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《维罗尔杂志》。1998年10月；72(10): 7772–7784.
数字对象标识：10.1128/jvi.72.10.7772-7784.1998年
预防性维修识别码：PMC110087型
PMID：9733813

免疫激活对人免疫缺陷病毒复制动力学和病毒准种分布的影响

马里奥·奥斯特罗斯基,1,* 大卫·克拉考尔,2 李月霞,1 肖恩·J·正义,1 杰拉尔德·利恩,三 琳达·A·埃勒,1 谢里林·斯坦利,1 马丁·诺瓦克,2和安东尼·S·福奇1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

人体免疫缺陷病毒（HIV）感染者体内的病毒复制由血浆病毒血症的稳定水平决定，反映了病毒和宿主因素的复杂平衡。我们之前已经证明，用常见的召回抗原破伤风类毒素对HIV感染者进行免疫会破坏这种稳定状态，导致免疫后出现短暂的血浆病毒血症爆发。本研究确定了免疫激活后病毒血症短暂爆发的病毒遗传基础。破伤风免疫与血浆病毒准种组成的剧烈且通常可逆的变化有关。大多数病例中的病毒爆发反映了由于易感CD4池扩大而导致的病毒复制的非特异性增加+T细胞。例外情况是，一名患者携带不同取向的病毒（合胞体诱导型和非合胞体诱发型[NSI]）。在这种情况下，免疫似乎选择了NSI病毒的复制。在三名患者中的一名患者中，数据表明免疫激活导致血浆中出现由潜在感染细胞诱导的病毒。这些发现说明了抗原刺激可能影响HIV复制动力学的某些机制，包括不同病毒变体的相对表达。

调节人体免疫缺陷病毒（HIV）体内复制的致病机制是多因素和复杂的(27). 原发性HIV感染后，大多数患者在4个月至1年内血浆病毒血症达到稳定水平，这被称为病毒设定点(39,40,46). 然而，HIV复制是一个动态过程，据报道，病毒在血浆中的半衰期约为5.7小时(44). 据推测，血浆中约99%的病毒来自最近感染的CD4+寿命约为2.2天的T细胞(36,44,52). HIV 1型（HIV-1）复制受病毒和宿主因素的影响(26). 维持患者体内复制的病毒特征包括复制适应性、对突变的偏好和细胞嗜性(26). 可诱导或抑制病毒复制的重要宿主因子包括HIV特异性免疫反应、细胞激活以及内源性细胞因子和趋化因子的影响(26). 因此，血浆病毒血症反映的病毒复制净水平是多种力量复杂平衡的结果。然而，驱动HIV-1在个体患者体内复制的主要影响尚未完全阐明。

细胞激活增强HIV-1复制(三,8,54). 我们和其他人已经报道了由外源刺激（如接种疫苗或复合感染）引起的免疫激活会导致血浆病毒血症的大量增加(7,9,32,35,42,48,49). 在这方面，用召回抗原破伤风类毒素对艾滋病毒感染者进行免疫接种，在6周内引起血浆病毒血症的短暂爆发(48). 血浆中病毒爆发的机制尚不明确，但可能是由于活化CD4易感池中的短暂增加所致+T细胞和/或分泌能够诱导已感染细胞表达HIV的促炎细胞因子(12).

本研究调查了免疫激活后病毒血症短暂爆发的病毒遗传基础。我们询问，由激活刺激引起的稳态血浆病毒血症的扰动，如用共同回忆抗原免疫，是否也反映在病毒准种相对外观的变化中。我们还考虑了两个假设：（i）病毒爆发反映了选择性偏爱的病毒亚群的增加，或（ii）病毒爆发反应了由于易感CD4池的增加而导致的病毒复制的非特异性增加+T细胞。此外，我们探讨了免疫后潜伏病毒的诱导在血浆病毒准种扰动中的作用。

材料和方法

患者和样本。

这项研究是根据国家过敏和传染病研究所机构审查委员会批准的临床方案进行的。所有患者均为无症状HIV-1感染者，未接受抗逆转录病毒药物治疗。简言之，参与者要么接受0.5毫升破伤风增强剂肌肉注射（患者2至4名）（宾夕法尼亚州马里埃塔Wyeth-Ayerst实验室），要么接受模拟免疫（患者1）。注射当天抽血，之后在6周内至少取样6次。患者2在免疫前后进行了一系列淋巴结活检。值得注意的是，本报告中的患者2和3分别对应于之前报告中的病人3和4(48).

