《维罗尔杂志》。1998年10月；72(10): 7785–7795.
NH2单纯疱疹病毒1型调节蛋白ICP0末端包含启动子特异性转录激活域
哥伦比亚大学微生物学系和内科与外科医生学院，纽约州纽约市10032
*通讯作者。通讯地址：纽约哥伦比亚大学微生物学系和内科与外科医生学院，邮编：10032。电话：（212）305-8149。传真：（212）305-5106。电子邮件：ude.aibmuloc@6sjs. 1998年4月9日收到；1998年6月15日接受。
摘要
单纯疱疹病毒的转录程序受三种早期（α）蛋白ICP4、ICP27和ICP0的协同作用调节。本研究中描述的实验检验了ICP0的酸性氨基酸末端（氨基酸1至103）在基因激活中的作用。当连接到DNA结合域时，该序列激活酵母中的转录酿酒酵母在瞬时表达分析中，这些氨基酸的缺失会影响ICP0激活α基因启动子报告子的能力，而对同一分析中的β和γ基因报告子几乎没有影响。表达缺失型ICP0（ICP0-NX）的病毒在Vero细胞和互补细胞系L7上都具有小塑性表型。瞬时表达和免疫荧光分析表明ICP0-NX是ICP0的主要阴性形式。从与表达ICP0-NX和ICP0的病毒共感染的细胞中免疫沉淀ICP0，发现ICP0在感染细胞中齐聚。这些数据，再加上ICP0-N/X为显性阴性的发现，提供了生化和遗传学证据，证明ICP0在受感染细胞中起多聚体的作用。
单纯疱疹病毒1型和2型（HSV-1和-2）感染从外围的原发性溶血感染发展到感觉神经元的终身潜伏状态，其特征是病毒重新激活和溶血感染。控制HSV基因表达、潜伏期的建立和维持以及潜伏病毒的重新激活的调控机制是复杂的。
根据HSV-1和-2基因在生产性感染期间的时间表达，将其分为三个动力学类别，即立即早期（α）、早期（β）和晚期（γ）（参考文献30,31、和53以及其中的参考）。即刻早期基因（α0、α4、α27、α22、α47和αX）（参考文献2和53以及其中的参考文献）是病毒基因组传递到宿主细胞核后第一个转录的。早期基因（其产物主要参与病毒基因组的复制）和晚期基因（编码单纯疱疹病毒的许多结构成分）的后续表达需要事先合成α基因产物(11,12,41,48,51). 证据表明，α基因产物中的三种，即ICP0、ICP4和ICP27，协同调节所有动力学类病毒基因的表达(19,22,40,44,48,51,54,64). ICP4似乎激活β和γ基因转录，同时抑制其自身和α0基因的表达(11,24,36,37,48,50,52). ICP0，一种混杂的转录激活物（参考文献18,22、和53以及其中的参考文献），已证明影响必需α蛋白ICP27的表达和合成以及感染后早期ICP0和ICP4的表达(38). 疱疹病毒生命周期中β和γ基因的表达需要ICP27。虽然该蛋白似乎主要在转录后水平发挥作用(28,47,56,57,60)，它与ICP4的相互作用支持ICP27在基因表达调控中发挥更直接的作用(46).
瞬时表达分析和/或病毒基因组背景下ICP0的突变和生化分析导致了对激活基因表达和病毒复制至关重要的结构域的识别(4,6,7,15——17,61). 这些域在ICP0功能中的作用基本上仍不明确。ICP0含有酸性NH2-终端域，一个必需的C三碳氢化合物4锌指(6,7,14——17,20,38)，一个核定位信号，两个位于中心的富含脯氨酸的区域，和一个可能代表磷酸化位点的丝氨酸束（参考文献7和53以及其中的参考；66). 感染细胞中的ICP0齐聚物(5,10,42)并与主要病毒调节蛋白ICP4相互作用(43,46,67). 已证明ICP27可以影响转染细胞中ICP0的细胞内分布(69). 然而，由于ICP4与ICP0和ICP27直接相互作用，ICP27对ICP0细胞内定位的依赖性影响可能通过其与ICP4的相互作用来介导。最近的研究表明，ICP0也与细胞蛋白cyclin D3相互作用(33)和翻译延伸因子eEF1Bα，一种GTP交换因子（参考中称为EF-1δ32). 然而，这些相互作用在生产性感染中的相关性尚不清楚。
本报告提出了一系列实验，以表征酸性NH的作用2ICP0在HSV-1生长和复制中的末端。我们证明该结构域在酿酒酵母。瞬时表达分析中的缺失分析进一步证明，ICP0的这个区域是ICP0介导HSV-1α启动子转录激活所必需的，而不是β或γ启动子。在病毒基因组背景下，ICP0 NH的缺失2末端导致Vero细胞和表达ICP0的细胞L7中HSV-1生长缺陷、小斑块和高荧光焦点单位（FFU）/PFU比值(55). ICP0 NH2-末端缺失突变体EL0-N/X缺乏氨基酸（aa）3至104，通过与野生型ICP0形成低聚物，充当ICP0功能的主要负抑制剂。该分析首次明确证明ICP0含有启动子特异性转录激活域，并表明ICP0的功能依赖于受感染细胞中二聚体和/或高阶低聚物的形成。
材料和方法
细胞和病毒。
Vero和L7(55)细胞在含有5%小牛血清的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM；Gibco BRL，纽约州格兰德岛）中生长和维持（HyClone Laboratories Inc.，犹他州洛根）。对于L7细胞的生长，DMEM每毫升293T细胞补充400μg G418（Gibco BRL）(13)保存在含有10%胎牛血清（HyClone）的DMEM中。除非另有说明，否则培养基中添加青霉素（100 U/ml）和链霉素（100μg/ml）（Gibco BRL）。
本研究中使用的野生型HSV-1菌株为格拉斯哥17和KOS 1.1。α0 cDNA病毒vCPc0(38,46)和α0缺失病毒数字图书馆1403已在别处描述(61).
质粒。（i） α0 cDNA构建物。
质粒pDS17，包含α0 cDNA及其相关调节序列(68)，通过替换Mlu公司我-生态pDS16的RI片段(68)与p0XB中的相应片段(7). 质粒pDSE-17B是通过破坏天冬氨酸718位点位于pDS17中HSV-1序列的3′。
（ii）GAL4-BD–α0、LexA-α0和GAL4-AD–α0基因融合。
质粒pGBT9（Clontech，Palo Alto，CA）在酵母的控制下编码GAL4 DNA结合结构域（GAL4-BD；aa 1-147）ADH1（ADH1）发起人。质粒pBTM116在酵母的控制下编码整个LexA蛋白编码序列（aa 1至202）ADH1（ADH1）发起人。通过插入Nco公司我-Bgl公司用酶切法将pDS17中α0 cDNA的II片段消解到pGBT9中生态RI和巴姆你好。在此构造中Nco公司我和生态RI位点用Klenow DNA聚合酶填充。通过删除Xho公司我-萨尔pXW2α0基因的I片段。通过删除天冬氨酸718年-萨尔pXW2的I片段。pJY7（GAL4-BD–ICP0 aa 105至212）通过插入Xho公司我-Pst（磅/平方英尺）将pJY4的I片段消化为pGBT9萨尔我和Pst（磅/平方英尺）I.质粒pCPC-YGal03楼（GAL4-BD–ICP0 aa 394至775）通过删除生态RI公司-不是pXW2的I片段。质粒pPC62-86通过替换萨尔我-巴姆pPC62的HI片段(8)带有相应的pPC86片段(8). pBD62-0105/769（GAL4-BD–ICP0 aa 105至769）通过插入Bgl公司将pGAD0105/769的II片段插入pPC62-86。pGAD0105-769（GAL4-AD–ICP0 aa 105至769）通过插入Xho公司我-生态pGAD0的RI片段转化为pGAD10（克隆技术）。pGAD0（GAL4-AD–ICP0 aa 1至769）通过插入Mlu公司我-不是我和不是我-萨尔将pAD86-01的I片段消化到pGAD10中Mlu公司我和Xho公司I.质粒pGBT-VP16T通过亚克隆生态RI公司-Bcl公司pGAL4-VP16（纽约哥伦比亚大学微生物系凯瑟琳·卡拉姆赠送的礼物）的I片段，经消化后放入pGBT9生态RI和巴姆你好。通过插入生态RI公司-Pst（磅/平方英尺）pJY3和pJY4的I片段分别进入pBTM116。质粒pGAD10（Clontech）编码GAL4转录激活域（GAL4-AD；aa 768至881）。pGAD0105（GAL4-AD–ICP0 aa 1至105）通过插入Mlu公司我-Xho公司将pAD86-01的I片段插入pGAD10。pAD86-01（GAL4-AD–ICP0 aa 1至775）编码pPC86中GAL4-AD和ICP0的aa 1到775之间的融合蛋白。通过DNA序列分析验证了GAL4-BD、LexA或GAL4-AD与α0基因区域之间的所有连接。
