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《维罗尔杂志》。1998年10月；72(10): 7796–7806.
数字对象标识：10.1128/jvi.72.10.7796-7806.1998年
预防性维修识别码：项目经理110092
PMID：9733815

潜伏膜蛋白2A的酪氨酸112对蛋白酪氨酸激酶的负载和EB病毒潜伏期的调节至关重要

Sara Fruehling公司,1 雷切尔·斯瓦特,1 克里斯汀·多尔威克,1 伊丽莎白·克雷默,2和理查德·朗内克1,*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

EB病毒潜伏膜蛋白2A（LMP2A）在潜伏感染EB病毒的B淋巴细胞的质膜上表达，并在体外阻断EB病毒永生化B细胞的B细胞受体（BCR）信号转导。LMP2A氨基末端结构域是LMP2A介导的BCR信号转导阻断所必需的，它包含八个酪氨酸残基。Syk蛋白酪氨酸激酶（PTK）与LMP2A的关联发生在LMP2A免疫受体酪氨酸激活基序的两个酪氨酸上，并且假设Lyn PTK与LMP2A-酪氨酸112（Y112）的YEEA氨基酸基序关联。为了检测Lyn PTK与LMP2A的特异性关联，将一组含有LMP2A突变的LMP2A cDNA表达载体转染到EBV阴性B细胞系中，并分析Lyn和LMP2A联合免疫沉淀。Lyn与野生型LMP2A和其他LMP2A突变结构相关，但在LMP2A残基Y112（LMP2AY112F）处含有酪氨酸（Y）-对苯丙氨酸（F）突变的LMP2A结构中，Lyn的相关缺失。接下来，将LMP2AY112F突变重组到EBV基因组中，以产生稳定的经LMP2AY112F突变病毒转化的淋巴母细胞系（LCL）。对LMP2AY112F LCL中BCR介导的信号转导的分析表明，LMP2A介导的阻断在BCR信号转导中丢失。此外，LMP2AY112F LCL中的LMP2A没有酪氨酸磷酸化。总的来说，这些数据表明LMP2A Y112残基在LMP2A阻断BCR介导的信号转导能力中的重要性，并将此残基的作用及其与Lyn PTK的相互作用视为对参与BCR-介导信号转导的LMP2A磷酸化、PTK负载和PTK下调至关重要。

在原代B淋巴细胞中，B细胞受体（BCR）交联导致复杂的信号级联，包括Src家族蛋白酪氨酸激酶（PTKs）的招募和激活；随后激活和补充其他激酶、磷酸酶或衔接蛋白；磷脂水解；细胞内钙动员；蛋白激酶C活化；核转录因子的激活；以及BCR信号特异性基因的转录(1,5,10,13,44). 这些信号级联也发生在体外EB病毒（EBV）阴性转化的B细胞系中，但EBV转化的B淋巴细胞系通过BCR传递信号的能力被阻断。一种EBV基因产物，潜伏膜蛋白2A（LMP2A）已被证明与该表型有关(26——28).

LMP2A是体外潜伏感染EBV的B细胞中表达的九种病毒蛋白之一。LMP2A包含119个氨基酸氨基末端细胞质结构域、12个疏水性跨膜结构域和27个氨基酸细胞质羧基结构域，并在潜在感染的B细胞的质膜中以聚集体形式表达（图。​（图1）1) (21). LMP2A的氨基末端结构域包括八个酪氨酸残基(20)，其中两个形成免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAM）(4,37). 该氨基末端结构域已被证明是酪氨酸磷酸化的，并且是LMP2A与Src家族PTK和Syk PTK关联所必需的(三,20,26). 每个磷酸化酪氨酸残基都为含有Src同源性2（SH2）结构域的细胞蛋白质提供潜在的结合位点。SH2结构域是与酪氨酸磷酸化蛋白结合的细胞质信号蛋白中保守的非催化结构域(34,38).

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LMP2A结构和氨基酸序列表明LMP2A氨基末端结构域的重要基序。（A） LMP2A在B细胞质膜中的预测结构示意图。LMP2A包含119个氨基酸氨基末端细胞质结构域、12个疏水性跨膜结构域和27个氨基酸细胞质羧基结构域，并在潜伏感染的B细胞的质膜中聚集体中表达。数字表示LMP2A氨基末端结构域中八个酪氨酸残基的位置。（B） LMP2A氨基末端结构域的氨基酸序列，具有八个酪氨酸残基（箭头）、四个富含脯氨酸的基序（～～～～）和DQSL基序(▪▪▪▪▪) 表明。在pLMP2A cDNA表达载体构建物中，八个LMP2A氨基末端Y残基中的每一个都被突变为F残基，包括LMP2A残基Y74和Y85处的双Y到F突变。4个缺失LMP2A残基21-36、21-64、21-85和80-112的LMP2A缺失突变也被纳入pLMP2A cDNA表达载体结构。此外，在LMP2A Y112处产生了多个包含Y到F突变的LCL。

LMP2A首次被证明可以阻断EBV阴性B细胞系BJAB中正常的BCR信号转导。在表达LMP2A且无其他EBV基因产物的BJAB细胞中，BCR交联后细胞内钙未被动员(28). 使用EBV转化的淋巴母细胞系（LCL）（称为EBV+LMP2A+LCL）进行的研究表明，BCR交联后，在钙动员方面存在类似的阻滞，在BCR交联之后，在蛋白酪氨酸磷酸化和核基因转录方面也存在阻滞(26——28). 此外，BCR交联未能激活EBV+LMP2A+LCL中的细胞信号转导子，如Lyn、Syk、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-激酶）、磷脂酶Cγ2、（PLCγ2）、Vav、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和Shc(26). 相反，对LMP2A无突变LCL（称为EBV+LMP2A−LCL）的平行BCR交联研究，通过诱导酪氨酸磷酸化、细胞内钙动员和诱导裂解病毒复制，导致正常的BCR信号转导(26,27). 这些结果表明，LMP2A的氨基末端结构域足以阻断EBV+LMP2A+LCL中BCR介导的信号转导。

LMP2A氨基末端结构域在阻断BCR信号转导中的重要性通过对EBV感染的LMP2A氨基酸末端结构域中缺失突变的LCL的分析得到证实。我们构建了三个缺失，从LMP2A氨基酸末端结构域中删除氨基酸21至36、21至64或21至85。氨基酸21至36是可有可无的，而氨基酸37至85对LMP2A的全面功能至关重要(11). LMP2A ITAM中酪氨酸-苯丙氨酸点突变的LCL分析证实了LMP2A在BCR信号转导中LMP2A介导的阻断中的重要性。任一酪氨酸突变都恢复了正常的BCR信号转导，并阻止了Syk-PTK与LMP2A的结合(12).

在本研究中，将酪氨酸（Y）-苯丙氨酸（F）突变基因工程到氨基酸112（Y112F）的LMP2A基因中，并将其整合到LMP2A cDNA表达载体和病毒基因组中，以产生感染LMP2AY112F重组病毒的LCL(11,12). 分析LMP2AY112F LCL通过BCR传递信号的能力以及LMP2AY112F突变对Lyn和Syk PTK的影响。

材料和方法

细胞系和细胞培养。

所有细胞系均保存在含有10%灭活胎牛血清、每毫升1000 U青霉素和每毫升1000μg链霉素（密苏里州圣路易斯市西格玛）（完全RPMI）的RPMI 1640培养基中。BJAB是EBV阴性的B淋巴瘤细胞系(24). B95-8是一种EBV感染的绒猴细胞系，部分允许病毒复制(29,30). HPB。ALL是一种急性淋巴细胞白血病T细胞系。原始EBV感染的P3HR1（P3JHR1）Burkitt淋巴瘤细胞系（乔治·米勒（George Miller）的礼物）的HH514-16亚克隆的EBV基因组只有一种DNA，其中编码EBNA2的片段和EBNALP的最后两个外显子被删除(14). WT1和WT4为EBV+LMP2A+LCL，ES1和ES4为EBV+LMP2A−LCL(27). 通过在Ficoll-Paque（新泽西州皮斯卡塔韦市法玛西亚）缓冲垫上离心，从健康献血者的血液样本中获得原始人类单核细胞。对于EBV阳性供体，如前所述去除T淋巴细胞(23).