病毒分离、血浆病毒血症定量和单核细胞前病毒。

血液收集在EDTA抗凝管中（加州山景城Becton-Dickinson），并在采样后2小时内进行处理。外周血单个核细胞（PBMC）通过标准Ficoll离心（LSM；Organon Teknika，Durham，N.C.）获得。样本为CD8+T细胞珠耗尽（纽约州成功湖Dynal），每毫升培养10 U白细胞介素-2（德国曼海姆Boehringer-Mannheim）。如前所述，对培养物进行4周的逆转录酶（RT）活性监测(48). 分离出的病毒诱导合胞体的能力是通过将100%50%组织培养感染剂量的分离物与106如上所述的MT-2电池(4). 如前所述，通过定量竞争性逆转录-PCR测定血浆HIV-1 RNA水平(48). 使用SK38和SK39引物，通过半定量PCR检测前体负荷，以扩增前体负荷堵住如前所述的区域(48).

DNA制备、cDNA合成和PCR。

使用Puregene DNA分离试剂盒（Gentra Systems，Minneapolis，Minn.）从PBMC中制备DNA。使用QIAamp HCV试剂盒从500μl血浆中提取RNA。RNA与无RNase DNAse（德国曼海姆Boehringer-Mannheim）在37°C下在DNAse反应缓冲液（50 mmol Tris-Cl[pH7.5]/升，10 mmol MgCl）中培养20分钟（1 U RNA样品/μl）2/升，40 U RNasin（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）。然后将样品在80°C下培养10分钟，以终止反应。cDNA合成的总体积为20μl，其中包括7μl RNA样本、40 U禽成髓细胞病病毒（AMV）RT（生命科学，佛罗里达州圣彼得堡）、40 U RNasin、最终浓度为1 mM的脱氧核苷三磷酸和外反义引物（ED12）在AMV RT缓冲液中终浓度为1.5μM时（终浓度为25mM Tris-HCl，pH 8.3，50mM KCl，2.0mM二硫苏糖醇，5.0mM MgCl2)，在42°C下孵育45分钟，然后在70°C下培养10分钟。

DNA和cDNA通过限制稀释的巢式PCR扩增，从而可以扩增DNA或cDNA的单拷贝。第一轮引物为ED5（5′-ATGGATCAAAGCCTAAGCCATGTG-3′，核苷酸6556至6581，HIV-1 HXB2）和ED12（5′-AGTGCTTCGCTGCCCAAGAACCAGAGAGAGACAG-3′，核苷酸7822至7792，HIV-1HXB2）。如前所述，第二轮反应使用1μl第一轮产物作为模板和引物DR7（5′-TCAACTCAACTGCTGTTAAATGGCATTAGC-3′，核苷酸6989至7020，HIV-1 HXB2）和DR8（5′-CACTTCCAATTCCATGTCCCTCATCTCCTCC-3′，核苷酸7637至7667，HIV-1 HXB1）(18,19). 最终反应放大了约650 bp跨越HIV-1包膜表面蛋白C2至V5区域的产物。PCR和循环条件如前所述进行(19).

异源双链追踪分析（HTA）。

通过将DR7-DR8-衍生PCR产物在[α-32P] dTTP、33μmol每种脱氧核苷三磷酸、引物DR8和生物素化引物DR7。PCR后，标记的DNA与涂有链霉亲和素的磁珠结合（纽约州成功湖Dynal）。清洗磁珠，并用8μl 0.1 N NaOH将标记的链分离10分钟。通过添加40μl H中和探针2O、 4μl 0.2 N HCl和1μl 1 M Tris-HCl（pH 7.4）。如上所述，通过cDNA或基因组DNA的嵌套PCR获得驱动序列。在低前病毒载量的PBMC样本中，在分析之前汇集多个独立的巢式PCR产物。将探针与驱动序列以1:100的比例混合在退火缓冲液（100 mM NaCl，10 mM Tris-HCl[pH7.8]，2 mM EDTA）中，在94°C下变性3 min，然后放置在冰上5 min，然后加热到55°C 5 min以形成异双工。将所得反应混合物在5%聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺/双丙烯酰胺比率，37.5:1）中在250 V下电泳3 h(19)用溴化乙锭染色以确保条带均匀迁移，干燥后在分子动力学磷成像仪中扫描（加州森尼维尔）。

