 3T3成纤维细胞中SL3 R区突变的活性。与SL3相比，不同突变体的CAT活性显示为100%。每个结构的名称和符号如图所示。​图11B。

然后从稳定转化的细胞中分离出细胞质RNA，并用于引物延伸分析。使用CAT序列中的一个18-核苷酸引物，该引物从SL3-CAT转录物的5′端生成一个165-核苷酸长的径流产物。引物从SΔR突变体中产生单一137-核苷酸产物，从ASC、DES和COMP突变体中生成165-核苷酸产物（图。​（图4）。4). 因此，二级结构突变并没有改变转录起始位点。突变确实降低了细胞质RNA的稳态水平（图。​（图4）4)在某种程度上类似于CAT分析中的减少（图。​（图3）。三). 补偿性突变使细胞质RNA水平恢复到完整LTR水平的一半左右（图。​（图4）。4). 因此，R区的二级结构对于影响LTR驱动的细胞质转录物稳态水平的一个或多个过程非常重要。

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图4

SL3 LTR和R区突变的引物延伸分析。缩写如图所示。​图1B。1B.从用SL3-CAT质粒稳定转化的NIH 3T3成纤维细胞池中分离出细胞质RNA，并显示突变体。对照组显示NIH 3T3细胞被模拟转染。引物延伸后，在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳分离产物，并通过放射自显影术检测。

SL3R区序列的功能与HIV TAR元件不同。

二级结构对SL3R区和HIV TAR元件的活性都很重要，并且每个元件在病毒LTR中的位置都相似。因此，我们考虑了MuLV序列与HIV TAR功能等效的可能性。Tat与TAR RNA的结合导致RNA聚合酶II的加工能力增加(7,11,21,24,25,28,29,44,50,52,54). 为了测试细胞因子是否可以识别SL3-R区序列并影响RNA聚合酶II的加工性，从用SL3-和SΔR-CAT质粒稳定转化的细胞中制备细胞核。根据Laspia等人的描述，使用CAT基因5′和3′部分的探针进行核试运行分析(25). 无论使用的探针来自CAT基因的5′端还是3′端，R区的缺失都会将LTR-CAT转录物的水平降低到完整LTR水平的40%左右（图。​（图5）。5). 因此，R区的缺失不会影响CAT模板5′到3′部分的转录部分。因此，SL3R区域对RNA聚合酶II的加工没有影响。

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图5

使用SL3 LTR和SΔR突变体进行核试运行分析。从稳定转化的NIH 3T3细胞池中分离细胞核。对照组显示来自模拟转染细胞的细胞核。RNA是通过使用[α-³²P] UTP公司。按照Laspia等人的描述，通过在0°C的0.2 M NaOH中培养10分钟，分离并短暂地切割放射性标记的RNA(25). 然后将RNA与来自CAT基因5′和3′部分的探针杂交，如Laspia等人所述(25). 使用β-肌动蛋白探针作为特异性对照。

我们还测试了SL3R序列是否可以在功能上替代HIV-1 TAR元件。我们生成了一个重组LTR，其中SL3R区域与HIV 1型（HIV-1）的U3序列相连（图。​（图6A，6A、 HS）。将该结构的活性与含有SL3 R区从+4到+31缺失的同一结构的活性进行比较（图。​（图6A，6A、 HSΔR）。在人和小鼠细胞中测试嵌合LTR。SL3 R区的存在并没有增加HIV-1 U3的活性（图。​（图6B）6B） 但确实影响了平行对照中SL3 LTR的活性（图。​（图6B）。6B） ●●●●。作为HIV-1 LTR功能的对照，联合转染Tat表达质粒可在人类Jurkat细胞中刺激其活性约75倍（图。​（图6B）。6B） ●●●●。其他人报告(2,15,16,32,33,47,50)，Tat对小鼠细胞中完整的TAR元件不起作用。我们得出结论，MuLV R区不能在功能上替代HIV TAR元件。因此，MuLV和HIV-1元件通过不同的机制发挥作用。

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图6

SL3R区对HIV-1 LTR的影响。（A）LTR-CAT质粒的结构如下：黑色，CAT基因序列；灰色，SL3序列；白色，HIV-1序列。SL3 U3区域内的箭头表示串联重复增强器单元。（B） NIH 3T3成纤维细胞瞬时转染试验中构建物的活性。与SL3相比，不同突变体的CAT活性显示为100%。活动代表两种独立分析的方法。误差条表示1个标准偏差。+Tat表明，在猴病毒40早期启动子控制下编码HIV-1 Tat的质粒与HIV-LTR共转染。