哺乳动物GAL4-BD–ICP0表达构建体的制备如下。pCPC-镀锌0F类（GAL4-BD–ICP0 aa 1至775）通过将Hin公司dIII型-Pst（磅/平方英尺）从pXW2到pSG424的I（钝化）片段(26)用…消化巴姆HI，填充并消化Hin公司d三。pCPC-镀锌07.6（GAL4-BD–ICP0 aa 1至769）和pCPC-Gal07.1（GAL4-BD–ICP0 aa 1至711）通过删除萨尔我的碎片和Bst公司EII公司-萨尔分别来自pCPC-Gal0的I片段F类.pCPC-Gal0型5（GAL4-BD–ICP0 aa 1至551）和pCPC-Gal0三（GAL4-BD–ICP0 aa 1至385）通过插入Hin公司dIII型-Aat公司II（钝化）和Hin公司dIII型-Sma公司分别从pXW2到pSG424的I片段被消化Hin公司dIII型-巴姆HI（填充）。pCPC-镀锌02（GAL4-BD–ICP0 aa 1至212）通过删除600-bp天冬氨酸pCPC-Gal0的718片段三和pCPC-Gal01（GAL4-BD–ICP0 aa 1至105）通过亚克隆Hin公司dIII型-Pst（磅/平方英尺）从pJY3到pSG424的I（钝化）片段已被消化Hin公司dIII型-巴姆HI（填充）。pCPC-镀锌03楼（GAL4-BD–ICP0 aa 392至775）和pCPC-Gal03-7.6（GAL4-BD–ICP0 aa 392至769）通过克隆Hin公司dIII型-Pst（磅/平方英尺）I（钝了）和Hin公司dIII型-萨尔分别来自pCPC-YGal0的I片段3楼转化为pSG424，用Hin公司dIII型-巴姆HI（填充）或Hin公司dIII型-萨尔I.pCPC-Gal01-2个（GAL4-BD–ICP0 aa 105至212）和pCPC-Gal01至7.6（GAL4-BD–ICP0 aa 105至769）通过克隆750-和2400bpHin公司dIII型-巴姆质粒pBD62-0105/212和pBD62-005/769的HI片段分别进入Hin公司dIII型-巴姆HI消化的pSG424。pBD62-0105/212通过插入Hin公司dIII型-Pst（磅/平方英尺）pJY7（如上所述）的I片段进入pPC62-86/3。pPC62-86/3通过插入Bgl公司二-巴姆pPC86的HI片段进入pPC62-2，该pPC62-3是通过用萨尔一、 填充DNA末端并结扎。pCPC-镀锌01-5（GAL4-BD–ICP0 aa 105至553）是通过插入1750 bpHin公司dIII型-萨克将pBD62-0105/553（GAL4-BD–ICP0 aa 105至553）中的I片段消化到pSG424中Hin公司dIII和萨克I.通过将编码HSV-1 ICP0的aa 105至553的α0序列插入pPC62，构建pBD62-0105/553。
（iii）α0突变体结构。
pEL0N/X编码缺失aa 3至104的突变ICP0，构建如下。引物0-N/X-5′3′（CATGGAATTCGC）和0-N/X-3′5′（TCGAGCGAATTCNco公司我和Xho公司I.通过DNA测序验证了产生的缺失。质粒pEL0-TIF编码HSV-1αTIF（αTIF-AD；aa 411-490）转录激活域和ICP0 aa 105至775之间的融合蛋白，构建如下。从pRAB14中扩增出编码αTIF的aa 411-490的DNA序列(2)通过PCR（如下所述），使用引物（Gibco BRL）生成Nco公司我或Xho公司我定位并维持α0基因（VP16AD 5′3′[GCCCATGGTCGACGGCCCCCCGACC]和VP16AD 3′5′[GCTCGAGACCCACCGTACGTCAATTCCCATCC]）的阅读框。将得到的PCR产物克隆到pGEM-T中，从而生成pGEM-T-VP16。DNA序列分析证实了pGEM-T-VP16中αTIF-AD的预测DNA序列。这个Nco公司我-Xho公司将pGEM-T-VP16的I片段插入pDSE-17B中，用Nco公司我和Xho公司一、 从而将编码ICP0 aa 2的α0序列替换为104。质粒pEL17ΔM通过插入Hin公司dIII型-Mlu公司pDSE-17B的I片段进入pIBI31。
（iv）萤火虫荧光素酶报告质粒。
质粒pCPC-4P-LUC、pTK-LUC和pEL-PgC-LUC已在别处描述(38). 分两步构建质粒pCPC-27P-LUC，该质粒包含HSV-1（KOS 1.1株）α27基因调控序列控制下的萤火虫荧光素酶报告基因。首先巴姆HI（高）-Bgl公司质粒pBSΔ27的II片段(60)被克隆到pIC20H(39)用…消化巴姆HI和Bgl公司二、。由此产生的质粒pCPC-27P包含相对于转录起始位点从−266到−2的α27基因序列。pCPC-27P-LUC是通过克隆巴姆p19LUC的HI片段(63)，含有荧光素酶基因编码序列Bgl公司pCPC-27P的II位点。质粒pCPC-22/47P-LUC也分两步制备。首先，通过亚克隆pCPC-4/22P巴姆HI（高）-Bgl公司质粒pIGA101的II片段(23)，包含HSV-1 F株α4和α22/47基因5′调控序列巴姆HI（高）-Bgl公司Ⅱ缩pIC20H(39). pCPC-22/47P-LUC包含荧光素酶基因，受α22/47基因调控序列（−724到+33）控制，通过克隆巴姆从p19LUC到HI荧光素酶基因片段Bgl公司pCPC-4/22P的II位点。质粒pCPC-0P-LUC构建如下。这个萨克I（已填充）-Nco公司来自pXW8的I（填充）片段(37)，包含HSV-1菌株17的−789至+147α0基因序列，被克隆到生态RV消化载体pZero2.1（加利福尼亚州拉霍亚市斯特拉赫尼）产生质粒pCPC-0PL（左）.A型斯图I片段已从pCPC-0P中删除L（左）获得质粒pCPC-0P，其中包含α0基因的−537至+147区域。这个巴姆来自p19LUC的HI片段被克隆到巴姆HI消化pCPC-0P以生成pCPC-0 P-LUC。pG5-TK-LUC是凯瑟琳·卡拉姆送的礼物。
β-半乳糖苷酶分析。（i） 过滤分析。
酿酒酵母190日元(29)和CTY10-5d（Rolf Sternglanz，纽约州立大学石溪分校）维持在30°C的YPD培养基上。用1μg质粒DNA和鲑鱼精子载体DNA转化酵母细胞。在适当的情况下，在含有25 mM 3-氨基-1,2,4-三唑且缺乏适当氨基酸（Trp或Leu和His）的SD培养基（密歇根州底特律Difco Laboratories）上在30°C下培养转化子3至4天(27). 将酵母菌落提升到硝化纤维素膜上（Schleicher&Schuell，Keene，N.H.），并通过将其在−80°C下冷冻15分钟来溶解细胞。达到室温后，将硝化纤维素圆盘放入含有5 ml Z缓冲液（60 mM Na）的培养皿中2高性能操作4，40 mM NaH2人事军官4，10 mM KCl，1 mM MgSO4，0.3%β-巯基乙醇），含1mg 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d日-每毫升吡喃半乳糖苷（X-Gal），并在30°C下培养1至5小时。
（ii）液体分析。
克隆Y190转化子在不含Trp或Leu且含有0.05%葡萄糖的SD培养基中生长，在600 nm（OD）下达到光密度600)约0.6。通过1500×离心收集细胞克在4°C下保持5分钟，并重新悬浮在冰镇Z缓冲液中。然后，将200μl冰镇酸洗玻璃珠添加到每个细胞颗粒中，并通过将其旋转三次，每次1 min来溶解细胞。通过在2500×克在4°C下保持5分钟，并通过Bradford方法测定总蛋白浓度。对于β-半乳糖苷酶分析，在添加200μl的4 mgo（o）-硝基苯-β-d日-每毫升吡喃半乳糖苷（ONPG），将混合物在30°C下培养至淡黄色（<30分钟）。通过添加500μl 1 M Na停止反应2一氧化碳三和OD420已确定。每毫克总蛋白中的β-半乳糖苷酶单位是根据1 Uβ-半乳糖苷酶等于水解10所需的酶量来确定的−9每分钟ONPG摩尔数。
转染和瞬时表达分析。（i） 转染。
如前所述，通过磷酸钙沉淀法将所示质粒转染Vero细胞(38).