排序。

根据制造商的规范，使用ABI PRISM染料终止剂法和DR7和DR8引物分别进行正向和反向反应，直接对PCR产物进行测序（加州福斯特市珀金-埃尔默）。在Applied Biosystems Inc.（加利福尼亚州福斯特市）373测序仪上进行了自动测序。序列编辑和组装是使用Sequencer 3.0版（基因编码公司，密歇根州安阿伯）进行的。

系统发育分析。

要查找序列根，请封装(环境价值)来自美国的五名患者的序列被用作外群，用于分析四名免疫患者（三名和一名对照）的包膜基因样本。使用Clustal W对齐序列(50)使用默认设置，并通过手动改进。使用MOLPHY进行系统发育重建(1)该算法首先基于邻接算法生成近似的系统发育，然后在最大似然模型下利用局部重排改进拓扑。最大似然算法使用HKY85核苷酸替换矩阵(34)并使用RELL程序计算局部重排的引导概率。使用DNADIST计算每个时间点血浆衍生序列之间的遗传距离(28)基于木村的双参数模型。计算每个时间点的所有成对距离的平均多样性。计算每个患者血浆中病毒随时间变化的C2至V5区域的遗传多样性。采用标准的多样性熵公式，其中多样性=(n个我/N个)∑ln(n个我/N个)，其中N个是一个比对序列中给定位置的核苷酸总数，以及n个我是核苷酸的比例我（i=A、C、T和G）。

结果

受试者的免疫接种。

表中总结了四名患者的临床和实验室概况​表1。1.图​图11显示了模拟免疫（1号）和免疫（2号至4号）患者的血浆病毒血症动力学。免疫接种后，2至4名患者的血浆病毒血症显著增加，比基线高7至14倍。CD4激活标记的表达+免疫后，从2至4名患者的PBMC中取样的T细胞（即HLA-DR和CD25）增加（数据未显示）。CD4上的激活标记没有显著变化+未经免疫、感染艾滋病毒的对照受试者的T细胞（数据未显示）。

表1

患者的基线特征

病人CD4细胞+T细胞计数/μl持续时间（年）HIV+病毒血症（RNA拷贝数/ml）前病毒负荷（DNA拷贝/106PBMC）病毒表型
140678,000ND（无损检测）一国家统计局
23508120,0001,000国家统计局
三53184,20010国家统计局
43899100,000360硅
一ND，未完成。 
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2至4名患者免疫后血浆病毒血症动力学。患者1接受模拟免疫。病毒RNA拷贝（10三/ml）血浆标记在纵坐标上，免疫后天数标记在横坐标上。在基线、病毒血症高峰和最后一次随访时获得血浆样本进行cDNA测序，并注明（↑）。在第0天患者2至4和第30天患者2获得PBMC样本进行前病毒测序（#）。显示患者2在免疫后第0天和第30天获得的用于前病毒测序的LNMC样本（*）。所有患者均无症状，未接受抗逆转录病毒药物治疗。

为了研究体内HIV序列群体，我们在限制稀释目标序列后，用敏感的巢式PCR方法扩增了病毒（cDNA）或前病毒的单分子(18,19,47). 然后直接对PCR产物进行测序。Simmonds等人之前已经验证了该方法(47)以研究患者样本中病毒变异的相对比例。在免疫日、病毒血症高峰期以及最后随访时血浆病毒血症水平恢复到基线水平时，从所有患者的血浆中获取HIV cDNA序列。在特定患者中，前病毒DNA主要由潜伏或非复制病毒组成(47)，我们感兴趣的是检查基线前病毒序列，以确定这些变异是否会从免疫激活中诱导。因此，在免疫日从患者2、3和4的PBMC中获得前病毒序列。在患者2免疫前后进行淋巴结活检，并在免疫当天和30天后测定这些样本的前病毒序列。在所有免疫患者的每个采样时间点，每个组织隔室（例如血浆与PBMC）至少获得20个序列。在一些患者中，对未稀释的cDNA或前病毒DNA进行嵌套PCR，并通过异源双链追踪分析（见下文）分析产物，以确认通过测序获得的病毒群的性质。

