Characterization of and Functional Antigen Presentation by Central Nervous System Mononuclear Cells from Mice Infected with Theiler’s Murine Encephalomyelitis Virus

Jonathan G. Pope; Carol L. Vanderlugt; Sandra M. Rahbe; Howard L. Lipton; Stephen D. Miller

doi:10.1128/jvi.72.10.7762-7771.1998

《维罗尔杂志》。1998年10月；72(10): 7762–7771.

数字对象标识：10.1128/jvi.72.10.7762-7771.1998年

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PMID：9733812

泰勒氏鼠脑脊髓炎病毒感染小鼠中枢神经系统单核细胞的特征及功能性抗原的表达

乔纳森·波普,¹ 卡罗尔·范德卢格特,¹ 桑德拉·拉赫贝,¹ 霍华德·利普顿,²和斯蒂芬·D·米勒^1,^*

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摘要

我们检测了持续感染泰勒氏鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）小鼠中枢神经系统（CNS）浸润细胞的表型和功能，以证明CNS内的T细胞存在病毒抗原。主要组织相容性复合体（MHC）Ⅱ类在TMEV感染小鼠脊髓中的表达主要见于脱髓鞘病变中的巨噬细胞。I-A分布^秒流式细胞术显示，冷冻切片中巨噬细胞标记物sialadhesin的染色与另一巨噬细胞/小胶质细胞标记物F4/80的染色重叠。相反，通过胶质纤维酸性蛋白染色鉴定的星形胶质细胞很少表达可检测到的MHC II类，尽管可以清楚地看到与中枢神经系统损伤相关的纤维胶质增生。共刺激分子B7-1和B7-2在中枢神经系统大多数MHCⅡ类阳性细胞的表面表达，其水平超过了感染小鼠脾脏中的水平。免疫组织化学显示B7-1和B7-2共定位在大的F4/80上⁺脊髓损伤中的巨噬细胞/小胶质细胞。相反，CD4⁺皮损中的T细胞主要表达B7-2，主要在胚泡CD4上发现⁺T细胞位于病变周围。最有趣的是，从TMEV感染小鼠脊髓中新分离出的黏附细胞能够处理TMEV和马肌红蛋白，并将其呈现给抗原特异性T细胞系。此外，这些细胞能够在没有添加抗原的情况下激活TMEV表位特异性T细胞系，为持续感染SJL/J小鼠的CNS内病毒表位的内源性加工和呈现提供了确凿证据。

Theiler氏鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）是一种小核糖核酸病毒，当将其脑内接种到易感小鼠株中时，可诱导终身持续的中枢神经系统（CNS）感染，导致慢性CNS脱髓鞘病。受感染的小鼠出现步态障碍、痉挛性后肢麻痹和尿失禁的进行性症状(39)组织学上与脊髓内血管周围和实质单核细胞浸润和白质束脱髓鞘有关(8,9,38). 一些证据表明脱髓鞘是免疫介导的。这些包括环磷酰胺的非特异性免疫抑制能力(37)，抗胸腺细胞血清(36)和抗CD4或抗主要组织相容性复合物（MHC）II类单克隆抗体（MAb）(14,16,63)抑制或预防疾病，以及TMEV特异性耐受性预防疾病诱导的能力(28). 在高度敏感的SJL/J小鼠株中，目前的证据表明髓鞘损伤是由TMEV特异性CD4启动的⁺靶向病毒抗原的T细胞(16,28,45,46,54)而疾病的慢性阶段也涉及CD4⁺髓鞘表位特异性T细胞通过表位扩散引发(48). 因此，免疫反应本身可能对CNS功能有害，例如人类多发性硬化症（MS），TMEV感染就是一个模型。