（ii）荧光素酶分析。
如前所述，在转染后48小时收集转染的Vero细胞单层，并使用Berthold Lumat LB9501光度计（Wallac Inc.，马里兰州盖瑟斯堡）定量荧光素酶活性(三). 荧光素酶活性由至少两个独立实验中的三次转染测定。
重组疱疹病毒的构建。
如前所述构建重组疱疹病毒(38). 简单地说，疱疹病毒核衣壳的线性化质粒pEL0-N/X、pEL0-TIF或pEL17ΔM和100 PFU，从感染α0空病毒的细胞中纯化数字图书馆1403 (59)，转染到Vero细胞中。分离重组病毒vEL0-N/X、vEL0-TIF和vEL0-NXR，并对斑块进行三次纯化。vEL0-N/X编码缺失aa 3至104的ICP0突变形式。vEL0-TIF编码ICP0的突变形式，其中aa 2至104已被HSV-1αTIF-AD取代（aa 411至490）；vEL0-NXR是利用从感染vEL0-N/X的细胞中分离的病毒核衣壳构建的，它从α0 cDNA中编码野生型ICP0。通过Southern blot分析验证了这些病毒中α0基因座的序列安排。验证每个突变的DNA序列。
病毒生长分析。
Vero细胞在指定的感染多重性（MOI）下被感染。病毒吸附后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗受感染细胞单层两次，并用新鲜培养基覆盖。在指定的时间，通过在−80°C下冷冻细胞来阻止感染。通过在表达ICP0的细胞系L7上滴定来测定病毒产量(55). 生长曲线表示两种独立感染的平均值，每种感染都进行了重复滴定。
协同免疫沉淀。（i） 转染。
使用磷酸钙沉淀法，用pDSE-17B（5μg/10-cm直径板）、pEL0-N/X（5μg/km直径板）或两种质粒的混合物（每个质粒5μg/10-cm直径盘）转染293T细胞(65). 在转染后48小时，收集细胞（每种条件下四个直径为10厘米的平板），并用含有1 mM苯甲基磺酰基氟化物（PMSF）的冷冻PBS清洗三次。将每个细胞沉淀重悬于3ml ICP0裂解缓冲液[20mM HEPES-KOH（pH 7.9），0.25%（vol/vol）Nonidet P-40，400mM NaCl，10mM MgCl2，10%（体积/体积）甘油，1mM PMSF，0.1mM我-1-氯-3-（4-对甲苯酰胺）-4-苯基-2-丁酮（TPCK），0.1 mM我-含有DNase I（50μg/ml）和RNase I的1-氯-3-（4-对甲苯酰胺）-7-氨基-2-庚酮（TLCK）。细胞裂解物在4°C下培养20 min，在Branson（Danbury，Conn.）Sonifer 450中超声90 s，并在5000×克在4°C下保持15分钟，然后在16000×克在4°C下保持15分钟。
（ii）感染。
Vero细胞感染野生型HSV-1、vEL0-N/X或这两种病毒，MOI为5。在感染后7小时，用含有1 mM PMSF的冰镇PBS清洗细胞三次，并如上所述制备细胞裂解物。
（iii）免疫沉淀。
用兔多克隆抗体（CLU7）进行免疫沉淀，该抗体可识别aa 312至400之间ICP0内的表位(37)或识别NH的亲和纯化兔多克隆抗体（α0-N18）2-HSV-1 ICP0的端子18 aa。在添加30μl GammaBind Plus Sepharose（Pharmacia，Piscataway，N.J.）悬浮液（ICP0裂解缓冲液中50%[vol/vol]）之前，将每种上清液的500μl小份与5μl指示的抗ICP0抗体混合，并在4°C下孵育1 h。按照前面的描述清洗珠子(38)，重新悬浮在30μl 1.5×十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）样品缓冲液中，煮沸5分钟。免疫沉淀蛋白通过SDS-PACE分离并通过Western blot分析检测，如下所述，使用抗体CLU7(37).
蛋白质印迹分析。（i） 转基因细胞。
如前所述，用15μg质粒DNA转染293T细胞，转染在直径为10-cm的平板中(38,46). 转染后48小时，将细胞刮入冰镇PBS中，以2000×克在4°C下保持5分钟。如前所述，将细胞颗粒溶解在1.5×SDS-PAGE样品缓冲液中(38). 蛋白质在7.5%变性聚丙烯酰胺凝胶中分离(34)并电泳转移到硝化纤维素膜(62). 如前所述，使用兔多克隆抗体CLU7检测ICP0(38).
（ii）HSV-1感染细胞。
Vero细胞每细胞感染1个FFU。感染后8小时，将细胞刮入冰镇PBS中，并通过离心收集。将受感染的细胞颗粒溶解在1.5×SDS-PAGE样品缓冲液中，并按照前面所述用SDS-PACE分离蛋白质(38). 如其他地方所述，对病毒蛋白进行免疫检测(45). 使用以下抗体检测HSV-1蛋白：ICP0、CLU7(37); ICP4，小鼠单克隆抗体H1114（佛罗里达州种植园古德温癌症研究所）；ICP27，兔多克隆抗体CLU38(37); 糖蛋白B（gB），兔多克隆抗体R69（由宾夕法尼亚大学G.Cohen提供）；和VP5，兔多克隆抗体NC-1（也由G.Cohen提供）。本研究中使用的二级抗体为辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔免疫球蛋白G和山羊抗鼠免疫球蛋白G（西格玛化学公司，密苏里州圣路易斯）。免疫印迹如前所述(38).
免疫荧光。
用5μg编码野生型或突变型ICP0的质粒DNA转染Vero细胞，或用指示的疱疹病毒感染。在转染后48小时或感染后8小时，如前所述进行ICP0免疫检测(38)使用单克隆抗体H1083、多克隆抗体CLU7或亲和纯化抗ICP0抗体α0-N18。
荧光聚焦分析。
Vero细胞（106以0.01或0.001的MOI感染野生型HSV-1菌株Glasgow 17、vCPc0、vEL0-N/X、vELO-NXR、vELo-TIF或数字图书馆感染后8和24小时，用PBS冲洗细胞单层，并在90%甲醇中固定10分钟。用小鼠单克隆抗体58S检测ICP4和ICP0(58)和兔多克隆抗体CLU7(37)分别在PBS中稀释1:200。分别在感染后8小时或24小时测定每个细胞的FFU或PFU平均数。因此，FFU/PFU比率表示感染后8小时阳性染色细胞的数量相对于感染后24小时感染细胞灶的数量/细胞场。每种病毒的FFU/PFU比率在三个独立的实验中测定。
结果
酸性NH2ICP0末端可以激活酿酒酵母当融合到异源DNA结合域或蛋白质时。
在转录水平上介导基因表达激活的蛋白质通常包含模块化DNA结合和转录激活域，即在其自然环境之外保留功能的离散域。例如，GAL4和HSV-1αTIF蛋白的特征良好的转录激活域在与异源DNA结合域融合时激活基因表达（参考文献9和49以及其中的参考）。因此，为了鉴定HSV-1早期调节蛋白ICP0中的转录激活域，将α0基因的区域融合到编码GAL4-BD或大肠杆菌LexA蛋白。在两株酿酒酵母、Y190和CTY10-5d。Y190包含lacZ公司和HIS3型报告基因受GAL4上游激活序列控制，CTY10-5d包含lacZ公司在镀锌1启动子包含四个LexA结合位点。因此，当与GAL4-BD或LexA蛋白融合时，ICP0的各个区域作为转录激活域发挥作用的能力由Y190在不含组氨酸的情况下的生长和Y190或CTY10-5d中β-半乳糖苷酶的表达决定（图。).