准物种分析。

在我们的系统发育树分析中，我们将一个种类群定义为至少由三个序列组成的拓扑簇，这些序列通常但并不总是具有超过90%的自举值。在所有情况下，患者体内不同的种类组对应着V3、V4和/或V5区域的氨基酸长度和/或组成的不同，这表明属于特定组的病毒在体内具有不同的表型。

从模拟免疫的患者1获得的血浆cDNA序列的系统发育重建如图所示。​图2，2，左。所有时间点血浆样本中的大多数病毒属于一个大组（a），少数病毒形成两个较小的簇（B和C）。少数序列不明显适合任何定义的亚组（标识为？）。在30天的时间里，未接受免疫接种的患者中主要变异的分布总体上是稳定的（图。​（图2，2A组病毒分别占模拟免疫后0、14和30天采样的血浆序列的62%、72%和77%。根据Fisher精确检验确定的时间点，A组频率的差异在统计学上不显著。序列分析未检测到14天时间点的B组序列。这很可能是因为在该患者中取样的序列较少（每个时间点<15个）。值得注意的是，使用来自变异体B和C序列的探针对从血浆cDNA样本中获得的PCR产物进行的HTA分析显示，在所有时间点都存在这些小群体（数据未显示）。

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（左）对患者1的所有序列（cDNA）的C2至V5区域进行系统发育分析。病毒序列根据采样时间和组织间隔用彩色符号表示。三组表示为A、B和C；未分类序列用？表示？。引导概率以百分比表示。*，由于删除了V3区域，该序列的分支长度人工较长。以下HIV原型环境价值B亚型菌株被用作外群：M79345型（源自一级隔离物），M96155型（来自隔离89.6），M89973型（YU-2），M65024型（HIVSFAAA），以及M60472米（ADA）。（右）序列血浆样本中患者1（模拟免疫）序列变异的检测频率。所有序列均来自RNA。

患者2共研究了130个序列；这些病毒包括来自血浆的cDNA（免疫后第0天、第8天和第7周）、来自PBMC的前病毒（免疫后0天和第30天）以及来自淋巴结单核细胞（LNMC）的前病毒。所有序列的比对显示，在研究的所有时间点，每个组织室中都存在两个不同的变异群体（A和B）（图。​（图3，三，左）。通过比较V4区域的氨基酸翻译，很容易区分这两个组（数据未显示）。免疫前，A组和B组在血浆中的相对频率与前病毒LNMC的相对频率显著不同（见图图例）。​图3，三（右）和PBMC(P（P）<0.01，Fisher精确测试）。A组占血浆序列的75%，但在前病毒PBMC和LNMC的序列中是少数群体（图。​（图3，三，右侧）。相反，B组包括PBMC和LNMC内的主要前病毒群，因此更可能是病毒存档群的反映(47,52). 在该患者中，A组可能代表了血浆中循环的较新进化的变体，尽管B组的病毒在免疫时也在血浆中积极复制和循环。在病毒血症高峰期（第8天），血浆中病毒群的相对比例发生逆转，以B组为主(P（P）<0.025，Fisher精确测试）。与A组相比，B组在免疫后血浆中增加了18倍。免疫后7周，当病毒血症接近基线值时，有恢复血浆病毒原始分布的趋势。所有序列中的V3环具有相当大的相似性，其嗜巨噬细胞（嗜M）模式与培养中分离的非同步诱导（NSI）病毒一致（数据未显示）。