中枢神经系统中负责启动和维持免疫反应的细胞的身份仍有争议。中枢神经系统缺乏正常的淋巴循环和组织，并被一个专门的连续血管内皮细胞与全身循环隔离(6). 中枢神经系统内有特殊的细胞，有可能向T细胞提供抗原。体外，星形胶质细胞(11,59)和小胶质细胞(三,13)特别是当用γ-干扰素（IFN-γ）治疗时，能够表达MHC II类并向T细胞提呈抗原。然而，这类研究依赖于从新生儿或胚胎脑中分离和持续培养细胞的能力，并假设这些细胞是体内成年人群的代表。由于直接从成年大鼠分离的小胶质细胞在体外向T细胞系表达髓鞘碱性蛋白（MBP）的能力与新生源性小胶质细胞不同，因此，长期培养的新生细胞的抗原提呈可能无法忠实地再现成年动物体内的状态(12). 此外，利用小鼠或大鼠品系间异基因骨髓嵌合体进行的研究普遍支持以下观点：造血来源的细胞，即小胶质细胞和巨噬细胞，是实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）发病期间中枢神经系统中活跃的主要抗原提呈细胞（APC）(20,22,50). 尽管星形胶质细胞比小胶质细胞丰富得多，但在嵌合体中诱导EAE时，星形胶质细胞的作用较弱(50).

在TMEV诱导的脱髓鞘过程中，抗原提呈在中枢神经系统中的作用尚未直接解决。我们之前的研究表明，相对较大比例的CD4⁺，但不是CD8⁺来自TMEV感染小鼠脊髓的T细胞表达高亲和力白细胞介素-2（IL-2）受体（IL-2R），这是最近T细胞激活的标志。此外，TMEV特异性CD4⁺在TMEV感染小鼠的脊髓浸润中可以显示T细胞(54). 这一发现增加了T细胞在靶组织内局部活化并直接参与疾病发病机制的可能性。巨噬细胞(5,41,56)，星形胶质细胞(7,56)和少突胶质细胞(55,56)在TMEV感染的小鼠中含有病毒，可以想象可以向致病性CD4呈递病毒抗原⁺中枢神经系统内的T细胞。分离的小胶质细胞(34)和星形胶质细胞(17)已证明在体外支持持续的病毒感染，并且来自新生小鼠的星形胶质细胞已被证明在体外向T细胞呈现TMEV(2). 为了检测中枢神经系统细胞是否存在病毒抗原并参与TMEV诱导脱髓鞘的发病机制，详细检测了MHCⅡ类和B7共刺激分子的表达。根据我们之前的结果显示，CD4的大部分⁺从TMEV感染小鼠的中枢神经系统分离的T细胞具有最近激活的标记，我们还询问从TMEV-感染小鼠的CNS分离的单核细胞是否能够呈现病毒抗原，从而在体外激活Th1细胞系的功能。

材料和方法

老鼠。

从Jackson实验室（缅因州巴尔港）购买6至7周龄雌性SJL/J小鼠。根据机构指南，将小鼠随意放在标准实验室食物和水上。

抗体。

抗B7-1（克隆16.10.A1）和抗B7-2（克隆1G10）由芝加哥大学杰弗里·布鲁斯通提供，或从法明根（加利福尼亚州圣地亚哥）购买。抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）（克隆G-A-5）购自印第安纳州印第安纳波利斯市博林格·曼海姆。针对巨噬细胞标记物F4/80的单克隆抗体和唾液粘附素（克隆3d6.112）分别购自Caltag（加利福尼亚州南旧金山）和Serotec（印第安纳波利斯市Harlan Bioproducts for Science）。抗-I-A^秒（克隆MKS4）通过使用蛋白质G-Sepharose柱（皮尔斯化学公司，伊利诺伊州罗克福德）从培养上清液中纯化。Avidin-R–藻红蛋白（A-PE）是从分子探针（俄勒冈州尤金）获得的。与异硫氰酸荧光素（FITC）、PE或生物素结合的特异性无关的同位素对照品购自Pharmingen。对于流式细胞术，使用SJL/J脾细胞悬液滴定所有抗体。针对大鼠免疫球蛋白G（IgG）和与生物素或FITC结合的小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3的免疫组织学第二抗体购自Caltag。未结合、纯化的小鼠骨髓瘤蛋白（IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3）购自Serotec（Harlan）。