ICP0融合蛋白转录激活分析酿酒酵母构建了表达融合蛋白的质粒，融合蛋白包含酵母GAL4-BD或细菌LexA蛋白，融合到ICP0或最小HSV-1αTIF-AD区域。这些融合蛋白对报告基因的激活是在酵母中测定的酿酒酵母如材料和方法所述。这些融合蛋白的示意图如图所示。报告基因表达的激活是通过菌株Y190在不含组氨酸（His）的情况下的生长以及通过过滤提升和液体分析测定的β-半乳糖苷酶（β-gal）的表达来确定的。ND，未确定。
包含GAL4-BD和ICP0 aa 1至105或1至212的融合蛋白激活了两者的表达lacZ公司和HIS3型在Y190中，当与GAL4-BD融合时，最小HSV-1αTIF-AD也是如此（图。). 仅GAL4-BD或含NH的融合蛋白2-ICP0的端子105或212 aa与GAL4-AD熔断，无法激活lacZ公司在不存在组氨酸的情况下表达或允许Y190生长（图。). 缺乏NH的融合蛋白2-ICP0的105aa末端也未能介导报告基因表达（图。); 然而，由于其中一些蛋白质无法通过Western blot分析在转化酵母细胞提取物中检测到（数据未显示），它们无法激活报告基因表达可能是因为它们未能积累。这些发现表明酸性NH2-ICP0的105aa末端构成一个转录激活域酿酒酵母与GAL4-BD融合时。
为了消除NH2ICP0的末端能够在与GAL4-BD融合蛋白的背景下独家激活报告基因表达，构建了编码包含与细菌LexA蛋白融合的ICP0的aa 1到105或1到212的融合蛋白的质粒（图。). 测试这些融合蛋白对镀锌1启动子包含四个LexA结合位点酿酒酵母CTY10-5D（图。). 细菌LexA蛋白本身没有激活lacZ公司表达式。然而，含有ICP0 aa 1至105或1至212的LexA融合蛋白被激活lacZ公司CTY10-5D中的表达式（图。). 因此，NH2-ICP0的105 aa末端与GAL4-BD或LexA蛋白融合后，起到转录激活剂的作用。
定量β-半乳糖苷酶分析显示NH2ICP0末端（aa1至105）激活报告基因表达酿酒酵母当与GAL4-BD融合时，达到三倍于最小HSV-1αTIF-AD的水平（图。). 我们进一步注意到，报告基因表达的激活取决于ICP0的这个域与DNA结合域的融合（数据未显示）。总的来说，这些结果与酸性NH2-HSV-1 ICP0的105aa末端构成酵母中的转录激活域。然而，它们并不排除ICP0包含其他转录激活域的可能性。
证明NH2-ICP0的末端区域可以在酵母中起转录激活域的作用，我们接下来问，当与GAL4-BD融合时，该区域是否也可以激活哺乳动物细胞中的基因表达。在猴病毒40早期启动子的控制下，将Vero细胞与编码所示融合蛋白的质粒共转染（图。)以及在HSV-1胸苷激酶（TK）启动子或包含五个串联GAL4结合位点（G5-TK）的TK启动子控制下编码萤火虫荧光素酶基因的报告质粒（图。). 对照组包括编码野生型ICP0或包含GAL4-BD和最小HSV-1αTIF-AD的融合蛋白的质粒（图。). 野生型ICP0激活了TK和G5-TK启动子的基因表达，而GAL4-BD–αTIF-AD融合蛋白仅激活了G5-TK启动子（图。). 含有GAL4-BD和ICP0区域的融合蛋白普遍未能激活报告基因表达（图。). 这个结果并不是由于转录的“抑制”(25)，因为在很大范围内改变效应质粒的浓度并没有改变这一结果。这些GAL4-ICP0融合蛋白的低丰度也不能解释荧光素酶表达的缺乏（图。)，因为所有这些蛋白都很容易通过间接免疫荧光法在转染的Vero细胞中检测到（数据未显示）。然而，这些分析表明，GAL4-BD–ICP0融合蛋白含有NH2-尽管GAL4-BD中存在核定位信号，但ICP0的105或212 aa末端被排除在转染细胞的细胞核之外（数据未显示）。这一观察结果可以解释这些融合蛋白未能激活报告基因表达的原因。然而，它并没有说明为什么全长ICP0在与GAL4-BD融合时不能激活报告基因表达，因为该蛋白在转染细胞的细胞核中积累（数据未显示）。
哺乳动物细胞中GAL4-ICP0融合蛋白的转录激活分析。将酵母GAL4-BD融合到ICP0区域，并按照材料和方法中的描述，测定这些蛋白质中每个蛋白质激活Vero细胞中基因表达的能力。在HSV-1 TK启动子（pTK-LUC）或包含五个串联GAL4结合位点（pG5-TK-LUB）的TK启动程序的控制下，构建指导所示融合蛋白表达的质粒，并与编码萤火虫荧光素酶基因的报告质粒共转染到细胞中。如材料和方法中所述，通过荧光素酶分析确定报告基因表达激活的缺失（−）或存在（+）。质粒pDS17（指导野生型HSV-1 ICP0的表达）和pSG-VP16（指导GAL4–αTIF-AD融合蛋白的表达）用作对照。
删除NH2ICP0末端影响即刻早期病毒基因启动子的反式激活水平。
上述数据提出了NH2-ICP0的105aa末端构成转录激活域。然而，他们也强调了在蛋白质功能分析中使用异源融合蛋白可能引起的并发症。因此，构建了α0 cDNA质粒pEL0-N/X，该质粒在内源性α0启动子/调控序列的控制下编码缺失aa 3至104的截短型ICP0（ICP0-N/X）。在瞬时表达分析中评估了这种缺失对ICP0激活三种主要时间类疱疹病毒启动子中每一类转录的能力的影响。简言之，Vero细胞与编码野生型ICP0或ICP0-N/X的质粒共转染，报告者在α4、α27、α22/47或α0启动子、β-TK启动子或γ-gC启动子的控制下构建萤火虫荧光素酶基因的直接表达（图。). 该分析表明，aa 3至104的缺失导致所有检测到的疱疹病毒α基因启动子的激活显著减少（图。). 这一结果不能归因于ICP0-N/X的总体结构改变，因为它将TK和gC启动子的报告基因表达激活到野生型水平（图。). Western blot分析表明，ICP0-N/X在转染细胞中积累到野生型水平（图。). 这些数据，结合我们的发现，NH2当ICP0末端与异源DNA结合域融合时，激活酵母中的基因表达，支持该域在HSV-1α基因启动子转录激活中的作用。
野生型和突变型ICP0激活HSV-1启动子。将Vero细胞与指导野生型HSV-1 ICP0或指示突变ICP0蛋白表达的质粒（1μg）和适当的报告质粒（1微克）共转染。ICP0-N/X缺少ICP0的aa 3至104。ICP0-TIF包含HSV-1αTIF-AD，代替ICP0的aa 2至104。报告者在HSV-1的α4（4p-LUC）、α27（27p-LUC。在转染后48小时制备总细胞提取物，并按照材料和方法中的描述量化荧光素酶活性。只显示报告质粒转染的细胞（无效应器）。转录激活水平是相对于每个报告质粒的基本表达水平来表达的。
转染细胞中野生型和突变型ICP0的积累。Vero细胞要么模拟转染（mock），要么转染质粒，以指导野生型ICP0或指示突变蛋白（ICP0-N/X或ICP0-TIF）的表达。在转染后48 h制备细胞提取物，并使用兔多克隆抗体CLU7通过Western blot分析测定这些蛋白的相对丰度，如材料和方法中所述。
进一步探讨ICP0 NH的作用2在基因表达激活的末端，我们接下来询问异源转录激活域是否可以在功能上替代ICP0的这一区域。因此，生成了一个结构体，该结构体指导仅包含与ICP0（ICP0-TIF）的aa 105至775融合的αTIF-AD（aa 411至490）的融合蛋白的表达。该蛋白在转染Vero细胞中积累到野生型水平（图。)并且在瞬时表达测定中从α-基因启动子激活的基因表达达到比ICP0-N/X更高的水平（图。). ICP0-TIF将TK启动子激活至野生型水平，但在gC启动子的激活中表现出缺陷（图。). 为了解决αTIF-AD仅作为填充肽发挥作用的可能性，一种编码包含aa 761至861的融合蛋白的构建物大肠杆菌β-半乳糖苷酶融合到ICP0的aa 104至775（ICP0-βgal）。在瞬时表达分析中，ICP0-βgal未能激活报告基因表达（数据未显示）。这些数据表明HSV-1αTIF的特征良好的转录激活域可以在功能上取代NH2ICP0的终点，并进一步支持ICP0含有NH的结论2-末端，启动子特异性转录激活域。