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（左）患者2序列（cDNA和前病毒）的系统发育分析。血浆样本代表RNA序列，PBMC和LNMC样本代表前病毒。注意两个主要组，A和B，它们在所有采样的隔间和时间点中都可以找到。基线时，变异A在血浆中占优势，变异B在PBMC中占优势。（右）免疫前后血浆中RNA变体和PBMC前病毒变体的频率分布。为了进行比较，未说明LNMC和PBMC在第30天的前向分布，但如下所示：第30天PBMC，A组，35%，B组，65%；第0天LNMC，A组35%，B组65%；第30天，LNMC组A为45%，组B为55%。

患者3是一名进展缓慢的患者，其病毒系统发育树要复杂得多（图。​（图4，4，左），包括六个可区分的组（任意称为A到F）。在PBMC前叶室中确定了至少五组（A、B、C、D和F）以及不明显适合任何组的序列（图。​（图4，4，右侧）。血浆中未发现22%的前病毒PBMC序列，可能是潜伏感染细胞中的存档病毒（F组和？组）。由于血浆中也检测到A、B、C和D组，这些前病毒序列也可能有助于病毒的主动复制。在免疫时，可以在血浆中识别出五组，其中B组和C组占主导地位。尽管C组变异减少，D组变异在病毒血症高峰期扩大，但免疫前和病毒血症高峰时血浆中变异的组成有些相似。然而，到了第42天，准种组成发生了巨大变化，其中第21天流通的80%的病毒变体（B、D和E组）被a和C组替换。为了确认患者3中的准种转移，我们在免疫后的多个时间点对来自血浆和PBMC的未稀释样品的PCR产物进行了HTA。我们选择使用B组和D组病毒制成的探针进行HTA，因为这些变体在第21天包含70%的病毒，而在第42天没有发现。由具有代表性的B组和D组序列制成的探针可以区分从其他组获得的序列（图。​（图5a）。5a） ●●●●。然后在第0天、第21天和第42天，使用这些探针对抗来自PBMC（前病毒DNA）和血浆（cDNA）的未稀释样品的PCR产物（图。​（图5b）。5b） ●●●●。通过HTA，从第42天起，在血浆中未发现B组和D组病毒，如在这些时间点异质双体迁移较慢所示（图。​（图5），5)从而证实了我们的序列分析。有趣的是，在第42天取样的PBMC中观察到变异体D的信号强度降低，表明该变异体早期从PBMC室清除。

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（左）患者3序列（cDNA和前病毒）的系统发育分析。主要类群表示为A到F。（右）患者3的血浆和PBMC免疫前和免疫后血浆中病毒变体的频率分布。

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（a） 从患者3获得的病毒序列（C2到V5）的HTA。参照系统发育树，从B组或D组中选择一个具有代表性的序列作为探针来检测其他变体。来自B组或D组序列的探针能够很容易地将同一组（B或D）的序列与来自同一患者不同组或不相关样本（U通道）的序列进行区分。实验重复了三次，对探针和面板使用不同的代表性序列，结果相似。*，探测车道；箭头所示，同双工迁移的位置。（b） HTA显示，破伤风免疫对患者3中病毒准种转换的影响。为了确定B组和D组的周转率，使用上述探针进行了HTA。对于血浆样本，使用大约100份HIV-1 RNA模板扩增的RT PCR产物作为驱动因子。对于PBMC样本，使用从约40份HIV-1基因组DNA扩增的PCR产物作为驱动因子。箭头，同双工迁移的位置。

从患者4获得的序列的系统发育重建显示存在两个主要变体，A和B（图。​（图6，6，左）。A组和B组在V3区有明显区别：A组共识的V3环为CTRPNNNTRRGIHIGPSAFYATGDIIGDIRQAHC；B组共识V3回路为CTRPSINKRRHIHIGIGPGRAFYATDITGDIRQAHC。B变异体的V3环不同于A变异体（位于V3区5′侧半胱氨酸的5、6、8、11、18、24和27位），因为B组中带正电荷的氨基酸数量更多，并且失去了潜在的N-连接糖基化位点（位置6）。以前的研究表明，这些变化与NSI包膜向合胞体诱导（SI）病毒包膜的转变是一致的(11,21,23,31). 通过PBMC培养证实患者4中存在SI病毒（表​（表1）。1). 第0天从血浆中获得的一个序列是两种变体的重组体，包括一个a V3区域和一个B V4/V5区域（未显示数据和图。​图6，6，左）。在免疫接种之前，患者4的血浆中变异体A和B的分布大致相同（图。​（图6，6，右侧）。在病毒血症高峰期（第21天），变异体A（NSI）占病毒的95%(P（P）<0.005，Fisher精确测试）。到第41天，随着血浆病毒血症恢复到基线水平，观察到病毒的原始分布。通过从绝对血浆病毒水平推断（图。​（图1），1)NSI变异在免疫后增加了13倍，而SI变异基本上保持不变。值得注意的是，变异体B（SI）病毒在前叶PBMC室中所占比例最大。