肽。

VP2_74–86利用RaMPS多肽合成系统（NEN-Dupont，Wilmington，Del.）合成了与VP2病毒衣壳蛋白区域相对应的肽（QEAFSHIRIPLPH）。西北大学生物技术中心确认了氨基酸组成。

病毒。

TMEV的BeAn 8386菌株是一种组织培养适应性菌株，已在Dulbecco改良Eagle’s培养基（DMEM）中生长的BHK-21细胞中进行菌斑纯化和传代(40). 通过聚乙二醇沉淀BHK-21细胞总裂解物、在十二烷基硫酸钠存在下进行超声波处理以及在连续蔗糖和CsSO上离心，纯化病毒的工作库存₄梯度。

病毒接种和疾病评分。

用甲氧基氟烷（Pitman-Moore，Mundelein，Ill.）麻醉小鼠，并在右侧大脑半球用2.9×10孵育⁶30μl DMEM中TMEV的PFU。每周对小鼠进行两到三次检查，以确定是否出现慢性步态异常和表明脱髓鞘的痉挛性瘫痪(35). 临床疾病终点是严重脱髓鞘的可靠标志(4). 7至9周龄受感染小鼠的发病率接近100%(58). 感染后约35天（p.i.），SJL/J小鼠出现摇摇晃晃的步态，但没有失去尾音。受影响小鼠的症状在接下来的4至8周内发展为后肢痉挛性瘫痪，最终出现尿失禁并完全瘫痪。按照三分制评分：0分（无症状）、1分（蹒跚步态）、2分（痉挛性瘫痪伴扶正障碍）和3分（尿失禁和/或完全瘫痪）。

复发诱导和评分（R-EAE）。

用肽（PLP）免疫雌性SJL/J小鼠（8-10周）_139–151)对应于蛋白脂质蛋白的主要致脑表位(43). 每只小鼠在剃光的侧腹三个部位皮下注射0.1 ml乳剂，其中含有50 nmol的PLP_139–151和200μg结核分枝杆菌H37Ra（密歇根州底特律迪夫科）。通常在免疫后10至14天观察到麻痹的初步临床症状。按照五分制评分：0分（无症状）、1分（尾音消失）、2分（共济失调步态）、3分（后肢无力）、4分（双侧后肢完全瘫痪）和5分（死亡）。

CNS浸润单核细胞和脾细胞的分离。

用甲氧基氟烷麻醉小鼠，然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）通过左心室灌注，直到排出物变清。通过用PBS冲洗椎管挤压脊髓，然后在PBS中冲洗。从同一只小鼠中取出脾脏，放置在PBS内。组织被强迫通过100目不锈钢滤网，形成单细胞悬浮液。在Tris-NH中通过低渗休克溶解脾细胞制剂中的红细胞₄Cl，然后将细胞清洗并重新悬浮在含有0.1%NaN的等渗缓冲盐水中_三（IBS；Baxter Diagnostics，Inc.，McGaw Park，Ill.）和1.0%正常山羊血清（NGS；Pel-Freez，Rogers，Ark.）。将脊髓匀浆重新悬浮在30%的Percoll（新泽西州皮斯卡塔韦市法玛西亚）中，分成管（相当于每管四到五根脊髓），下面垫上70%的Percol。梯度在500×克从30%/70%界面收集CNS单核细胞，清洗并在IBS-NGS中重新悬浮。

使用改良的程序从CNS中分离细胞，用于培养实验。除所有溶液和仪器始终保持无菌外，按上述方法取出脊髓。将脊髓置于补充有5%胎牛血清（2 mM）的DMEM中我-谷氨酰胺，每毫升100μg链霉素和每毫升100 U青霉素（DMEM-5；西格玛化学公司，密苏里州圣路易斯），每毫升含有300 U IV型梭状芽孢杆菌胶原酶（新泽西州弗里霍尔德市沃辛顿生物化学公司），并用消毒刀片或剪刀在10-cm直径的塑料培养皿中切碎（每皿10至15条脊髓）.在37°C下消化碎片，大约每30分钟研磨一次，持续2至3小时，直到完全均匀。以低速离心悬浮液，丢弃上清液，通过30%/70%非连续Percoll梯度离心分离单核细胞。为了去除和分离巨噬细胞和活化的小胶质细胞，将从梯度中回收的细胞重新悬浮在DMEM-5中，并允许其在37°C的湿CO中粘附在直径为10 cm的塑料组织培养皿上1-2小时₂孵化器。去除非粘附细胞，用温热培养基冲洗盘子。然后，通过刮除并用冷平衡盐溶液清洗盘子，去除粘附细胞。