其他C型逆转录病毒的R区序列可以替代SL3元件。

据报道，其他逆转录病毒的R区影响LTR活性(39,40). 我们测试了其中几种是否可以在功能上替代SL3元件。含有异源序列的LTR-CAT质粒（图。​（图7A）7A） 构建并在瞬时表达试验中进行测试。

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图7

其他逆转录病毒的R区序列替代SL3 R序列的效果。（A） 用于替换SL3序列的病毒序列。下划线的碱基表示其他哺乳动物C型逆转录病毒序列的差异。FeLV序列中的双下划线碱基表示相对于SL3的差异，预计这些差异能够相互配对。CSV序列上方的点表示核苷酸预计参与碱基配对(40). （B） 构建体在NIH 3T3和K562细胞中的瞬时转染测定中的活性。与SL3相比，不同突变体的CAT活性显示出来，SL3在每个细胞系中设置为100%。活动代表四种独立分析的方法。误差条表示1个标准偏差。

如前所述(13)，HIV R区域产生的活性水平与删除SL3 R区域元素后的活性水平大致相同（图。​（图7B）。7B） ●●●●。由于HIV-1序列可以折叠形成特征良好的包含TAR元件的干环结构，这一结果表明并非每个干环都能与SL3元件等效。

Moloney MuLV（Mo-MuLV）是另一种诱导小鼠T细胞淋巴瘤的逆转录病毒(9,46). Mo-MuLV和SL3R区域的前32个核苷酸除了环中的1-bp替换外是相同的（图。​（图7A）。7A） ●●●●。正如预期的那样，Mo-MuLV序列的功能等同于SL3序列（图。​（图77B） ●●●●。

FeLV与MuLV相关(10). FeLV R区在环内和茎下降侧突起内包含大量核苷酸替换（图。​（图7A）。7A） ●●●●。此外，FeLV R区域包含SL3的两个核苷酸的取代，这两个核苷酸参与茎的碱基配对（图。​（图7A）。7A） ●●●●。然而，这些变化似乎是补偿性的，因为它们被预测将维持碱基配对。当被替换到SL3 LTR中时，FeLV R区域显示了SL3序列的大部分活性（图。​（图7B）。7B） ●●●●。我们的结论是，尽管存在核苷酸替换，但FeLV R区的功能与SL3元件类似。

MMTV的R区只有15个核苷酸长。奇怪的是，这15个核苷酸中的11个与SL3R区域的前15个核苷酸相同（图。​（图7A）。7A） ●●●●。两个LTR之间的相似性并没有扩展到MMTV的U5区域（图。​（图7A）。7A） ●●●●。据报道，MMTV R区域内的序列刺激MMTV LTR转录的启动(39). 为了测试MMTV LTR是否可以取代SL3元件，制作了MuLV和MMTV LTRs的两种不同嵌合结构。其中一个是MMTV R-U5，SL3 R区域序列被MMTV的R区域和MMTV U5的前18个核苷酸取代（图。​（图7A）。7A） ●●●●。从这个结构转录的序列被预测不能折叠成干环结构。在另一个结构MMTV R/MuLV R中，只有SL3 R区域的前15个核苷酸被MMTV R区域取代（图。​（图7A）。7A） ●●●●。在后一种结构中，只有一个MMTV核苷酸替换，即+3位的核苷酸，影响了预测的二级结构。这种取代破坏了SL3结构中+3和+26位核苷酸之间的碱基对。这两种结构的活性与SL3R区缺失的活性相似，甚至略低（图。​（图7B）。7B） ●●●●。因此，MMTV R区域无法在SL3 LTR的环境中发挥作用。我们得出结论，MMTV和MuLV R区域元素通过不同的机制发挥作用。

CSV是REV组的一种禽逆转录病毒。以前曾假设从其R区转录的前37个核苷酸可能形成干环结构(40). CSV序列（图。​（图7A）7A） 测试了替代SL3元件的能力（图。​（图7B）。7B） ●●●●。在K562细胞中，CSV R序列的活性水平与SΔR相似。在小鼠成纤维细胞系NIH 3T3中，CSV序列恢复了部分活性（图。​（图7B）。7B） ●●●●。这一发现表明，CSV和SL3元件可能通过类似的机制发挥作用，至少在这一个细胞系中是如此。