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（左）患者4序列的系统发育分析。确定了两个主要群体，A和B。*，a组和B组的重组体。（右）a组和B组在免疫前和免疫后血浆和PBMC中的频率分布。

我们没有观察到任何受试患者在免疫过程中出现新的变异群。我们也没有观察到基线时培养出NSI病毒的患者（患者1、2和3）出现SI-型包膜。

多样性分析。

血浆样本中的平均病毒种群多样性没有随时间变化的一致趋势（图。​（图7）；7); 然而，在三名免疫患者中，有两名患者出现了可逆性变化。例如，在患者2中，病毒多样性在病毒血症高峰时显著增加（第0天为3.1%，第8天为3.5%），而在患者4中，病毒多样化在病毒血症峰值时下降（第0天为3.3%，第21天为2.1%）。这些多样性模式也反映在系统发育树的拓扑结构中。在患者2中，B组病毒在病毒血症高峰时占优势，其分支长度比A组病毒长，因此反映了此时血浆病毒群的平均多样性。在患者4中，在病毒血症高峰时，单个组占血浆病毒群的大多数，这是第21天多样性下降的原因。

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患者1至4血浆病毒序列随时间的平均多样性。误差条表示平均值的标准误差。

为了确定负责样本内平均多样性总体变化的包膜区域，对样本内所有序列的核苷酸位置绘制了熵图。患者1和患者3的包膜上没有特定区域明确解释了平均多样性的大多数变化。在患者2中，病毒血症高峰时的多样性增加是由于V4区域的变化（数据未显示）。有趣的是，在患者4中，病毒血症高峰时出现的多样性下降局限于V3区域（图。​（图8）8)反映了SI变异的减少。

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沿线的多样性环境价值随着时间的推移，患者4。熵（纵坐标）是相对于核苷酸位置绘制的。

同义和非同义替换的累积率。

通过分析同义（保留氨基酸）和非同义（改变氨基酸）核苷酸替代模式，确定免疫过程中HIV-1准种的选择压力(41). 每个同义位点核苷酸替换的平均数，d日秒和每个非同义词站点，d日n个对于在每个时间点采样的序列中的所有成对比较，都进行了确定。因此，所有的比较都是样本内序列与来自同一样本的一致序列的比较。一般来说d日n个/d日秒比率<1意味着复制适合度的净化选择占主导地位，而d日n个/d日秒比率>1意味着对氨基酸多样性的强烈正向选择，这可能是由免疫系统或特定靶细胞的可用性强加的(37).

1号未接受免疫接种的患者透露d日n个/d日秒表明在可变位置没有选择（中性）的比率（图。​（图9）。9). 在患者2中，d日n个/d日秒血浆和淋巴结各时间点的比率与整个免疫过程中的净化选择模式一致。患者3显示出与模拟免疫患者1相似的模式。最有趣的发现是4号患者，他们同时感染了NSI和SI病毒。免疫前和最后随访时，当病毒血症处于稳定状态时，d日n个/d日秒比值>1，表明氨基酸变化具有较强的正选择性。在病毒血症高峰期d日n个/d日秒比率接近于一，这意味着可变位点的中性漂移，并表明在免疫前失去了驱动非沉默突变固定的选择压力。我们考虑了高d日n个/d日秒在第0天和第42天观察到的比率是样品中存在嗜T病毒（SI）的结果。以前曾有人假设，SI病毒在特定患者中可能比NSI病毒承受更大的免疫压力，因此SI病毒的非同义替代率更高(6). 然而，通过比较d日n个和d日秒从该患者的所有时间点获得的所有嗜M型（A组）和嗜T型变体（B组）之间的值显示d日n个/d日秒与中性演变一致的比率（图。​（图9）。9). 因此d日n个/d日秒从基线和最后随访中获得的血浆序列中观察到的比率并不是样本中存在SI病毒的唯一结果，而是反映了所分析序列的某些子集中的选择。