流式细胞术。

待染色细胞在IBS-NGS中重新悬浮。对于抗B7-1和抗B7-2抗体，首先在正常小鼠血清和抗FcRgII/III（2.4G2）杂交瘤上清液中培养待染色细胞。电池（0.5×10⁶至1×10⁶)在4°C下与预定浓度的生物素化MAb孵育30分钟，在IBS-NGS中洗涤，在黑暗中与a-PE和适当的FITC-共轭MAb孵卵30分钟，再次洗涤，并重新悬浮在每毫升含有0.1μg碘化丙啶的1毫升IBS中。使用Cellquest软件在FACScan流式细胞仪（Becton Dickinson，Mountain View，Calif.）上进行数据收集和分析。非特异性染色是通过与A-PE单独或直接标记的同型匹配对照抗体孵育细胞来确定的。

组织的制备、储存和切片。

将小鼠麻醉并通过左心室灌注PBS。通过解剖取下脊髓，并立即将2-3mm的脊髓片冷冻在OCT（印第安纳州埃尔克哈特市迈尔斯实验室）的液氮冷却异戊烷浴中。这些块储存在塑料袋中，以防止在−80°C下脱水。切片（5μm）在安装在聚乙烯上的Reichert-Jung Cryoker 1800低温恒温器（莱卡仪器，伊利诺伊州迪尔菲尔德）上切割-我-赖氨酸或明胶涂布的载玻片，并风干。

免疫荧光。

所有步骤均在室温下进行。切片在丙酮中固定10分钟，并在PBS中重新水化。通过在5%NGS和0.2%鱼皮明胶（Sigma）PBS中孵育30至60分钟，阻断非特异性染色；在封闭溶液中稀释的初级抗体覆盖在载玻片上1～2h；将与生物素、FITC或德克萨斯红结合的二级抗体覆盖在载玻片上1小时。将获得生物素结合二级抗体的载玻片覆盖上亲和素-德克萨斯红或亲和素-FITC。在孵育期间，用PBS清洗载玻片三次5至10分钟。在Opti-Phot显微镜（纽约州梅尔维尔市尼康）上通过外荧光检查切片。

免疫组织化学。

切割切片，风干，并在−20°C的丙酮中固定。用生物素结合抗F4/80（Caltag）、抗CD4（L3T4）、抗B7-1（16-10A1）和/或抗B7-2（GL1）（Pharmingen）对载玻片进行染色。根据制造商的说明，使用NEN生命科学产品酪胺信号放大直接试剂盒对载玻片进行顺序染色。用Vectashield安装介质覆盖载玻片（Vector Laboratories，Burlingame，Califor.），并使用色度三频滤波器（chroma Technology Corp.，Brattleboro，Vt.）通过外荧光观察载玻片。

T细胞系的维护。

针对TMEV VP2的T细胞系sTV1_74–86，并且在补充有10%胎牛血清2 mM的DMEM中维持了一个马肌红蛋白（hMyo）特异性T细胞系我-谷氨酰胺、100μg/ml链霉素和100 U青霉素（DMEM-10；Sigma）。T细胞（4×10⁵)用辐照的（3000R）正常脾细胞（3×10）在2ml培养基中刺激⁶)和紫外线活化TMEV裂解物（50μl）或hMyo（5μM）。通过在Ficoll Histopaque（Pharmacia，Piscataway，N.J.）上以500×克和24°C持续15分钟。爆破（0.5×10⁶至1×10⁶)用人重组IL-2（10至20 U/ml）在24孔板中扩张5至7天，然后再重新刺激。