抗体。

用于交联表面Ig（sIg）实验的全山羊抗人免疫球蛋白（Ig）购自Southern Biotechnical Associates（Santa Cruz，California），山羊抗人F（ab′）2购自Jackson ImmunoResearch Laboratories（宾夕法尼亚州西格罗夫）。之前已经描述过大鼠单克隆抗人LMP2A抗体（14B7）(11). 小鼠单克隆抗血凝素（HA1）表位抗体（12CA5）来自BAbCO（加利福尼亚州里士满）。抗Lyn小鼠单克隆抗体购自Transduction Laboratories（肯塔基州列克星敦），抗Lyn兔多克隆抗体购于Upstate Biotechnology Inc.（纽约州普莱西德湖）。小鼠抗Syk（4D10）单克隆抗体和抗磷酪氨酸（APT）抗体（PY20）购自加州圣克鲁斯生物技术公司。针对BZLF1蛋白（BZ1）的小鼠单克隆抗体已在前面描述过(48). 除NeutrAvidin HRP外，所有辣根过氧化物酶（HRP）连接的二级抗体均购自Amersham（Arlington Heights，IL），NeutrAvidin HRP购自Pierce（Rockford，IL）。用于免疫荧光的驴抗鼠二级抗体Cy3购自Jackson。

质粒的构建。

通过基于PCR的策略生成LMP2A cDNA表达载体并将其并入pLMP2A(20). 对所有LMP2A突变进行测序，以确认是否存在期望的突变以及PCR引入的任何突变。pSVNaeZ，用于诱导裂解EBV复制，以及生态RI-A用于挽救P3HR1细胞系中包含的EBNA2和EBNALP突变，已在前面描述过(23,40). 基因组LMP2AY112F突变是使用基于PCR的策略产生的百万分之一与Y112密码子相邻的I限制性位点也被生成。含有酪氨酸突变和百万分之一I站点已并入pRH6，其中包含千磅I（B95-8，bp 161097）-至-生态来自B95-8 EBV DNA的RI（B95-8bp 1）片段。对所有重组LMP2A构建物进行测序，以确认存在所需的酪氨酸-苯丙氨酸突变百万分之一I位点，并且没有PCR引入的任何突变。

转染。

用于转染的DNA在CsCl密度梯度上出现两次条带。通过转染1070.4 ml完整RPMI中的P3HR1细胞与15μg pSVNaeZ、7μg生态RI-A和25μg重组LMP2A DNA。BJAB细胞（107)同样转染50μg的每个pLMP2A cDNA，并用[35S] 如前所述的蛋氨酸(20). 在0.4-cm电极间隙比色皿（Bio-Read）中，使用200 V和960-μF电容的基因脉冲发生器（Bio-Rad，加利福尼亚州赫拉克勒斯）对细胞进行一次脉冲处理，并立即在10 ml完整RPMI中稀释。类似地在LCL中诱导裂解性EBV复制，不同之处在于用25μg pSVNaeZ在230 V下脉冲这些细胞，并在含有20 ng 12-O（运行）-每毫升十四醇基佛波醇-13-乙酸酯。

生成LMP2AY112F LCL。

采用PCR-介导的突变方法，在LMP2A的氨基酸112处产生一个酪氨酸对苯丙氨酸点突变，从而产生一个EBV DNA片段编码LMP2A。通过测序验证了重组LMP2A构建物，然后通过使用具有转化能力、复制能力的EBV缺失突变体P3HR1的策略将其并入病毒。将pSVNaeZ DNA与P3HR1细胞系共转染产生重组病毒，诱导裂解病毒复制；生态RI-A DNA，以拯救P3HR1基因组中的EBNA2和EBNALP缺失；和重组LMP2A DNA片段(22). 如前所述，重组P3HR1病毒用于感染原代血单个核细胞（PBMC）或培养中纯化的B淋巴细胞(11). 在初次接种后3至5周出现克隆，并在6至8周通过PCR筛选LMP2AY112F点突变。

LMP2AY112F突变LCL的PCR和Southern blot验证。

从LCL中制备基因组DNA(40)并在25-μl体积中放大40个周期，如前所述(22). 引物5′LMP1（CTAGGCGCACCTGGAGGTGG）和3′LMP1（AGTCAGTCAGGCAAGCCTAT）用于筛选含有LMP2A突变的EBV基因组DNA片段中存在的81bp较小LMP1基因的LCL。LMP1基因与EBV基因组中的LMP2A基因相邻。首次筛选后，使用引物5′LMP2A（CTGCTGCAGCTATGGTCGTCC）和3′112-LMP2A（TCCTCTGCCCGCTTTCGA）特异性扩增包含LMP2AY112F点突变的LCL DNA。通过1.5%EEO琼脂糖（宾夕法尼亚州匹兹堡费希尔）电泳后，观察溴化乙锭染色PCR产物，以确定扩增产物的大小。

PCR-鉴定的LMP2AY112F突变LCL和野生型对照通过Southern杂交进一步验证。一个1872 bp的片段，由Bgl公司pRL49摘要(22)，被隔离并用作32P标记杂交探针。通过细胞裂解、蛋白酶K处理、苯酚提取和乙醇沉淀制备基因组DNA(43). 用酶消化代表性LCL制备的DNABgl公司我一个人或和他们一起Bgl公司我和百万分之一I.消化后的DNA在1%琼脂糖凝胶上通过电泳分离，转移到尼龙膜上（GeneScreen；NEN，Boston，Mass.），并按照前面的描述进行探测(43). 这两种消化物都验证了LMP2A野生型和突变型LCL中存在的正确限制性位点，并且Bgl公司我-百万分之一我双重消化验证了唯一的百万分之一I位点仅存在于LMP2AY112F突变体中。

如前所述，使用1:50稀释的荧光素-异硫氰酸盐连锁山羊抗人Ig（阿拉巴马州伯明翰Southern Biotech），通过流式细胞术对经验证的LMP2AY112F突变LCL和野生型对照进一步表征sIg的表达(28).

细胞活化和裂解物的制备。

组织培养细胞（细胞数量如图图例所示）在37°C的无血清RPMI中重新悬浮并平衡15分钟。用每毫升25μg山羊抗人Ig（Southern Biotech）刺激细胞达到指定的时间，并立即在1%Nonide P-40（NP-40）裂解缓冲液（1%NP-40，50 mM Tris-HCl[pH 7.4]中对细胞进行裂解、150 mM NaCl、2 mM EDTA、每毫升10μg胃蛋白酶抑制素和亮氨酸蛋白酶抑制剂、0.5 mM苯甲基磺酰氟、1 mM原钒酸钠）。在4°C下通过离心去除不溶物，并处理清除的上清液进行免疫沉淀或免疫印迹。

免疫沉淀和免疫印迹。

将清除的裂解物与适当的抗血清在4°C下孵育1 h；如图图例所示，用蛋白A-或蛋白G-Sepharose（Pharmacia）捕获免疫复合物1小时，然后用1%NP-40裂解缓冲液洗涤四次。然后将免疫沉淀蛋白重新悬浮在2×十二烷基硫酸钠（SDS）样品缓冲液中，在70°C下加热5 min，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离（百分比如图图例所示）（SDS-PAGE）。