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破伤风免疫对同义词的影响(d日秒)和非同义词(d日n个)替代率。样品内部d日秒和d日n个患者1至4的数值。重要d日n个/d日秒比率偏离中性，即。，d日n个/d日秒<1或>1被定义为带有误差条的曲线图，这些误差条明显偏离x=y行。

讨论

本研究描述了三名HIV感染患者在接种共同回忆抗原后的病毒序列变异和进化关系。抗原特异性免疫激活诱导宿主发生变化，其特征是抗原反应细胞的增殖、细胞因子的产生以及随后旁观者细胞的增殖(10,33,51). 这种免疫激活状态导致可用活化CD4数量的增加+作为HIV易感目标的T细胞。我们通过搜索不断增长的病毒群中的任何系统趋势，对这一假设进行了一些详细的测试。我们询问免疫是否暂时影响了血浆病毒的来源（系统发育分析）、病毒多样性（多样性图）、选择压力(d日秒/d日n个)，以及沿环境价值序列（熵）。

一个共同的特征是，免疫激活刺激引起的血浆病毒血症的扰动与免疫受试者血浆中可检测到的病毒准种相对优势的显著扰动一致。虽然未经免疫的患者（1号）随着时间的推移，血浆病毒的微小变异发生了变化，但这种变化并不像在免疫患者中看到的那样剧烈。模拟免疫受试者（患者1）中主要准种变异体的相对稳定性以及患者2和4血浆准种转移的瞬态和明显可逆性的综合观察强烈表明，免疫实际上影响了我们患者中的准种分布。患者3中观察到的准物种变化值得注意。我们能够使用HTA确认，在病毒血症高峰期（第21天）出现的80%的病毒变体在第42天从血浆中清除。鉴于我们目前对病毒周转的理解，这种在3周内清除变体的速度并不令人惊讶(36,44,52).

我们询问免疫激活是否为某些病毒变体提供了复制优势。在大多数情况下，我们无法展示出一致的选择模式。我们无法证明多样性的持续变化，也无法证明d日n个/d日秒随着逃逸突变体的出现，比率可能会增加。没有常见的氨基酸替代环境价值可以解释病毒血症的增加。对此的一个可能解释是，在免疫期间CD4的一个亚群+细胞被激活，从这些细胞中释放的病毒被放大，与它们所含的病毒基因型无关。这导致了变异分布的改变，但没有任何选择的证据，并提出了这样的观点，即感染期间观察到的多样性波动的变化可归因于CD4上的各种选择压力+T细胞本身，而不是它们所携带的特定病毒。例如，免疫将激活破伤风特异性CD4+T细胞和常驻病毒会意外地扩增。这一想法最近得到了Cheynier等人的支持(13)世卫组织在猕猴模型中证明，卡介苗免疫接种后猴免疫缺陷病毒准种的动态反映了在循环卡介苗特异性CD4中发现的病毒+T细胞。