抗原呈递分析。

对分离的CNS浸润单核细胞的塑性粘附部分进行分析，以确定其刺激长期抗原特异性T细胞系的能力。粘附细胞（4×10^三至1×10⁵从患有TMEV感染或R-EAE的症状小鼠的脊髓中分离出），与（i）sTV1系（2×10⁴每孔），在存在或不存在紫外线活化TMEV（5μg/ml）或VP2的情况下_74–86肽（0.5μM）或（ii）hMyo特异性品系（2×10⁴每孔）。根据回收的细胞数量，使用重复或三次培养。在所有实验中，使用U形底部96周组织培养板以最大限度地接触细胞，并在培养基（DMEM-5）中添加氨基胍（1 mM）以抑制一氧化氮合成酶活性。增殖反应由[^三H] 在66小时培养期的最后24小时内，TdR（0.1μCi/孔）掺入。在96-well滤板（Uniplates；Packard Instrument Co.，Meriden，Conn.）上采集培养物用于液体闪烁计数，结果表示为每分钟计数的变化（Δcpm），计算如下：Δcpm=刺激培养物的平均cpm−对照培养物的均数cpm。

统计分析。

单尾学生分析了T细胞增殖的差异t吨假设方差相等进行测试。的值P（P）<0.05被认为具有统计学意义。

结果

在TMEV诱导的脱髓鞘疾病中，MHC II类主要由中枢神经系统浸润的巨噬细胞表达。

T细胞激活需要至少两个信号。第一种决定抗原特异性，并通过与适当MHC分子结合的肽复合物传递到T细胞受体。第二个或协同刺激信号与第一个协同，由APC上的许多分子之一发送到T细胞(24)其中最重要的似乎是由B7-1和B7-2介导的，这两种蛋白都能在T细胞上结合CD28和CTLA-4(26). 为了确定TMEV诱导脱髓鞘小鼠中枢神经系统中潜在的APC群体，我们首先确定哪些细胞（如果有）表达MHCⅡ类以及B7-1和/或B7-2。

在症状小鼠制备的TMEV感染脊髓冰冻切片中检测MHCⅡ类表达，并标记间接免疫荧光。在这些实验中，使用了巨噬细胞标志物唾液粘附素，因为它在正常CNS组织的小胶质细胞上不表达，除了在血脑屏障通透性的特殊部位(52). 因此，唾液粘附素的表达应能识别脱髓鞘病变中活化的巨噬细胞和小胶质细胞，但不标记正常、静止的小胶质细胞。抗涎腺粘附素强烈标记TMEV感染小鼠慢性脱髓鞘病变中的许多大细胞（图。（图1A）1A）但未标记相邻的未涉及区域。这些细胞显然构成了病变中MHCⅡ类阳性细胞的大多数，如图中的重叠染色所示。图1A。1A.这种分析无法可靠区分巨噬细胞和活化的小胶质细胞。正如预期的那样，唾液腺凝集素的表达（图。（图1C）1C）和MHC类别II的表达式（图。（图1E）1E）在正常SJL/J脊髓的白质中基本缺失。类似地，同种型匹配对照染色在TMEV感染小鼠的脐带中是最小的（图。（图1F）。1F）。

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图1

正常和TMEV感染的SJL/J脊髓中MHCⅡ类的表达。从TMEV感染的SJL/J小鼠（A和B）脊髓制备冰冻组织切片（5μm）。（A）用巨噬细胞标志物唾液粘附素（绿色）和I-A特异的单克隆抗体标记切片^秒（红色）。MHCⅡ类的表达与唾液粘附素的表达大致重叠（大箭头），但在病变边缘发现少量单独标记的MHCⅡ阳性细胞（开放箭头）。（B）切片用星形胶质细胞标记物GFAP（红色）和I-A标记^秒（绿色）。在大的分支细胞上很少观察到标记重叠（箭头所示）。还检查了正常脊髓的冰冻切片（6μm）（C至E）。在未感染小鼠的脊髓中，除脑膜和血管中的少数细胞外，唾液粘附素（C）和MHCⅡ类（E）均为阴性，而GFAP（D）显示星形胶质细胞突起的点状标记。用于I-A的小鼠IgG2b同型控制^秒（F） TMEV感染小鼠脊髓切片的浸润细胞和脑膜中的一些明亮细胞上显示出模糊的背景。放大倍数，×200。