指导ICP0-N/X表达的疱疹病毒的构建和分析。
虽然上述结果表明NH的作用2ICP0在基因表达激活中的末端，他们没有确定该区域是否对HSV-1的生长和复制重要。为了解决这个问题，通过同源重组将突变的α0 cDNA pEL0-N/X引入HSV-1基因组，以生成重组疱疹病毒（vEL0-N/X），在感染过程中指导ICP0-N/X蛋白的合成。指导ICP0-TIF合成的重组病毒vEL0-TIF以类似的方式构建。通过Southern blot分析和DNA测序验证了这些病毒α0位点的序列安排（数据未显示）。
相对于野生型HSV-1或α0 cDNA病毒vCPc0（图。). vEL0-N/X产生的斑块的平均大小与α0缺失病毒相似数字图书馆1403（图。). 这一结果表明NH的删除2-ICP0末端酸性结构域导致HSV-1在组织培养中生长缺陷。为了进一步说明删除ICP0这一区域的影响，vEL0-N/X相对于野生型HSV-1、vCPc0和α0空病毒的生长动力学数字图书馆共检查1403例。以每细胞0.01 FFU的MOI感染Vero细胞（见下文），并通过在ICP0-互补细胞系L7上滴定，在感染后的指定时间测定病毒产量(55). 该分析表明，与野生型HSV-1或α0 cDNA病毒vCPc0相比，vEL0-N/X表现出延迟的生长动力学和降低的病毒产量（图。); 然而，这些缺陷并不像α0缺失病毒所表现的那样严重数字图书馆1403（图。). 因为vEL0-N/X具有较高的FFU/PFU比率（表)并且在Vero和L7细胞上都表现出生长缺陷，感染该病毒的细胞产生的病毒颗粒数量在图中可能未得到充分表示。大约8到10倍。与α0突变病毒依赖MOI的生长相一致(61)vEL0-N/X在高MOI感染中表现出接近野生型的生长动力学和产量（数据未显示）。vEL0-TIF在低MOI下的生长动力学介于vEL0-TIF和野生型HSV-1之间（图。). 因此，NH2ICP0末端对低MOI感染中HSV-1的生长至关重要。
野生型和变异型疱疹病毒斑块大小。Vero细胞感染了指示的野生型和突变型疱疹病毒，MOI为0.001。感染后60小时，用90%甲醇固定感染细胞单层，并用1%结晶紫染色。（A） 通过标准技术拍摄的代表性斑块；（B） 野生型HSV-1、α0 cDNA病毒vCPc0和α0突变体vEL0-N/X和数字图书馆1403，表示为每种病毒40次测量的平均值。平均斑块大小是相对于野生型HSV-1菌株17表达的。
野生型和α0突变疱疹病毒的生长动力学。Vero细胞以每细胞0.01 FFU的MOI感染野生型HSV-1、α0 cDNA病毒vCPc0和α0突变体vEL0-N/X、vEL0-TIF或数字图书馆1403.按照材料和方法中的描述，通过在表达ICP0的细胞系L7单层上滴定来测定感染后指定时间的病毒产量。生长曲线表示两种独立感染的平均值，每种感染都进行了重复滴定。
表1
| 病毒 | 平均FFU/PFU比率一
|
|---|
| Vero细胞 | L7细胞 |
|---|
| HSV-1菌株17 | 1.04 | 1.16 |
| vCPc0版 | 1.16 | 1.04 |
| vEL0-N/X型 | 9.43 | 8.18 |
| vEL0-NXR | 1.4 | ND（无损检测）b条 |
| vEL0-TIF（畅通节能法） | 2.3 | 2 |
| 数字图书馆1403 | 137.3 | 1.52 |
为了排除vEL0-N/X的生长缺陷是由该重组体构建过程中引入的外来突变引起的可能性，该病毒中的N/X缺失被α0 cDNA的野生型序列取代，以创建vEL0-NXR。该病毒指导从α0 cDNA合成野生型ICP0。通过Southern blot分析验证了vEL0-NXRα0位点的序列安排，并恢复了编码野生型酸性ICP0-NH的DNA2通过PCR和循环测序确认终点（数据未显示）。对该重组体在低MOI感染中的生长分析表明，该病毒在感染后10和24小时产生了野生型病毒（数据未显示）。因此，vEL0-N/X的生长缺陷仅因ICP0 aa 3至104的缺失而产生。
为了进一步解决vEL0-N/X的生长缺陷，进行了Western blot分析，以确定感染细胞中ICP0-N/X丰度（图。). 在感染vEL0-N/X的细胞中，ICP0-N/X累积到野生型水平（图。). 因此，vEL0-N/X的生长动力学延迟和病毒产量降低不能归因于该蛋白积累的缺陷。对HSV基因三个主要时间类别（α、β和γ）中每一个的代表性蛋白质丰度的后续分析表明，在感染vEL0-N/X的细胞中，必需的α调节蛋白ICP4积累到野生型水平。然而，ICP27和β/γ蛋白gB和VP5的丰度降低（图。). 这些发现与vEL0-N/X相对于野生型HSV-1和α0缺失病毒的中间生长缺陷一致数字图书馆1403，作为受感染细胞中ICP27、gB和VP5的水平数字图书馆1403低于感染vEL0-N/X的细胞（图。).
HSV-1特定蛋白在感染细胞中的积累。用指示的病毒以每个细胞1个FFU的MOI感染Vero细胞，并在感染后8小时制备感染的细胞提取物，如材料和方法中所述。使用小鼠单克隆抗体58S（抗ICP4）或兔多克隆抗体CLU7（抗ICP0）、CLU38（抗ICP27）、R69（抗gB）或NC-1（抗VP5），通过Western blot分析测定即刻早期蛋白ICP0、ICP4和ICP27以及早期蛋白gB和VP5的相对积累水平。二级抗体与辣根过氧化物酶结合，并用化学发光底物LumiGLO开发免疫印迹。ICP0标记为（•）。
如上所述，αTIF-AD与ICP0 aa 105至775（ICP0-TIF）的融合部分补偿了ICP0酸性NH的缺失2终端（图。和). 作为ICP0-TIF功能的另一种测量方法，由于ICP0-NH2-终端缺失病毒vEL0-N/X表现出较高的FFU/PFU比率（见下文）。与野生型HSV-1和vEL0-N/X相比，vEL0-TIF表现出中等的FFU/PFU比率（表). 因此，αTIF-AD可以部分补偿NH的缺失2转染细胞和感染细胞的末端（图。和; 表).
对感染细胞核中ICP0-N/X的分布模式的分析表明，它与野生型ICP0的分布模式不同（图。). 在低MOI下用野生型HSV-1或vEL0-N/X感染Vero细胞，并在感染后8 h用间接免疫荧光法检测ICP0，如材料和方法所述。与野生型ICP0积聚为大点状小体不同，ICP0-N/X的免疫荧光模式更精细地分散在感染细胞的细胞核中（图。). 接下来，我们询问ICP0-N/X的免疫荧光模式改变是否代表该蛋白的固有特性，或者是否是ICP0-N/X与受感染细胞蛋白之间蛋白-蛋白质相互作用改变的结果。为了解决这个问题，在没有其他病毒特异性蛋白的情况下，在转染的Vero细胞中测定了ICP0和ICP0-N/X的分布模式（图。). 在转染细胞中，ICP0定位于典型的圆环状结构，而ICP0-N/X更精细地分散在较小的核内小体中（图。C和D）。
感染和转染细胞中ICP0和ICP0-N/X的核内分布。Vero细胞感染野生型HSV-1菌株17（A）或α0突变型vEL0-N/X（B），或转染编码HSV-1 ICP0（C）、ICP0-N/X的质粒，或同时转染两种蛋白（E和F）。感染后7小时或转染后48小时，野生型ICP0和NH2-用兔多克隆抗体CLU7间接免疫荧光检测末端缺失突变型ICP0-N/X，CLU7识别HSV-1 ICP0（A到D）aa312到400之间的表位，亲和纯化的兔多克隆抗原α0-N18仅识别NH2-HSV-1 ICP0的末端18 aa酸，因此不能识别ICP0-N/X（E）或抗ICP0小鼠单克隆抗体H1083，后者可识别ICP0和ICP0-N/X（F）。面板E和F显示了相同的单元格字段。本分析中使用的二级抗体与异硫氰酸荧光素（A到E）或罗丹明（F）偶联。
ICP0-N/X是一种主要的负性蛋白。