对于免疫印迹，免疫复合物材料被电泳并转移到硝化纤维素或Immobilon中，如图图例所示。在室温下将膜在3%至5%的牛奶中封闭1小时，然后在室温下在一级抗体中孵育1小时，并在Tris-buffered saline-Tween（TBST）中稀释。将膜在TBST中洗涤三次，与HRP-或生物素连接的第二抗体在室温下孵育30分钟，并在TBST中洗涤四次，通过增强化学发光（ECL；皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊州）检测蛋白质。

体外激酶分析。

如上所述进行Lyn和Syk免疫沉淀反应，并用1%Triton X-100裂解缓冲液洗涤免疫复合物四次。用激酶缓冲液（50 mM Tris[pH7.4]，10 mM MgCl）进一步洗涤免疫复合物两次2，10 mM氯化锰2). 洗涤后，将免疫复合物重新悬浮在25μl体积的激酶缓冲液中，标记有10μCi的[γ-32P] 每个样品的ATP，并在室温下培养20分钟。添加2×SDS样品缓冲液，停止反应；将样品在70°C下加热5分钟，并加载到SDS–6%聚丙烯酰胺凝胶上。这个32通过干燥凝胶的放射自显影术观察P标记产物。

钙动员。

组织培养细胞（3×106)在装载缓冲液中再次悬浮（145 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgCl2，1 mM氯化钙210 mM葡萄糖、10 mM HEPES、1%牛血清白蛋白、2.5 mM普鲁贝尼），并在室温下加载2 mM钙结合染料（氟-3-乙酰氧基甲酯[fluo-3]；分子探针，尤金，俄勒冈州）30分钟。加载后，将细胞清洗两次，并重新悬浮在加载缓冲液中。BCR与山羊抗人Ig F（ab′）交联后，对制备的细胞进行荧光测定2Perkin-Elmer（Norwalk，Conn.）LS-5B发光光谱仪中的抗体（Jackson）。fluo-3的激发和发射值分别为505和530 nm。自动荧光（或F类最小值[最小荧光]）也通过执行上述程序而不添加fluo-3染料来测定每个LCL。基线荧光(F类)记录1分钟，最大荧光(F类最大值)通过添加洋地黄素（40μM）进行测量。根据公式[Ca计算钙浓度（毫摩尔）2+] = 400 (F类−F类最小值)/(F类最大值−F类) (18,25).

免疫荧光。

如前所述，对LCL进行免疫荧光检测(21). 简而言之，LCL在−20°C下用丙酮固定在玻片上5分钟，在室温下用20%正常山羊血清封闭10分钟，用1:1000稀释的抗LMP2A大鼠单克隆抗体14B7孵育，用1:11000稀释的山羊抗大鼠二级抗体Cy3（Jackson）孵育30分钟，在磷酸盐缓冲盐水中清洗，并用蔡司Axioscope荧光显微镜观察。

结果

LMP2A氨基末端结构域的位点特异性cDNA突变。

采用PCR-介导的突变技术，在LMP2A氨基末端结构域中构建点突变和缺失突变的LMP2A cDNA表达载体。位于该119-氨基酸结构域内的八个Y残基中的每一个都被改变为F残基，包括LMP2A残基Y74和Y85处的双Y到F突变。LMP2A缺失突变消除了LMP2A残基21-36、21-64、21-85和80-112。此外，将流感病毒HA1蛋白中与单克隆抗体12CA5反应的11-氨基酸肽添加到每个LMP2A cDNA构建物的羧基末端，以便于分析cDNA突变体。通过测序（数据未显示）验证所有重组LMP2A结构，然后将其并入表达载体pLMP2A(20). 图​图11显示了LMP2A氨基末端结构域的氨基酸序列，其中突出显示了8个酪氨酸残基。

Y112 LMP2A突变体中LMP2A磷酸化缺失和Src家族PTK关联。

为了确定LMP2A氨基末端结构域的哪些序列负责LMP2A与细胞蛋白的关联以及LMP2A磷酸化的必要性，将表位标记的野生型和突变型LMP2A cDNA表达载体转染到EBV阴性B淋巴瘤细胞系BJAB中，用[35S] 蛋氨酸，在NP-40中溶解，并用抗HA1抗体12CA5免疫沉淀。用SDS-PAGE分离出1对免疫沉淀蛋白35S标记的LMP2A蛋白通过放射自显影术显示出来（图。​（图2B）。2B） ●●●●。不出所料，没有35在载体控制（pSG5）转染细胞中免疫沉淀S-标记的LMP2A（图。​（图2B，2B、 通道11），而在每个LMP2A转染中检测到大约等量的LMP2A（图。​（图2B，2B、 车道2至10和12至16）。缺失突变体中的LMP2A蛋白比野生型LMP2A迁移更快，反映了每个缺失的大小。

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转染BJAB中LMP2A的表达和LMP2A磷酸蛋白免疫复合物。体外免疫复合物激酶反应和35显示了来自转染野生型pLMP2A和pLMP2A-缺失和点突变的BJAB细胞的S标记蛋白。BJABs细胞（107)用流感病毒（Flu）HA1表位标记的LMP2A表达载体转染，标记为[35S] 蛋氨酸在1%NP-40中溶解，用抗HA1抗体12CA5免疫沉淀（i.p.），用蛋白G-Sepharose捕获，免疫沉淀被平均分配。前半部分用SDS-PAGE（7%凝胶）分离并转移到硝化纤维素中35S标记的LMP2A蛋白通过放射自显影术（B）显示。在所有LMP2A转染细胞（B，通道2至10和12至16）中检测到LMP2A的表达，而在对照pSG5转染细胞中未检测到LMP2A的表达（B，路径11）。每个免疫复合物的另一半是32通过免疫复合物激酶反应在体外标记P并通过SDS-PAGE（7%凝胶）分离32P标记蛋白在阻断后通过放射自显影术（A）显示35用两片薄膜标记S蛋白。含有野生型和突变型pLMP2A蛋白的许多磷酸化蛋白复合物（A，1至10和12至16巷），包括LMP2A（箭头）、72-kDa-Syk和53-kDa Src家族PTK，以及96、104、110和112 kDa的未识别蛋白。pY112和p2AΔ80-112突变体显示总磷酸化完全降低（a，通道2和16）。在对照pSG5转染细胞（A，第11通道）中未检测到蛋白。左侧以千道尔顿表示蛋白质标准。

用LMP2A免疫沉淀蛋白的另一半进行体外免疫复合物激酶反应，得到32P标记蛋白通过SDS-PAGE分离，并通过放射自显影术显示（图。​（图2A）。2A） ●●●●。只有32P-标记蛋白被可视化，因为35S信号被两张胶片挡住。正如预期的那样，在载体控制（pSG5）转染细胞的体外激酶反应中未检测到磷酸蛋白（图。​（图2A，2A、 车道11）。多个磷酸化蛋白与pLMP2A和突变pLMP2A蛋白共同免疫沉淀（图。​（图2A），2A） 包括72-kDa-Syk和53-60-kDa Src家族PTK，以及96、104、110和112kDa的未知蛋白质。此外，磷酸化LMP2A在54 kDa时明显迁移（图。​（图2A，2A、 箭头），或者根据每个LMP2A缺失的大小逐渐减少。LMP2A缺失突变体构建物中LMP2A磷酸化水平降低：p2AΔ21-64显示LMP2A磷酸化酶降低，p2A△21-85显示更少的磷酸化，而p2A△80-112中的LMP2A磷化酶几乎无法检测到（图。​（图2A，2A、 14至16车道）。pY112F突变体也几乎检测不到LMP2A磷酸化水平，如p2AΔ80-112突变体所示（图。​（图2A，2A、 车道2和16）。此外，pY112F转染细胞中免疫沉淀的磷酸化蛋白较少，磷酸化水平低于其他体外激酶反应（图。​（图2A），2A） ，尽管所有反应都是用类似的方法进行的35S标记的LMP2A蛋白水平（图。​（图2B）。2B） ●●●●。pY112F LMP2A免疫复合物中的Src家族PTKs迁移略高于LMP2A，以及分子量约为96 kDa的蛋白质似乎减少或缺失。转染pY74F、pY85F和pY7485F的细胞的体外激酶反应不含72-kDa-Syk-PTK。这些结果与之前的工作一致，之前的工作将LMP2A ITAM、LMP2A残基Y74和Y85确定为Syk与LMP2A结合的位点(12). pY60F-转染细胞的体外激酶反应似乎缺少约112kDa的蛋白质（图。​（图2A，2A、 车道8）。