讨论

基于形成该结构的碱基对核苷酸的进化保守性，预测了MuLV和相关猫科和灵长类逆转录病毒的R区5′端存在干环结构。这里提出的突变研究有力地支持了这样的论点，即这种结构对于SL3 LTR的最大活性是必要的。参与碱基配对的核苷酸突变抑制了R区的活性。形成相同预测二级结构但不是实际序列的补偿性突变恢复了该元素的大部分活性。来自Mo-MuLV和FeLV的等效序列能够至少部分替代SL3元素。这些结果与类似元素是C型哺乳动物属成员的一般特征的假设一致(49)逆转录病毒。

先前的结果表明，SL3 R区元件的功能分为两个步骤，即转录起始和起始后步骤(13). 这里提供的数据部分阐明了所涉及的分子机制。核试运行分析表明，R区元件影响了RNA聚合酶在CAT模板5′部分的负载。然而，R区对聚合酶是否延伸到模板的3′端没有影响。我们将这些观察解释为R元素对转录起始有一定影响，但对聚合酶过程没有影响。因此，SL3R区域的功能与HIV Tat-TAR系统不同。在核试运行分析中，删除R区的数量效应下降了2.5至3.5倍（图。​（图55和参考；[13]). 这只占引物延伸分析和报告基因表达分析中R区缺失约20倍效应的一小部分。因此，主要影响是RNA聚合酶转录模板后发生的一个或多个步骤。这意味着R区元件的主要功能涉及RNA加工的一个或多个步骤。

我们认为R区前28个核苷酸的干环结构存在于LTR驱动转录物的5′端。降低该元素活性的核苷酸替换是那些改变茎中碱基配对的核苷酸替换。改变循环的突变都没有对活性产生实质性影响。环序列在哺乳动物C型逆转录病毒中不同的观察结果提供了环序列不重要的额外证据(13). 然而，我们并没有测试循环结构的移除是否会影响活动。去除茎中的突起对活动没有影响。另一方面，MMTV R/SL3 U5结构几乎没有活性。据预测，该突变体在突起或环中有三个差异，在核苷酸3和26之间有一个改变的碱基对。最有可能的是，这个碱基对对对活动至关重要。

15 bp的MMTV R区被证明含有一种刺激细胞和核提取物中转录的元素(39). 然而，即使这两个序列在15个位置中的11个位置相同，该元素也不能替代SL3元素（图。​（图7）。7). 最有可能的是，这是因为SL3元件主要作用于RNA加工，而MMTV元件影响转录起始。然而，SL3序列似乎对连续分析中的RNA聚合酶负载有一定影响，因此可能对转录起始有一定影响。也许MMTV R区结合因子在SL3 U3启动子和增强子元件的上下文中没有活性。

HIV-1 LTR驱动的转录物的5′端折叠成特征良好的发夹结构。这些序列不能有效替代SL3元件。因此，并非所有干环结构都能执行SL3元件的功能。SL3元件与HIV-1结构的一个明显区别是，SL3元件的茎短得多，用于稳定它的碱基对更少。奇怪的是，CSV序列也被预测为茎环结构(40)，确实在NIH 3T3成纤维细胞中产生了一些活性。CSV和SL3元素折叠成足够相似的结构，CSV元素可以部分替代SL3元素，这可能只是巧合。然而，也可以设想SL3和CSV元件执行类似的功能。REV组在逆转录病毒科不确定(10,51). 然而，有证据表明REVs与哺乳动物逆转录病毒有关，所有逆转录病毒都使用tRNA^赞成启动逆转录(38). 衣壳蛋白和逆转录酶蛋白具有抗原相似性(1,三–5,8,18,36). REV版本环境价值-编码蛋白与狒狒内源性病毒和D型猿猴逆转录病毒的序列相似(48). 脾坏死病毒是REV组的一员，与D型猴逆转录病毒共享一个细胞受体(22). MuLV和REV可能共享一个翻译监管元素(27). CSV 5′端部分替代SL3元件的能力可能是这些逆转录病毒之间相似性的又一暗示。

总之，适度稳定的小干环结构对于SL3 LTR驱动转录物的最大表达非常重要。该元素似乎主要在转录后步骤发挥作用，可能存在于LTR驱动的转录物的5′末端。其他哺乳动物C型病毒似乎具有类似的成分。

致谢

参考文献