带有α0基因有害突变的重组疱疹病毒的生长可以在L7细胞中得到补充(55)在其内源性启动子/调控序列的控制下表达ICP0。然而，vEL0-N/X在任一Vero上生长时均表现出小塑性表型（图。)或L7（未显示数据）单元格。这一发现表明，ICP0-N/X可能是野生型ICP0的主要负抑制剂。为了验证这一假设，对野生型HSV-1、vCPc0、vEL0-N/X、vELO-NXR和α0缺失病毒的FFU/PFU比率进行了研究数字图书馆在Vero和L7细胞上测定1403个。如这里所确定的，FFU/PFU比率是衡量病毒感染细胞并启动即时早期蛋白质合成的效率，与病毒完成裂解病毒生命周期的能力有关。α0突变病毒先前已被证明在非补体细胞系中具有高的FFU/PFU比率(61). 与这些发现一致，我们的分析表明ICP0缺失病毒数字图书馆1403在Vero细胞中具有非常高的FFU/PFU比率，在L7细胞中具有接近野生型的FFU/FFU比率（表). 然而，在Vero和L7细胞中，发现vEL0-N/X的FFU/PFU比率显著高于野生型HSV-1、vCPc0和修复的对照病毒vEL0-N/X（表). 这些数据表明ICP0-N/X呈显性阴性表型。
接下来，我们试图确定ICP0-N/X在瞬时表达分析中是否会作为ICP0-介导转录激活的主要负性抑制剂。Vero细胞与编码ICP0、ICP0-N/X或ICP0和ICP0-N/X的质粒共转染，并在HSV-1α4启动子的控制下与引导荧光素酶表达的报告质粒共同转染。与之前的结果一致，ICP0激活了报告基因表达，而ICP0-N/X在激活α基因启动子报告基因时效果较差（图。). ICP0和ICP0-N/X的共表达导致报告基因表达显著降低（图。). 这种效应不是由启动子竞争引起的，因为在转染等量（2μg）质粒的细胞中没有观察到竞争的证据，这些质粒指导野生型ICP0的表达（图。). 因此，ICP0-N/X是转染细胞中ICP0的主要阴性抑制剂。
ICP0-N/X对ICP0转录激活的影响。用指示野生型HSV-1 ICP0、ICP0-N/X或两者蛋白表达量的质粒和1μg pCPC-4P-LUC报告质粒共同转染Vero细胞。在转染后48小时制备总细胞提取物，并按照材料和方法中的描述量化荧光素酶活性（相对光单位[RLUs]）。仅显示报告质粒转染的细胞（−）。数据表示三个独立实验的平均值，每个实验一式四份。
为了进一步表征ICP0-N/X相对于ICP0的优势，我们检测了转染和感染Vero细胞中这两种蛋白的免疫荧光模式（图。). 与野生型ICP0不同，后者位于转染细胞细胞核中的大型离散点状结构中（图。C） ，ICP0-N/X显示出非均匀的微粒分布（图。D） ●●●●。Vero细胞与指导ICP0和ICP0-N/X表达的构建物共转染，随后用单克隆抗体H1083对这两种蛋白进行免疫检测，表明ICP0-N/X改变了ICP0的免疫荧光模式，因为没有观察到大的离散核结构（图。F） ●●●●。用亲和纯化的多克隆抗体对这些细胞进行染色，该抗体仅识别ICP0的aa 1至18（α0-N18），证实ICP0的模式在ICP0-N/X存在下发生了改变（比较图。C和E）。
先前的证据表明，ICP0在转染和感染细胞中形成寡聚体(5,42). 因此，含有突变型和野生型ICP0的低聚物的形成可以解释ICP0-N/X的优势。该假设得到ICP0中至少存在一个齐聚结构域的支持(10,42,67)我们观察到ICP0-N/X似乎改变了野生型ICP0的核内分布（图。). 因此，我们确定野生型ICP0和ICP0-N/X是否在感染细胞中形成异齐聚体（图。). 在MOI为5时，Vero细胞被野生型HSV-1、vEL0-N/X或这两种病毒感染。在感染后7 h，制备裂解物，用识别两种蛋白（CLU7）或仅识别ICP0（α0-N18）的抗体免疫沉淀ICP0和ICP0-N/X，并使用兔多克隆抗体CLU7对免疫沉淀进行Western blot分析。正如预测的那样，α0-N18抗体仅免疫沉淀野生型ICP0，因为该抗体无法识别不含野生型ICPO的细胞提取物中的ICP0-N/X（因为相互作用的表位被删除）（图。). 然而，抗体α0-N18从含有ICP0和ICP0-N/X的感染细胞裂解物中免疫沉淀ICP0-N/X（图。). 这些数据表明，ICP0-N/X与野生型ICP0齐聚，并且ICP0-NH的缺失2末端不影响蛋白质的齐聚。这一发现进一步证明了ICP0在感染细胞中形成低聚物，并支持ICP0功能依赖于裂解生命周期中的低聚物的结论。
ICP0和ICP0-N/X的共免疫沉淀。Vero细胞在每细胞5 FFU的MOI下感染野生型HSV-1、vEL0-N/X或两种病毒。在感染后7小时，制备细胞裂解物，并如材料和方法中所述进行蛋白质免疫沉淀。在这些免疫沉淀中使用的抗体（Ab）是兔多克隆抗体CLU7和亲和纯化的兔多克隆抗体α0-N18，前者识别ICP0的aa 312和400之间的表位，后者仅识别NH2-野生型ICP0的端子18 aa。使用CLU7通过Western blotting检测ICP0和ICP0-N/X。IgG，免疫球蛋白G。
讨论
ICP0是一种即时早期病毒调节蛋白，在HSV-1生命周期中作为基因表达的混杂激活剂发挥作用(4,6,7,15,17,19). 该报告揭示了酸性NH的作用2激活HSV-1α基因启动子基因表达的ICP0末端。这里的数据还表明ICP0具有多个转录激活域。他们还证明了NH2-末端缺失突变体ICP0-N/X是ICP0激活功能的显性负性抑制剂，这种显性是由异源寡聚物的形成引起的。这些数据支持ICP0在感染细胞中作为低聚物发挥作用的前提。
ICP0功能的机制仍不明确。然而，最近的数据表明，它在转录水平上起作用(32). ICP0似乎不具有任何序列特异性DNA结合活性，因此不太可能识别病毒基因调控序列中的特定元素。然而，ICP0确实有可能充当辅活化剂或适配器(1)通过与其他序列特异性DNA结合蛋白和/或基础转录机制的普遍组成部分相互作用。ICP0与主要HSV-1调节蛋白ICP4相互作用并协同作用，以介导病毒基因表达的激活(6,7,15,17,19,46,67,69).
ICP0突变体的瞬时表达分析表明，羧基末端包含转录激活域(4,6,7,15,17,19). 然而，由于主要ICP0寡聚结构域靠近羧基末端，因此推测ICP0这一区域内的突变可能通过改变蛋白质寡聚和/或与另一蛋白质相互作用的能力而导致报告基因表达缺失(42). 破坏ICP0三维结构或其细胞内定位的突变也可能导致ICP0功能丧失。为了排除这些可能性，我们进行了实验，以确定ICP0中能够激活基因表达的区域酿酒酵母.
这些研究表明，酸性NH2ICP0的末端可以作为转录激活域。我们的结果是通过使用含有NH的蛋白质产生的2ICP0末端融合到GAL4-BD或细菌LexA蛋白和含有适当靶启动子的酵母菌株。因此，我们的发现不太可能代表由人工转录激活物的生成或特定启动子上下文的使用导致的伪影。此外，含有ICP0 NH的融合蛋白的过度生产2-终端区域导致静噪(25)（数据未显示），该发现与使用其他转录激活物获得的数据一致（参考文献25以及其中的参考）。
这里采用的识别ICP0中转录激活域的方法并非没有并发症。例如，许多含有ICP0羧基末端的GAL4-BD–ICP0融合蛋白未能在酵母中积累到可检测的水平。另一个复杂因素是，与DNA结合域融合可能会改变ICP0的结构，使其失活。当我们试图对哺乳动物细胞进行类似实验时，这种可能性变得明显。GAL4-BD–ICP0融合蛋白均不能激活含有GAL4 DNA结合位点的靶启动子。第三个并发症是，尽管GAL4-BD中存在功能性核定位信号，但含有aa 1至105或1至212的ICP0融合蛋白未能定位到细胞核。这种异常定位可以解释这些蛋白质无法激活哺乳动物细胞中G5-TK启动子的转录（图。).
虽然上述数据表明酸性NH的作用2ICP0在转录激活中的末端，他们也强调了研究融合蛋白的潜在缺陷。因此，我们删除了NH2ICP0的末端，并在瞬时表达分析和病毒基因组的背景下测试这种变化对蛋白质的影响。我们的研究结果表明，该结构域特异性地增强了ICP0对即刻早期病毒基因启动子的激活。这种影响不是由于ICP0-N/X的积累减少所致（图。)它也不是由ICP0-N/X的总结构改变引起的，因为它引导了HSV-1 TK和gC启动子报告基因表达的野生型水平（图。).