四种LMP2A缺失突变体的体外激酶反应支持了与LMP2A酪氨酸点突变体所见相同的特异性蛋白与LMP2A区域的结合。缺少LMP2A残基Y23和Y31的p2AΔ21-36缺失突变体似乎包含与pY23F和pY31F点突变免疫复合物相同的免疫沉淀蛋白，并且所有三个突变体似乎都包含与野生型LMP2A免疫沉淀中相同的蛋白（图。​（图2A，2A、 车道13）。因此，残基21-36，特别是Y23或Y31的丢失似乎并不影响LMP2A与细胞蛋白的关联。缺乏Y23、Y31、Y60和Y64的p2AΔ21-64缺失突变体的体外激酶反应缺失了与pY60F免疫沉淀中观察到的相同的112-kDa蛋白（图。​（图2A，2A、 车道14）。缺少Y23、Y31、Y60、Y64、Y74和Y85的p2AΔ21-85缺失突变体失去了72-kDa（Syk）和112-kDa蛋白质的结合（图。​（图2A，2A、 车道15）。在pY60F、pY74F和pY85F LMP2A点突变转染细胞的体外激酶反应中，LMP2A与112-kDa蛋白的结合丢失与LMP2A残基Y60的丢失一致，72-kDa（Syk）蛋白的丢失与LMP1A残基的丢失Y74和Y85一致。缺乏Y112、Y101和Y85的p2AΔ80-112缺失突变体的体外激酶反应含有较少的32在野生型LMP2A免疫沉淀物中观察到的P标记蛋白（图。​（图2A，2A、 尽管两个样品在免疫沉淀物中都含有相似水平的LMP2A蛋白（图。​（图2B，2B、 车道12和16）。Src家族PTKs以约53、56和60kDa的三条带迁移，在体外激酶反应中p2AΔ80-112和pY112F均明显缺失（图。​（图2A，2A、 车道2和16）。在LMP2A缺失突变体构建物p2AΔ21-64和p2A△21-85中，Src家族PTK的存在非常明显，其中较小的LMP2A蛋白不再与Src PTK结合（图。​（图2A，2A、 车道14和15）。总之，这些数据表明，LMP2A残基Y60对于LMP2A与112-kDa磷酸化蛋白的结合很重要，Y74和Y85对于72-kDa-Syk与LMP2A的结合很关键，如前所示(12)，Y112对53至60-kDa Src家族PTK与LMP2A的关联至关重要。

LMP2A氨基末端结构域中Y112的突变阻止Lyn PTK与LMP2A的关联。

为了研究Lyn PTK与LMP2A的酪氨酸特异性关联，将HA1表位标记的LMP2A cDNA表达载体转染到BJAB细胞，用[35S] 蛋氨酸，在NP-40中溶解，并用抗HA1抗体12CA5免疫沉淀。转移蛋白的放射自显影术证实，从每一个表达LMP2A的转染中都有类似数量的LMP2A免疫沉淀（图。​（图3B，三B、 通道23至32和34至38），并且在对照pSG5转染的BJAB中未检测到LMP2A表达（图。​（图3B，三B、 车道22和33）。然后用抗Lyn多克隆抗血清对膜进行免疫印迹，以检测Lyn与LMP2A的共免疫沉淀（图。​（图3A）。三A） ●●●●。Lyn是BJAB细胞中表达最丰富的Src家族PTK(2). 在转染野生型pLMP2A cDNA构建物的BJAB中，p56和p53型Lyn容易与野生型LMP2A共免疫沉淀（图。​（图3A，三A、 车道4和17）。这两种形式的Lyn是通过利用Lyn mRNA中的内部剪接供体位点从选择性剪接中衍生出来的(47). 在pSG5对照免疫沉淀物中未检测到Lyn（图。​（图3A，三A、 车道3和16）。Lyn还与含有LMP2A酪氨酸点突变的pLMP2A构建物（pY101F、pY7485F、pY85F、pY74F、pY 64F、pY-60F、pY131F和pY23F）共免疫沉淀。三A、 通道6至13]），以及pLMP2A缺失突变体（p2AΔ21-36、p2AΔ）。三A、 18至20车道]）。然而，在pY112F转染的BJAB中几乎未检测到Lyn与LMP2A的共免疫沉淀（图。​（图3A，三A、 泳道5）或p2AΔ80-112转染的BJAB（图。​（图3A，三A、 车道21）。在BJAB细胞的对照细胞裂解液中很容易检测到这两种形式的Lyn（图。​（图3A，三A、 而在T细胞系HPB的细胞裂解液中未检测到Lyn表达。所有（图。​（图3A，三A、 车道2和15）。通过滴定BJAB细胞裂解物并将免疫沉淀p56和p53的水平与免疫复合物中与LMP2A结合的Lyn的水平进行比较，进行了更详细的分析，结果表明，这两种形式的Lyn与LMP2A的结合同样良好，其结合量与BJAB电池中的相对丰度相似（数据未显示）。这些数据表明，LMP2A酪氨酸112是Lyn PTK与LMP2A关联的位置。如果在112处没有酪氨酸残基，Lyn就不会与LMP2A结合。

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Lyn与LMP2A的Y112结合。BJAB细胞（107)转染HA1表位标记的LMP2A表达载体，标记有[35S] 蛋氨酸在1%NP-40中溶解，用抗HA1抗体12CA5免疫沉淀（i.p.），用蛋白G-Sepharose捕获，用SDS-PAGE（7%凝胶）分离，转移到硝化纤维素中，免疫沉淀的LMP2A蛋白通过放射自显影术（B）显示。在所有LMP2A转染细胞（B，23至32和34至38道）中检测到转染BJAB细胞内的LMP2A表达，而在对照pSG5转染细胞中（B，22和33道）未检测到LMP2A。然后用多克隆Lyn抗血清对膜进行免疫印迹，并与HRP结合的二级抗体孵育，通过ECL（a）检测蛋白质。Lyn在转染野生型pLMP2A表达载体（A，第4和17道）而非对照pSG5载体（A、第3和16道）的BJAB细胞中免疫沉淀LMP2A。Lyn还与含有LMP2A酪氨酸残基处酪氨酸对苯丙氨酸点突变的pLMP2A构建物（Y101F、Y7485F、Y85F、Y74F、Y64F、Y60F、Y31F和Y23F[A，6至13]）以及缺乏LMP2A残基21至36、21至64和21至85（A，18至20巷）的pLMP1A缺失突变体共免疫沉淀。然而，Lyn在Y112F点突变体（A，第5道）或缺失残基80-112的缺失突变体（第21道）中没有与LMP2A共免疫沉淀。BJAB和HPB。所有细胞裂解物分别作为Lyn表达的阳性和阴性对照物（A，1、2、14和15道）。左侧以千道尔顿表示蛋白质标准。

感染LMP2AY112F EBV的LCL的产生。

LMP2AY112F突变通过前面描述的策略并入EBV基因组(22). 产生的LMP2AY112F重组病毒用于感染PBMC以产生LCL，如前所述(11). 通过PCR筛选产生的LCL，以鉴定感染EBV基因组中LMP2AY112F突变的存在，并通过Southern印迹杂交进一步验证每个LMP2AY112F LCL是否正确掺入了重组LMP2A DNA片段（数据未显示）。用LMP2AY112F重组病毒转化多个细胞系，本研究对这些EBV+LMP2AY112F LCL进行了鉴定。