然而，如患者4所示，在那些携带不同取向变种的患者中，可能存在特定的病毒选择。免疫前，血浆中循环的NSI和SI病毒比例相等，而免疫后，病毒血症的爆发是由于NSI病毒的扩张所致。这是一个意外的发现，因为SI病毒在组织培养中的复制程度通常高于NSI病毒(4). 在该患者中，免疫后V3区域的多样性暂时下降。观察到的非同义替换率较高(d日n个/d日秒免疫前和最后随访（第42天）的血浆中>1）表明，在病毒血症爆发期间，可能在基线时驱动新突变体固定的选择压力有所缓解。这些发现表明，在免疫之前，强烈的选择压力同时作用于NSI和SI病毒，并且新的活化CD4群体的突然出现+免疫后的T细胞使NSI人群无限制地扩大。为什么NSI病毒在免疫激活环境中比SI病毒具有明显的复制优势，目前尚不清楚。在急性HIV感染期间，最初感染SI和NSI混合病毒的患者也出现了类似的情况，随后发现仅携带NSI菌株(17). NSI病毒表型与巨噬细胞嗜性和CCR5 HIV辅助受体的使用有关，而SI表型与T细胞嗜性和CXCR4 HIV辅助受体的使用有关(2,14,16,22,24,25,29,45). 已经证明，激活的CD4上CCR5表达显著上调，CXCR4表达下调+T细胞(5,43). 这一观察结果证实了破伤风免疫瞬时增加活化CD4库的可能性+表达CCR5和很少或没有CXCR4的T细胞，因此有利于仅使用CCR5作为共受体的病毒的复制，即嗜中性（NSI）病毒。尽管没有材料可用于研究患者4的共受体表达，但我们随后观察到，在接种破伤风疫苗后，HIV感染者和健康志愿者的CCR5表达和CXCR4表达都有适度的短暂增加和减少（数据未显示）。此外，为了进一步解决这个问题，我们目前正在确定患者4中获得的包膜变异体的确切共受体用法。目前还不清楚NSI和SI菌株使用的其他共受体在免疫激活设置中的作用(2,14,20,24,29,38).

我们询问了潜伏病毒在免疫后诱导的病毒血症中起到了什么作用。Simmonds等人的研究(47)和Wei等人(52)已证明PBMC中前病毒DNA的周转滞后于血浆cDNA的周转，PBMC中的大多数前病毒DNA反映了以前在血浆中出现的存档或潜伏病毒。同样重要的是要认识到淋巴结内的前病毒来源包括潜在感染的CD4+T细胞、长寿巨噬细胞和树突状细胞，它们都可能被诱导产生病毒(15,36). 在本报告中描述的三名免疫患者中，患者2和4在PBMC（患者2中的LNMC）前病毒样本中表现出准种分布，很容易与血浆中的分布区分开来，从而证实了先前的发现(47). 在患者3中，少数前病毒变异体（～20%）可与血浆中的变异体区分开来。如果免疫激活确实在很大程度上重新激活了潜伏感染的细胞，那么人们可能会在免疫后检测到血浆中主要的前病毒PBMC变体。事实上，患者2的情况就是这样，在病毒血症高峰期，前病毒PBMC（和LNMC）室中的主要变异（B）成为血浆中的主要变体。患者2的基线前体负荷较高（表​（表1）1)可能为前病毒重新激活提供了更大的机会，并显著促进了血浆中病毒的积极复制。患者3或患者4均未观察到这种准物种转移模式；因此，在这两名患者中，血浆中预先存在的主要变异在免疫后扩大，这表明，免疫激活导致的血浆病毒血症的短暂增加只是加速了一个过程，而这个过程已经是血浆病毒的主要来源，而不是从一个病毒复制源转移到另一个。

这些观察结果可能与HIV疾病的发病机制有相当大的相关性。我们的观察证实了HIV在体内复制的动态性质(36,44,52). 在大多数情况下，免疫激活似乎能非特异性地扩增不同基因型的病毒，这可能是体内观察到的巨大多样性的原因之一。例外情况可能是携带不同热带病毒的患者；免疫激活倾向于NSI表型病毒而非SI株的观察结果，可能部分解释了HIV早期观察到的SI株的缺乏。最后，在某些情况下，如免疫激活，潜伏感染的细胞可能会导致血浆病毒血症，这一事实特别令人感兴趣，因为最近的观察表明，静止的潜伏感染CD4的稳定贮存库+在血浆病毒血症被高活性抗逆转录病毒治疗降低到可检测水平以下的患者中，可诱导表达具有复制能力的病毒的T细胞在较长时间内持续存在(15,30,53).

鸣谢

我们感谢Tae-Wook Chun、Susan Moir、Lin Qi Zhang、Raj Shankarappa和Jim Arthos的有益讨论。我们感谢MaryBeth Daucher和Colombe Chappey在DNA测序方面的帮助。我们还感谢四位患者为本研究付出的时间和努力。

这项工作得到了美国国立卫生研究院对G.L.的资助（A132885和A127757）。

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文章来自病毒学杂志由以下人员提供美国微生物学会（ASM）