假设NH的酸性2末端负责激活，我们询问αTIF-AD是否可以在功能上替代ICP0的这个域。我们的结果表明，αTIF-AD可以替代ICP0 NH2末端，因为ICP0-TIF融合蛋白将本研究中检测到的所有HSV-1α基因启动子激活至接近野生型水平，并且表达该融合蛋白的病毒以近野生型动力学复制（图。和). 活化的恢复不仅仅是由于αTIF-AD的额外氨基酸的存在，因为它是一种含有氨基酸761至861的填充肽大肠杆菌β-半乳糖苷酶不能恢复活性。总的来说，这些数据支持以下结论。（i） NH2ICP0的末端是一个转录激活域。（ii）ICP0包含多个转录激活域，因为ICP0-N/X激活至少一个β和一个γHSV-1启动子，但四个α启动子的转录激活存在缺陷。（iii）酸性NH2ICP0末端以启动子特异的方式参与转录激活。
解决ICP0 NH的作用2在病毒生命周期的末端，产生了一种指导ICP0-N/X合成的重组疱疹病毒。该病毒表现出缺乏功能性ICP0的其他突变病毒的生长缺陷特征。具体而言，vEL0-N/X在Vero细胞单层中形成小斑块，表现出MOI依赖性生长，并且具有较高的FFU/PFU比率。然而，这些缺陷没有α0缺失病毒严重数字图书馆vEL0-N/X的生长和复制缺陷不是由ICP0-N/X丰度低引起的，因为该蛋白在感染细胞中积累到野生型水平（图。)尽管这种ICP0突变形式的核内定位经常是异常的。ICP0和ICP0-N/X之间的显著差异在于这两种蛋白的分布模式：ICP0-NX蛋白在转染和感染细胞的细胞核内的分布更为分散。
α0突变病毒的生长和复制缺陷，如数字图书馆1403，在L7细胞中补充(55). 然而，与数字图书馆1403和其他几个α0突变体(38)，vEL0-N/X在L7细胞中表现出小塑性表型和高FFU/PFU比率（图。和表). 这些数据表明ICP0-N/X是一个显性阴性突变，以下观察结果支持了这一结论：（i）在瞬时表达分析中，ICP0-N/X抑制野生型ICP0激活报告基因表达（图。)和（ii）ICP0-N/X改变了野生型ICP0的核内定位（图。). 这两种蛋白质之间形成异寡聚体可能导致观察到的效应。在与HSV-1菌株17和vEL0-N/X共同感染的细胞中，这两种蛋白都用识别ICP0但不能结合ICP0-N/X的抗体进行免疫沉淀（图。). 在共转染实验中也获得了这一结果（数据未显示）。这些数据提供了第一个明确的证据，表明（i）ICP0寡聚化不需要其他病毒特异性蛋白，（ii）ICP0在感染细胞中起寡聚体的作用。
本文给出的结果定义了酸性NH2-ICP0的末端区域作为转录激活结构域。他们还建议ICP0必须包含其他转录激活域。我们的发现并没有定义ICP0是直接还是间接激活转录。然而，观察到ICP0与细胞周期蛋白D3的活性相互作用和/或改变其活性(33)，eEF1Bα(32)，一种依赖DNA的蛋白激酶(35)和泛素特异性蛋白酶(21)可能表明ICP0间接激活转录。我们的结果表明，ICP0也可以通过酸性转录激活域影响转录。该激活结构域的功能不是多余的，因为其缺失引起的缺陷没有被该蛋白中的其他反式激活结构域补偿。未来的实验将需要更精细地绘制该激活域，并确定ICP0中的其他反式激活域，以及将ICP0引入基因调控区域或以其他方式使其发挥激活剂作用的因素。
确认
这项研究得到了公共卫生服务局对索尔·西尔弗斯坦（Saul J.Silverstein）的AI-33952拨款的支持。
参考文献
1Barlev N，Candau R，Wang L，Darpino P，Silverman N，Berger S L.假定转录适配器ADA2与酸性激活域和TATA-结合蛋白的物理相互作用的表征。生物化学杂志。1995;270:19337–19344.[公共医学][谷歌学者] 2Bohenzky R A，Papavassiliou A G，Gelman I H，Silverstein S。在重复序列中识别一个启动子映射，该序列侧翼1型单纯疱疹病毒L（左）区域。《维罗尔杂志》。1993;67:632–642. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 3Brasier A R，Tate J E，Habener J F。萤火虫荧光素酶检测作为哺乳动物细胞系报告基因的优化使用。生物技术。1989;7:1116–1122.[公共医学][谷歌学者] 4Cai W，Schaffer P A.1型单纯疱疹病毒ICP0在病毒DNA转染后感染病毒的从头合成中起着关键作用。《维罗尔杂志》。1989;63:4579–4589. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5Chen J，Panagiotids C，Silverstein S.单纯疱疹病毒即刻早期蛋白ICP0的多重化。《维罗尔杂志》。1992;66:5598–5602. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6Chen J，Silverstein S.单纯疱疹病毒编码ICP0基因突变，基因表达缺陷。《维罗尔杂志》。1992;66:2916–2927. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Chen J，Zhu X，Silverstein S.单纯疱疹病毒1型ICP0编码序列的突变分析。病毒学。1991;180:207–220.[公共医学][谷歌学者] 8Chevray P M，Nathans D。酵母中蛋白质相互作用克隆：鉴定与6月亮氨酸拉链反应的哺乳动物蛋白质。美国国家科学院程序。1992;89:5789–5793. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 9Chien C T，Bartel P L，Sternglanz R，Fields S。双杂交系统：识别和克隆与感兴趣蛋白质相互作用的蛋白质基因的方法。美国国家科学院程序。1991;88:9578–9582. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 10Ciufo D M，Mullen M A，Hayward G S.单纯疱疹病毒IE110反式激活蛋白C末端段二聚化结构域的鉴定。《维罗尔杂志》。1994;68:3267–3282. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11DeLuca N A，McCarthy A M，Schaffer P A。编码即时早期调节蛋白ICP4基因中单纯疱疹病毒1型缺失突变体的分离和鉴定。《维罗尔杂志》。1985;56:558–570. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 12Dixon R F，Schaffer P A.编码单纯疱疹病毒1型即刻早期蛋白VP175的基因中温度敏感突变体的精细结构映射和功能分析。《维罗尔杂志》。1980;36:189–203. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 13DuBridge R B，Tang P，Hsia H C，Phaik-Mooi L，Miller J H，Calos M P。使用Epstein-Barr病毒穿梭系统分析人类细胞的突变。分子细胞生物学。1987;7：379–387。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 14Everett R、O'Hare P、O'Rourke D、Barlow P、Orr A。单纯疱疹病毒1型Vmw110环指螺旋的点突变影响基因表达的激活、病毒生长以及与含有PML的核结构的相互作用。《维罗尔杂志》。1995;69:7339–7344. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Everett R D.分析1型单纯疱疹病毒即刻早期多肽Vmw110的功能域。分子生物学杂志。1988;202:87–96.[公共医学][谷歌学者] 16Everett R D.在即刻早期基因1中具有明确病变的单纯疱疹病毒1型突变体的构建和表征。维罗尔将军。1989;70:1185–1202.[公共医学][谷歌学者] 17Everett R D.对VMW110的详细突变分析，VMW110是一种由1型单纯疱疹病毒编码的反式转录激活物。EMBO J。1987;6:2069–2076. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18Everett R D.单纯疱疹病毒1型（HSV-1）即刻早期基因1、2和3的产物可以激活HSV-1基因的反式表达。维罗尔将军。1986;67：2507–2513。[公共医学][谷歌学者] 19Everett R D.疱疹病毒产物转录的反激活：两种HSV-1早期多肽的最大活性要求。EMBO J。1984;三:3135–3141. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20Everett R D、Barlow P、Milner A、Luisi B、Orr A、Hope G、Lyon D。C中锌结合残基和二级结构的新排列三碳氢化合物4α疱疹病毒蛋白家族的基序。分子生物学杂志。1993;234:1038–1047.[公共医学][谷歌学者] 21Everett R D、Meredith M、Orr A、Cross A、Kathoria M、Parkinson J。一种新型泛素特异性蛋白酶与PML结构域动态关联，并与疱疹病毒调节蛋白结合。EMBO J。1997;16:566–577. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 22Gelman I H，Silverstein S.单纯疱疹病毒基因表达的协调调控是通过两个即时早期基因产物的功能相互作用介导的。分子生物学杂志。1986;191:395–409.[公共医学][谷歌学者] 23Gelman I H，Silverstein S.单纯疱疹病毒直接早期启动子对病毒和细胞有反应反式-影响因素。《维罗尔杂志》。1987;61:2286–2296. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Gelman I H，Silverstein S.从单纯疱疹病毒中鉴定反式激活病毒胸苷激酶基因的即时早期基因。美国国家科学院程序。1985;82:5265–5269. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25Gill G，Ptashne M.转录激活物GAL4的负作用。自然。1988;344:721–724.[公共医学][谷歌学者] 26Goldin A、Sandri-Goldin R、Levine M、Glorioso J.代表整个基因组的单纯疱疹病毒1型序列的克隆。《维罗尔杂志》。1981;38:50–58. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Guthrie C、Fink G。酵母遗传学和分子生物学指南。第194卷。加州帕萨迪纳：学术出版社。；1991[谷歌学者] 28Hardy W R，Sandri-Goldin R M.单纯疱疹病毒抑制宿主细胞剪接，这种作用需要调节蛋白ICP27。《维罗尔杂志》。1994;68:7790–7799. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 29Harper J，Adami G，Wei N，Keyomarsi K，Elledge S。p21 Cdk相互作用蛋白Cip1是G1细胞周期素依赖激酶的有效抑制剂。单元格。1993;75:805–816.[公共医学][谷歌学者] 30Honess R W，Roizman B.疱疹病毒大分子合成的调控。I.三组病毒蛋白合成的级联调节。《维罗尔杂志》。1974;14：8–19。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 31Honess R W，Roizman B.疱疹病毒大分子合成的调节：多肽合成的顺序转换需要功能性病毒多肽。美国国家科学院程序。