EBV+LMP2AY112F LCL中LMP2A蛋白的表达。

使用LMP2A特异性抗体14B7进行免疫印迹分析，确认LMP2A在产生的EBV+LMP2AY112F LCL中的表达。代表性数据如图所示。​图4。4LMP2A在两个EBV+LMP2A+LCL中的表达非常明显（图。​（图4，4，泳道1和2），而在阴性对照EBV+LMP2A−LCL，ES1中未检测到LMP2A（图。​（图4，4，车道3）或EBV−细胞系BJAB（图。​（图4，4，车道4）。LMP2A在四个代表性EBV+LMP2AY112F LCL中的表达（图。​（图4，4在EBV+LMP2A+LCL中LMP2A的表达相似。使用抗LMP2A抗体的免疫荧光显微镜证实，LMP2A亚细胞蛋白在EBV+LMP2AY112F LCL中的定位与LMP2A在EBV+LMP2A+LCL中亚细胞定位相似（数据未显示）。这些数据表明，LMP2A蛋白在EBV+LMP2A+和EBV+LMP2AY112F LCL中的表达水平和亚细胞定位相似。

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LMP2A在EBV+LMP2A+和EBV+LMP2AY112F LCL中的表达。LCL的NP-40裂解物（5×106细胞/车道）用SDS-PAGE（8%凝胶）分离，转移到Immobilon，用抗LMP2A抗血清14B7免疫印迹，用HRP结合的二级抗体孵育，用ECL检测蛋白质。LMP2A在两个野生型EBV+LMP2A+LCL（第1和第2道）和四个EBV+LBP2AY112F LCLs（第5至第8道）中的表达水平相似。在EBV+LMP2A−LCL（第3道）或EBV−细胞系BJAB（第4道）中未检测到LMP2A表达。LCL克隆号显示在每条车道的上方，蛋白质标准显示在左侧，单位为千道尔顿。

LMP2A在EBV+LMP2AY112F LCL中未磷酸化。

为了验证LMP2A在BCR交联反应中的磷酸化状态，用抗LMP2A抗体免疫沉淀EBV+LMP2A+、EBV+LMP2A-和EBV+LDP2AY112F LCL的未刺激和刺激细胞裂解物，平均分割，并用重复的SDS-PAGE分离。进行两次平行免疫印迹分析以检测免疫沉淀LMP2A（图。​（图5A）5A） 和酪氨酸磷酸化LMP2A（图。​（图5B）。5B） ●●●●。从所有表达LMP2A的LCL中免疫沉淀出同等水平的LMP2A：两个EBV+LMP2A+LCL（图。​（图5A，5A、 车道1至6）和两个EBV+LMP2AY112F LCL（图。​（图5A，5A、 车道10至15），而在控制EBV+LMP2A−LCL中未检测到LMP2A（图。​（图5A，5A、 车道7至9）。在APT印迹中，LMP2A在两个EBV+LMP2A+LCL中被组成性磷酸化（图。​（图5B，5B、 而两个EBV+LMP2AY112F LCL中的LMP2A在BCR交联前后没有磷酸化（图。​（图5B，5B、 车道10至15）。如预期，在对照EBV+LMP2A−LCL中未检测到磷酸化LMP2A（图。​（图5B，5B、 车道7至9）。这些数据表明EBV+LMP2AY112 LCL中LMP2A酪氨酸磷酸化完全缺失。

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LMP2A在EBV+LMP2AY112F LCL中不被磷酸化。LCL未经处理（−）或处理为3×107在指定时间内（1或5分钟），用抗BCR抗体每毫升细胞数，在NP-40中溶解，用抗LMP2A 14B7抗血清免疫沉淀（i.p.），用蛋白G-Sepharose捕获，用重复的SDS-PAGE（6%凝胶）分离，并转移到Immobilon。用抗LMP2A（14B7-生物素）抗血清（A）或APT抗体PY20（B）检测平行免疫印迹，用HRP-结合二级抗体孵育，并用ECL检测。（A） 在整个时间过程中，两个EBV+LMP2A+LCL（A，1至6区）和两个EBV+LMP2A112F LCL（B，10至15区）中的LMP2A表达水平在所有四个LCL中都是相似的。在作为阴性对照的EBV+LMP2A−LCL中未检测到LMP2A（a，车道7至9）。（B） LMP2A在两个EBV+LMP2A+LCL中被组成性磷酸化，这在BCR交联后没有改变（B，泳道1至6）。相反，即使在BCR交联后，两个EBV+LMP2AY112F LCL中的LMP2A也没有磷酸化（B，10到15道）。阴性对照EBV+LMP2A−LCL（B，第7至9车道）中未检测到磷酸化LMP2A。LCL克隆号显示在每组通道上方，蛋白质标准显示在左侧，单位为千道尔顿。

EBV+LMP2AY112F LCL表现出高水平的组成性Lyn磷酸化和激酶活性，Syk磷酸化和酶活性的诱导类似于BCR交联后EBV+LMP2A−LCL的诱导。

为了研究LMP2AY112F点突变对Lyn和Syk PTK磷酸化状态和激酶活性的影响，对来自代表性EBV+LMP2A+、EBV+LMP2A-和EBV+LP2AY112F LCL的细胞裂解液进行并行抗Lyn和抗Syk免疫沉淀。将Lyn和Syk免疫沉淀平均分开，通过体外免疫复合物激酶分析来分析自身激酶活性，或在免疫印迹上探测Lyn、Syk或APT反应性。Lyn免疫沉淀和Lyn免疫印迹显示，所有LCL中的Lyn蛋白表达水平相似，尽管EBV+LMP2A+LCL显示的蛋白略低于EBV+LMP2A-或EBV+LMP2AY112F LCL（图。​（图6A，6A、 车道1至9）。该观察结果在EBV+LMP2A+LCL的其他Lyn免疫沉淀实验中重复出现（数据未显示），并与之前描述的观察结果一致(26). 相同Lyn免疫沉淀物的平行APT免疫印迹显示野生型和突变型LCL之间的磷酸化差异（图。​（图6B）。6B） ●●●●。EBV+LMP2A+LCL在BCR交联前后均显示出检测不到的Lyn磷酸化水平（图。​（图6B，6B、 而在BCR交联前后，EBV+LMP2A−和EBV+LMP2AY112F突变LCL中的Lyn磷酸化结构明显（图。​（图6B，6B、 车道4至9）。最后，对相同的Lyn免疫沉淀物进行体外自磷酸化激酶分析（图。​（图6C）。6C） ●●●●。代表性EBV+LMP2A+LCL表现出低Lyn激酶活性（图。​（图6C，6C、 而EBV+LMP2A−和EBV+LMP2AY112F LCL表现出更强的Lyn激酶活性（图。​（图6C，6C、 车道4至9）。这些数据表明，与EBV+LMP2A+LCL的Lyn磷酸化和激酶活性下调特征不同，EBV+LMP2AY112 LCL显示了EBV+LP2A−LCL的Lyn磷酸化增加和激酶活性增强特征。

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BCR交联后，Lyn和Syk在EBV+LMP2A+、EBV+LMP2A-和EBV+LMP2AY112F LCL中的表达、磷酸化和激酶活性。LCL未经处理（−）或处理为5×107用抗BCR抗体在指定时间（1或5分钟）内每毫升细胞数，并在1%NP-40中溶解。将裂解液等分，免疫沉淀（i.p.）与Lyn单克隆抗体（a至C）或Syk单抗（D至F）平行，并用蛋白a-Sepharose珠捕获。每种免疫沉淀的三分之一进一步进行体外激酶分析（C和F）。所有免疫复合物通过SDS-PAGE（6%凝胶）平行分离。这个32通过干燥凝胶（C和F）的放射自显影术观察P标记产物。将非放射性蛋白转移到Immobilon，并与单克隆APT（B和E）、抗Lyn（A）或抗Syk（D）抗体并行进行免疫印迹，然后与HRP结合的二级抗体孵育并进行ECL检测。（A） EBV+LMP2A+、EBV+LMP2A-和EBV+LMP2AY112F LCL（A，1至9道）中BCR交联后，p56/p53 Lyn表达水平没有改变。（B） 在三个LCL中BCR交联前后Lyn保持组成性磷酸化，但与EBV+LMP2A+LCL中几乎检测不到的Lyn磷酸化相比，EBV+LMP2A−和EBV+LBP2AY112F LCL（B，第4至9道）中p56/p53 Lyn磷酸化度升高。（C） 在三个LCL中BCR交联前后，Lyn在自磷酸化测定中保持组成型活性，但与EBV+LMP2A+LCL中几乎检测不到的Lyn活性相比，EBV+LMP2A+LCL（C，泳道1至3）中的p56/p53-Lyn活性水平在EBV+LMP2A-和EBV+LMP2AY112F LCL（C，泳道4至9）中增加。（D） BCR交联后，72-kDa-Syk在EBV+LMP2A+、EBV+LMP2A-和EBV+LMP2AY112F LCL中的表达水平相似（D，1到9道）。（E） 在EBV+LMP2A+LCL中BCR交联前后，Syk保持组成性磷酸化（E，1到3道），而在EBV+LMP2A−和EBV+LMP2AY112F LCL中的BCR交联前，Syk没有表现出组成性磷酸化合（E，4和7道）并且在EBV+LMP2A−和EBV+LMP2AY112F LCL（E，车道5至6和8至9）中BCR交联后1分钟内迅速磷酸化。（F） Syk在EBV+LMP2A+LCL（F，车道1至3）中的BCR交联前后表现出较低的本构活性，而Syk表现出较高的本构活动水平，在EBV+LMP2A−和EBV+LMP2AY112F LCL中BCR交联后诱导到更高的水平（F，通道4至9）。LCL克隆号显示在每组通道上方，蛋白质标准显示在左侧，单位为千道尔顿。

Syk免疫沉淀和Syk免疫印迹显示，在BCR交联前后，所有LCL中的Syk蛋白表达水平相似（图。​（图6D，6D、 车道1至9）。然而，相同Syk免疫沉淀物的平行APT免疫印迹显示野生型和突变型LCL之间的磷酸化差异（图。​（图6E）。6E） ●●●●。具有代表性的EBV+LMP2A+LCL表现出低水平的组成性Syk磷酸化，这不是由BCR交联引起的（图。​（图6E，6E、 泳道1至3），而EBV+LMP2A−和EBV+LMP2AY112 LCL均显示在BCR交联前没有Syk磷酸化，并且在BCR交联后1分钟内快速诱导Syk磷酸化（图。​（图6E，6E、 车道4至9）。APT研究得到了对相同Syk免疫沉淀物进行的体外自磷酸化激酶分析的进一步支持（图。​（图6F）。6F） ●●●●。Syk在EBV+LMP2A+LCL中表现出低组成激酶活性，这不是由BCR交联引起的（图。​（图6F，6F、 通道1至3），而EBV+LMP2A−LCL和EBV+LMP2AY112 LCL显示基线Syk活性增加，BCR交联后进一步诱导活性增加（图。​（图6C，6C、 车道4至9）。这些数据表明，与EBV+LMP2A+LCL的Syk磷酸化和激酶活性下调特征不同，EBV+LMP2AY112 LCL显示了Syk磷酸化和激酶活性的诱导，这是EBV+LMP2A−LCL的特征。本研究的结果与之前观察到的EBV+LMP2A+和EBV+LP2A−LCL中Lyn和Syk蛋白的表达、磷酸化和激酶活性水平一致(26).

LMP2AY112F突变可恢复BCR激活的酪氨酸磷酸化。

为了研究LMP2AY112F突变对APT活性诱导的影响，APT活性是BCR交联后最早的已知生化事件之一，EBV+LMP2A+、EBV+LMP2A-和EBV+LP2AY112F LCL与BCR表达相匹配（数据未显示），对BCR交联后酪氨酸磷酸化的诱导进行了分析。EBV+LMP2A+LCL证明了未刺激LCL中许多蛋白质的结构性磷酸化（图。​（图7，7在BCR交联后，这种模式保持相对不变（图。​（图7，7，车道2至3）。如图所示。​图5，5，LMP2A在EBV+LMP2A+LCL中磷酸化，其磷酸化水平没有随时间变化（图。​（图7，7，车道1至3，箭头）。通过剥离印迹并用LMP2A特异性抗体14B7重制该磷酸化蛋白，确认其为LMP2A（数据未显示）。相反，来自EBV+LMP2AY112F LCL的未经处理的细胞裂解液中几乎没有构成性磷酸化（图。​（图7，7，车道7、10和13）或控制EBV+LMP2A−LCL（图。​（图7，7但在BCR交联后，所有突变细胞系中酪氨酸磷酸化的蛋白质数量急剧增加（图。​（图7，7、车道4至6、车道7至9、车道10至12和车道13至15）。BCR交联后，EBV+LMP2AY112F LCL中酪氨酸磷酸化蛋白的增加类似于在EBV+LMP2A−LCL或EBV−B淋巴瘤细胞系中观察到的蛋白酪氨酸磷酸化诱导，如前所述(26). 如图所示。​图5，5在BCR交联之前或之后，任何EBV+LMP2AY112F点突变LCL中的LMP2A均未磷酸化，而在BCR交叉之前和之后，EBV+LMP2A+LCL中LMP2A磷酸化明显存在（图。​（图7，7，车道1至3，箭头）。这些数据表明，在EBV+LMP2AY112F LCL中，BCR交联后酪氨酸磷酸化的诱导未被阻断。有趣的是，在LMP2AY112F LCL的未刺激裂解物中，两个分子量约为60和57 kDa的蛋白质被组成性磷酸化，而在EBV+LMP2A−LCL的非刺激裂解物上不存在（图。​（图7；7; 比较泳道4、7、10和13）。在EBV+LMP2A+LCL的未刺激裂解液中，类似分子量的蛋白质也组成性磷酸化（图。​（图7，7，车道1）。

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EBV+LMP2A+、EBV+LMP2A-和EBV+LMP2AY112F LCL中BCR交联后的酪氨酸磷酸化。LCL未经处理（−）或处理为3×107用抗BCR抗体每毫升培养1或5分钟，用1%NP-40溶解，用APT抗体PY20免疫沉淀，用蛋白A-Sepharose捕获，用SDS-PAGE（6%凝胶）分离，转移到Immobilon，用HRP-结合的APT抗体CY20免疫印迹，用ECL检测蛋白。与EBV+LMP2A−LCL（泳道4至6）和三个EBV+LMP2AY112F LCL（泳道7至15）磷酸化的显著增加相反，在EBV+LMP2A+LCL（泳道1至3）中没有诱导酪氨酸磷酸化。LCL克隆号显示在每组通道上方，蛋白质标准显示在左侧，单位为千道尔顿。