1975;72：1276–1280。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 32Jordan R，Schaffer P.单纯疱疹病毒1型ICP0在mRNA合成水平激活基因表达。《维罗尔杂志》。1997;71:6850–6862. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 33Kawaguchi Y、Van Sant C、Roizman B.单纯疱疹病毒1α调节蛋白ICP0与细胞周期调节蛋白cyclin D3相互作用并使其稳定。《维罗尔杂志》。1997;71:7328–7336. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 34Laemmli UK K.噬菌体T4头部组装期间结构蛋白的裂解。自然。1970;227:680–685.[公共医学][谷歌学者] 35Lees-Miller S、Long M、Kilvert M、Lam V、Rice S、Spencer C。单纯疱疹病毒1型转录因子ICP0对DNA依赖性蛋白激酶活性及其催化亚单位的减弱。《维罗尔杂志》。1996;70:7471–7477. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 36Leopardi R，Michael N，Roizman B.单纯疱疹病毒1型α4基因在病毒基因组范围内被其基因产物（ICP4）抑制是由ICP4 DNA结合位点相对于TATA盒的距离和立体轴比对决定的。《维罗尔杂志》。1995;69:3042–3048. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 37Lium E K，Panagiotids C A，Wen X，Silverstein S J.生产性单纯疱疹病毒感染期间ICP4抑制α0基因。《维罗尔杂志》。1996;70:3488–3496. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 38Lium E K，Silverstein S J.1型单纯疱疹病毒ICP0 C的突变分析三碳氢化合物4锌无名指揭示了必需α27基因表达中对ICP0的需求。《维罗尔杂志》。1997;71:8602–8614. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 39Marsh J L，Erfle M，Wykes E J。具有多克隆位点的pIC质粒和噬菌体载体，用于通过插入灭活进行重组选择。基因。1984;32:481–485.[公共医学][谷歌学者] 40McCarthy A M、McMahan L、Schaffer P A。单纯疱疹病毒1型ICP27缺失突变体的转录模式发生改变，并且DNA缺失。《维罗尔杂志》。1989;63:18–27. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 41McMahan L，Schaffer P A.抑制和增强单纯疱疹病毒调节蛋白ICP27的功能映射到C末端区域，需要在感染早期调节病毒基因表达。《维罗尔杂志》。1990;64:3471–3485. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 42Meredith M，Orr A，Elliott M，Everett R.分离HSV-1 Vmw110多重聚合的序列要求以及与135-kDa细胞蛋白的相互作用。病毒学。1995;209:174–187.[公共医学][谷歌学者] 43Mullen M，Ciufo D，Hayward G.单纯疱疹病毒的IE110和IE175核转录激活蛋白之间的胞内定位域映射和共定位相互作用的证据。《维罗尔杂志》。1994;68:3250–3266. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 44O'Hare P，Hayward G S.三反式-单纯疱疹病毒的作用调节蛋白在涉及正反馈和负反馈调节的途径中调节即时早期基因表达。《维罗尔杂志》。1985;56:723–733. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 45Panagiotidis C A，Huang S C，Canellakis E S。S20和L34核糖体蛋白表达和多胺生物合成的关系大肠杆菌.国际生物化学与细胞生物学杂志。1995;27:157–168.[公共医学][谷歌学者] 46Panagiotids C A，Lium E K，Silverstein S J.单纯疱疹病毒即刻早期蛋白ICP4和ICP27之间的物理和功能相互作用。《维罗尔杂志》。1997;71:1547–1557. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 47Phelan A、Carmo-Fonseca M、McLauchlan J、Lamond A I、Clements J B。一种1型单纯疱疹病毒早期基因产物IE63调节小核核糖核蛋白分布。美国国家科学院程序。1993;90:9056–9060. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 48Preston C M.控制感染野生型病毒或温度敏感突变株的细胞中单纯疱疹病毒1型mRNA的合成ts秒英国。《维罗尔杂志》。1979;29：275–284。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 49Ptashne M.真核转录激活剂是如何工作的。自然。1988;335:683–689.[公共医学][谷歌学者] 50Resnick J，Boyd B A，Haffey M L.单纯疱疹病毒1型ICP4蛋白的DNA结合对于有效下调ICP0启动子是必要的。《维罗尔杂志》。1989;63:2497–2503. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 51Rice S A，Knipe D M.单纯疱疹病毒1型α蛋白ICP27的基因特异性反式激活。《维罗尔杂志》。1988;62:3814–3823. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 52Roberts M S、Boundy A、O’Hare P、Pizzorno M C、Ciufo D M、Hayward G S。单纯疱疹病毒1型IE175（α4）启动子帽位点负性自身调节反应元件与IE175蛋白特异结合位点之间的直接相关性。《维罗尔杂志》。1988;62:4307–4320. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 53罗兹曼B、西尔斯A。人类疱疹病毒。纽约，N.Y:Raven Press；1993[谷歌学者] 54Sacks W R、Greene C C、Aschman D P、Schaffer P A。单纯疱疹病毒1型ICP27是一种重要的调节蛋白。《维罗尔杂志》。1985;55:796–805. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 55Samaniego L，Wu N，DeLuca N A.单纯疱疹病毒即刻早期蛋白ICP0影响病毒基因组的转录，以及在没有ICP4和ICP27的情况下感染细胞的存活。《维罗尔杂志》。1997;71:4614–4625. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 56Samaniego L A，Webb A L，DeLuca N A。感染期间单纯疱疹病毒即刻早期蛋白之间的功能性相互作用：ICP27和ICP4不同域导致的基因表达。《维罗尔杂志》。1995;69:5705–5715. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 57Sandri-Goldin R M，Mendoza G E。一种疱疹病毒调节蛋白似乎通过影响mRNA处理而在转录后发挥作用。基因发育。1992;6:848–863.[公共医学][谷歌学者] 58Showalter S D、Zwieg M、Hampar B。针对单纯疱疹病毒1型蛋白（包括即时早期蛋白ICP4）的单克隆抗体。感染免疫。1981;34:684–692. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 59Smiley J.单纯疱疹病毒胸苷激酶缺失缺失突变体的体外构建和拯救。自然。1980;285:333–335.[公共医学][谷歌学者] 60Soliman T、Sandri-Goldin R、Silverstein S.在细胞核和细胞质之间穿梭单纯疱疹病毒1型调节蛋白ICP27可调节晚期蛋白的表达。《维罗尔杂志》。1997;71:9188–9197. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 61Stow N D，Stow E C.一种单纯疱疹病毒1型突变株的分离和鉴定，该突变株在编码立即早期多肽Vmw110的基因中含有缺失。维罗尔将军。1986;67：2571–2585。[公共医学][谷歌学者] 62Towbin H，Staehelin T，Gordon J.蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶到硝化纤维素片的电泳转移：程序和一些应用。美国国家科学院程序。1979;76:4350–4354. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 63van Zonneveld A J，Curriden S A，Luskutoff D J。1型纤溶酶原激活物抑制剂基因：功能分析及其启动子的糖皮质激素调节。美国国家科学院程序。1988;85:5525–5529. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 64Watson R J，Clements J B.早期和晚期病毒RNA合成持续需要的单纯疱疹1型功能。自然。1980;285:329–330.[公共医学][谷歌学者] 65Wigler M、Pellicer A、Silverstein S、Axel R、Urlaub G、Chasin L.DNA A介导的腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因座向哺乳动物细胞的转移。美国国家科学院程序。1979;76:1373–1376. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 66Wilcox K W，Kohn A，Sklyanskaya E，Roizman B.单纯疱疹病毒磷酸蛋白。磷酸能使某些病毒多肽循环，并能改变其对DNA的亲和力。《维罗尔杂志》。1980;33：167–182。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 67Yao F，Schaffer P A.单纯疱疹病毒1型即时早期调节蛋白ICP0和ICP4之间的物理相互作用。《维罗尔杂志》。1994;68:8158–8168. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 68朱X，陈J，Silverstein S.从1型单纯疱疹病毒中分离并鉴定编码ICP0的功能性cDNA。《维罗尔杂志》。1991;65:957–960. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 69Zhu Z，Cai W，Schaffer P A.单纯疱疹病毒1型早期调节蛋白之间的合作性：ICP4和ICP27影响ICP0的细胞内定位。《维罗尔杂志》。1994;68:3027–3040. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