BCR交联后EBV+LMP2A+和EBV+LMP2AY112F LCL中的钙动员。

为了评估LMP2AY112F突变对钙动员的影响，用钙结合染料fluo-3装载平行衍生的多个EBV+LMP2A+和EBV+LMP2AY112 LCL，并通过流式细胞术匹配BCR表达（数据未显示），在BCR交联后监测荧光。之前描述的EBV+LMP2A+（表​（表1，1，WT4）和EBV+LMP2A−（表​（表1，1，ES1）LCL作为对照(27). EBV+LMP2A+LCL在BCR交联后显示出最小的钙通量（5-13%）（表​（表1）。1). 与对照组EBV+LMP2A−LCL（411%）的平均钙通量值相比，这些钙通量值较小（表​（表1）。1). 还测试了代表性EBV+LMP2AY112F点突变LCL，观察到平均钙通量为80至368%，平均值大于EBV+LMP2A+LCL（5至13%）（表​（表1）。1). 这些数据表明，与EBV+LMP2A+LCL不同，LMP2AY112 LCL在BCR交联后容易动员钙，而EBV+LMP2A+LCL显示BCR交联诱导的钙动员受阻。

表1

BCR交联后EBV+LMP2A+、EBV+LMP2A-和LMP2AY112F LCL中的钙动员一

细胞株类型和名称b条不。c（c）钙平均增加%（范围）
EBV+LMP2A+LCL
 工作任务458 (3–11)
 KC公司。重量1213 (10–16)
 KC公司。重量3210 (7–12)
 右上角。重量C.1225 (0–10)
 左后。重量G.256 (0–11)
eb病毒+LMP2A−LCL
 ES1系统5411 (270–560)
EBV+LMP2AY112F LCL
 LMP2AY112.C.35192 (139–276)
 LMP2AY112.E.8号机组三80（56–123）
 LMP2AY112.A.6号机组4103 (69–149)
 LMP2AY112.D.2号机组2124 (88–159)
 LMP2AY112.G.10号机组三90 (41–149)
 LMP2AY112.A.10号机组三79 (65–93)
 LMP2AY112.G.5号机组2368 (181–554)
 LMP2AY112.A.3号机组2102 (75–128)
 LMP2AY112.E.6号机组489 (46–173)
 LMP2AY112.B.4段1132
 LMP2AY112.H.2号机组三156 (92–222)
 LMP2AY112.H.10号机组三102 (69–137)
一LCL（3×106)在负载缓冲液中再次悬浮，并在室温下用2 mM fluo-3负载30分钟。装载后，将LCL清洗两次，并重新悬浮在装载缓冲液中。然后在Perkin-Elmer LS-5B发光光谱仪中对制备的细胞进行sIg交联后的荧光测量（参见材料和方法）。 
b条之前描述过WT4和ES1(27). 本研究中产生了所有其他低成本低成本。 
c（c）测定每个LCL的钙动员次数。 

BCR交联后诱导EBV+LMP2AY112F突变LCL中BZLF1表达。

通过分析EBV裂解复制的即时反式激活因子BZLF1的表达，研究BCR交联后EBV+LMP2A+、EBV+LMP2A-和EBV+LP2AY112 LCL中裂解病毒复制的激活。在具有代表性的EBV+LMP2A+、EBV+LMP2A-或EBV+LBP2AY112F LCL中，BCR未经处理或用山羊抗人Ig抗体处理48小时，并用单克隆抗体BZ1免疫印迹法监测细胞裂解液中BCR诱导的BZLF1表达(27,48). 在两个对照EBV+LMP2A−LCL中BCR交联后，BZLF1表达明显（图。​（图8，8，泳道4和6）和五种具有代表性的EBV+LMP2AY112F LCL（图。​（图8，8，通道8、10、12、14和16），但在BCR交联之前未在任何EBV+LMP2AY112F LCL中检测到（图。​（图8，8，车道7、9、11、13和15）或两个EBV+LMP2A−LCL（图。​（图8，8，车道3和5）。无论是在BCR交联之前还是之后，在代表性EBV+LMP2A+LCL中均未检测到BZLF1表达（图。​（图8，8，车道1和2）。两种不同大小的BZLF1蛋白反映了不同病毒分离物的BZLF1基因中存在的不同数量的重复序列。两种分子量的BZLF1蛋白与BZ1单克隆抗体特异性反应。这些数据表明，LMP2A的酪氨酸112在BCR交联后LMP2A介导的病毒核基因转录抑制中起着重要作用，并且LMP2A酪氨酸残基112的缺失导致BZLF1表达的诱导，这是导致EBV裂解复制的最初事件之一。

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BCR交联后诱导EBV+LMP2A−和EBV+LMP2AY112F LCL中BZLF1表达。LCL（4×106)未经处理（−）或用抗BCR抗体处理（+）48小时。用SDS-PAGE（8%凝胶）分离全细胞裂解物，转移到Immobilon，用抗BZLF1抗体BZ1免疫印迹，用HRP-结合的二级抗体孵育，用ECL检测蛋白质。在五个EBV+LMP2AY112F LCL中，抗BCR治疗后（第8、10、12、14和16道）诱导了BZLF1的表达，与两个EBV+LMP2A−LCL的结果相似，包括作为阳性对照（第4和6道）。然而，在EBV+LMP2A+LCL中，抗BCR治疗后未诱导BZLF1的表达，作为阴性对照（第2道）。在BCR交联之前，在任何LCL中均未检测到BZLF1表达（通道1、3、5、7、9、11、13和15）。LCL克隆号显示在每对通道的上方，蛋白质标准显示在左侧，单位为千道尔顿。

讨论

本研究报告的结果表明，LMP2A的酪氨酸112对LMP2A介导的BCR信号转导的下调至关重要。LMP2AY112F突变导致正常BCR信号转导的恢复，如酪氨酸磷酸化的诱导所示（图。​（图7），7)细胞内钙的动员（表​（表1），1)，诱导核基因转录（图。​（图8），8)以及细胞PTK的激活（图。​（图6）6)BCR交联后。此外，LMP2AY112F突变导致Lyn与LMP2A的相关性丧失（图。​（图3A）三A） 以及LMP2A酪氨酸磷酸化的丢失（图。​（图55B） ●●●●。

将本研究收集的数据与之前发表的LMP2研究和BCR信号转导研究的数据相结合，我们建立了潜伏感染B淋巴细胞中LMP2A功能的模型（图。​（图9）。9). 在这个模型中，LMP2A在EBV潜伏感染的B细胞的质膜中表达，并形成类似连接性BCR的聚集物（图。​（图9）。9). 以前的研究表明，LMP2A的跨膜结构域负责LMP2A聚集。在两个或五个跨膜结构域后截短LMP2A会导致LMP2A聚集性的丧失以及伴随的LMP2A功能的丧失(20,27). 一旦LMP2A在新感染的B细胞中聚集，Lyn PTK可以通过类似于将非激活的Src家族PTK招募到非磷酸化BCR的策略招募到未磷酸化的LMP2A聚集物中。Lyn的氨基末端独特区域在Lyn与非磷酸化Igα链（Igα）的结合中起着重要作用。Lyn的独特区域与位于IgαITAM第二个保守酪氨酸之前的DCSM序列结合(8,35). 有趣的是，LMP2A有一个位于LMP2A ITAM附近的同源DQSL序列，该序列通过为Lyn PTK在未磷酸化的LMP2A上提供一个对接位点，可能发挥与DCSM Igα序列类似的作用（图。​（图9A）。9A） ●●●●。或者，Lyn SH3结构域可以与LMP2A氨基末端结构域中四个富含脯氨酸的区域之一相互作用（图。​（图9A）。9A） ●●●●。在pY112F-和p2AΔ80-112-转染的免疫沉淀物中检测到的少量Lyn PTK与这些假设中的任何一个都是一致的（图。​（图3A）。三A） ●●●●。

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LMP2A功能的模型。（A） Src家族PTK-Lyn可能通过Lyn SH3结构域与LMP2A富含脯氨酸区域的相互作用或Lyn独特区域（U）与LMP2A-DQSL序列的相互作用被招募到LMP2A。WW域蛋白也可能被征募到LMP2A非磷酸化PPPPY基序。（B） LMP2A在Y112被Lyn PTK或另一未识别的细胞PTK磷酸化，可能是p57或p60蛋白，在BCR交联之前，在野生型和LMP2AY112F LCL中都观察到其磷酸化。（C） 一旦Y112被磷酸化，Lyn SH2结构域就会结合。在Lyn与LMP2A Y112结合后，剩余的LMP2A酪氨酸，包括LMP2A ITAM，被磷酸化。Y112F突变体中Lyn与LMP2A的结合以及随后的LMP2A磷酸化被阻断；因此，Y112F突变体不进行步骤C。（D）其他磷酸化LMP2A基序的存在允许Syk PTK、其他含SH2的蛋白质和MAPK与磷酸化LMP2A结合。一旦与LMP2A结合，其活性降低，不再参与BCR信号转导。在LMP2A ITAM（Y74F和Y85F）突变体中，Syk与LMP2A的结合被阻断，尽管LMP2A仍然显示其他酪氨酸的磷酸化。由于Syk与LMP2A结合缺失，LMP2A ITAM突变体没有完全进入步骤D。

一旦Lyn被上述一种或两种机制招募到LMP2A，Lyn就会在Y112磷酸化LMP2A。或者，一种未知的激酶，可能是其组成磷酸化在LMP2AY112F LCL以及EBV+LMP2A+LCL中诱导的蛋白质之一（图。​（图7），7)，可在Y112磷酸化LMP2A（图。​（图9B）。9B） ●●●●。一旦Y112被磷酸化，Lyn在Y112结合，随后磷酸化剩余的LMP2A酪氨酸，特别是LMP2A ITAM的两个酪氨酸（图。​（图9C）。9C） ●●●●。LMP2AY112的LMP2A磷酸酪氨酸基序是YEEA，类似于YEEI基序，它是Src家族PTK首选的SH2结构域结合基序(39). 有趣的是，BCR没有包含类似的基序。Lyn对LMP2A YEEA基序的特异性可能使Lyn优先与LMP2A结合，并使LMP2A具有阻断正常BCR信号转导的能力。本研究提供的数据证明了Lyn PTK对LMP2A功能的重要作用。Y112处Lyn与LMP2A无关联（图。​（图3A），三A） ，LMP2A不会磷酸化（图。​（图5），5)，BCR介导的信号转导事件发生，酪氨酸磷酸化的诱导证明了这一点（图。​（图7），7)细胞内钙的动员（表​（表1），1)，诱导BZLF1转录（图。​（图8），8)以及PTK活动的诱导（图。​（图6）6)在LMP2AY112F LCL中。

在LMP2A磷酸化后，其他SH2结构域蛋白可能被招募到LMP2A聚集体中，就像包含SH2的蛋白在BCR交联后被招募到BCR中一样。具体来说，Syk PTK与磷酸化的LMP2A ITAM结合(12)（图。​（图9D），9D） 类似于Syk与Igα和Igβ异二聚体中存在的ITAM的结合。Syk与Igα和Igβ异二聚体的结合需要ITAM的完全磷酸化(17)类似于Syk仅与完全磷酸化的LMP2A ITAM结合的要求。LMP2A ITAM中任一酪氨酸的突变导致Syk与LMP2A结合的缺失(12). 尽管Syk不能与LMP2A ITAM突变体结合，但LMP2A仍在其他LMP2A氨基末端酪氨酸处磷酸化(12). 一旦LMP2A被磷酸化，其他参与正常BCR信号转导的未知SH2结构域蛋白也可能被招募到LMP2A磷酸化酪氨酸中。在免疫沉淀研究中，LMP2A与至少六种未知的细胞蛋白相关(2). 候选蛋白为Shc、PI3-K、PLCγ2、Abl、Crk、Nck和Csk。此外，其他蛋白质，如MAPK或WW域蛋白也可能被征募到LMP2A聚集体中（图。​（图9A9A和D）。MAPK已被证明能结合LMP2A氨基末端谷胱甘肽秒-转移酶融合蛋白(33). 在表达LMP2A的LCL中，许多相同的蛋白质（PI3-K、PLCγ2、Vav、Shc和MAPK）不能被BCR交联激活(26)，从而证明了LMP2A与其他细胞信号转导子相互作用以及LMP2A下调其活性的进一步证据。一旦与LMP2A结合，这些蛋白质的功能活性可能会改变。一旦被征募到LMP2A聚集体中，隔离的LMP2A相关蛋白将不再自由参与正常的BCR信号转导。或者，LMP2A可以诱导细胞信号传感器脱敏，从而阻止正常的B细胞信号转导。脱敏可能由Csk介导，Csk是Src家族PTK的负调控因子，也可能由LMP2A复合物中的蛋白磷酸酶介导。例如，当SHP-1被Fc受体招募到BCR复合体时，会导致BCR信号转导的下调(9). 在其他系统中也观察到病毒蛋白对细胞蛋白的这种功能性失活，例如人类乳头瘤病毒E7癌蛋白对抑癌蛋白Rb的结合和失活(31).

我们对LMP2A功能的研究也强调了Lyn和Syk PTK在BCR信号转导中的核心重要性。Src家族PTK和Syk与BCR相关，并在受体激活后被激活(三,6,8,16,19,36,45,46). 大量的生化和遗传数据表明，这些PTK在B细胞信号转导中的重要性。与LMP2A功能研究最相关的是小鼠和鸡B细胞中的Lyn和Syk基因敲除(7,15,32,41,42). EBV+LMP2A+LCL显示出BCR介导的信号表型，与鸡B细胞中Syk基因敲除的信号表型非常相似，表明BCR信号转导完全中断(41). 在鸡B细胞的Lyn基因敲除中，B细胞信号转导只有轻微改变(41)可能是因为Lyn功能被其他Src家族PTK替代。这些观察进一步证明了Lyn和Syk PTK在正常B细胞信号转导过程中的中心重要性，以及这些PTK的丢失或失活如何显著改变B细胞的信号通路。LMP2A结合和下调这两种PTK活性的能力为LMP2A有效阻断BCR介导的信号转导提供了手段。

其他LMP2A相关蛋白的作用尚待确定。在我们当前的LMP2A功能模型中，提出了其他细胞信号蛋白与LMP2A磷酸酪氨酸或富含脯氨酸区域的结合，这些信号蛋白包含模块SH2、SH3或WW结构域。LMP2A可能以BCR诱导的PTK磷酸化事件直接或间接激活的蛋白质为靶点。候选蛋白质为Shc、PI3-K、PLCγ2、Abl、Crk、Nck和Csk蛋白质。对剩余的LMP2A酪氨酸残基和LMP2A脯氨酸富集区的未来功能分析将确定这些元素在LMP2A介导的BCR信号转导中的潜在作用。

将这些研究中获得的知识应用于LMP2A在体内的作用，表明LMP2A对保持感染者外周血B淋巴细胞内潜伏EBV感染具有重要作用。在这些细胞中，阻断BCR介导的信号转导可能会使EBV感染的B细胞遇到BCR特异性信号，而无需进行裂解复制，从而在受感染的宿主内保持潜伏病毒基因组的储备。然而，在某些情况下可能会发生裂解复制，例如EBV感染的淋巴细胞与上皮产生的细胞因子或上皮表面的相互作用，使用LMP2A无法有效阻断的信号转导途径。这种独特的病毒蛋白整合到B细胞信号转导途径中，以阻断正常的B细胞功能，为研究EBV在人类中持续存在的策略提供了难得的机会。我们对LMP2A和细胞蛋白之间这种不寻常的相互作用的研究可能为EBV感染的调节提供见解，为控制或预防EBV潜伏和潜伏相关综合征提供新的治疗方法，并可能进一步加深我们对B细胞信号转导的理解。

鸣谢

R.L.得到了国家癌症研究所公共卫生服务拨款CA62234和CA73507的支持。R.L.是美国白血病学会的学者。

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文章来自病毒学杂志由以下人员提供美国微生物学会（ASM）