MHC II类在星形胶质细胞上很少表达。

通过标记冰冻脊髓切片的GFAP和I-A来检测星形胶质细胞MHCⅡ类的表达^秒在正常脊髓白质中，GFAP的表达水平较低，染色了沿脊髓径向和纵向分布的星形胶质细胞的许多衰减细胞突起（图。（图1D）。1D） ●●●●。相反，在TMEV感染小鼠的脊髓中可以看到类似于纤维状星形胶质细胞增生症的大型肥大星形胶质细胞的染色，通常位于距离病灶较远的位置（图。（图1B）1B）许多类型的中枢神经系统损伤都有报道。在同一切片上标记MHCⅡ类和GFAP时，染色模式几乎没有重叠。偶尔可见GFAP和MHC II类双重阳性的细胞（每个检查切片<1个）（图。（图1B）。1B） ●●●●。共聚焦显微镜证实，细胞如图所示。图1B1B被双重标记，并排除切片不同平面上的两个细胞。在抗I-A的等型匹配抗体对照中观察到一些背景染色^秒（图。（图1F）；1F）；然而，GFAP/MHCⅡ类双阳性细胞的罕见性及其独特的形态证明了标记的真实性。总的来说，结果表明正常脊髓中的小胶质细胞和星形胶质细胞基本上不表达MHC II类，TMEV感染脊髓损伤内的巨噬细胞和小胶质细胞大量表达，而感染脊髓中的反应性星形胶质细胞很少表达(21).

CNS巨噬细胞和小胶质细胞MHC II类和B7共刺激分子表达的流式细胞术分析。

在感染TMEV 40天后，通过不连续Percoll梯度离心分离小鼠脊髓的单核细胞，并通过流式细胞术分析，以定量浸润巨噬细胞和活化小胶质细胞上MHCⅡ类和B7共刺激分子的表达水平。这些细胞被标记为MAb F4/80，它识别一种广泛表达的、功能未知的巨噬细胞谱系特异性标记物(53)，和带有抗I-A^秒在显微镜下，分离的巨噬细胞和小胶质细胞是大的、空泡状的、可塑性粘附细胞，很容易与淋巴细胞区分开来(5). 相应地设置了电子门，以将淋巴细胞排除在分析之外，并将重点放在具有更大尺寸和内部复杂性的细胞的特性上，即那些表现出更大正向和侧向散射的细胞。在40天p.i.时，70%的F4/80⁺从脊髓分离的单核细胞为MHCⅡ类⁺相反，大约80%的I-A^秒+细胞为F4/80⁺巨噬细胞和小胶质细胞（图。（图2D）。2D） ●●●●。相比之下，F4/80仅占30%⁺脾脏中的细胞为MHCⅡ类⁺和F4/80⁺细胞仅占I-A的4%^秒+人口（图。（图2B）。2B） ●●●●。众多F4/80⁻、I-A^秒+脾脏中的事件（可能代表B细胞）仅在TMEV感染小鼠的中枢神经系统中出现极少数（<总细胞的2%）（数据未显示）。

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图2

流式细胞术分析TMEV感染小鼠脊髓中巨噬细胞和小胶质细胞表达MHC II类、B7-1和B7-2。从每周40天感染TMEV的小鼠中分离出脾和CNS单核细胞，并用F4/80-PE、抗B7-1-生物素或抗B7-2-生物素染色，然后用抗i-A染色^秒-FITC或对照抗体、A-PE和碘化丙啶。大多数MHC II级⁺感染CNS的细胞为大F4/80⁺巨噬细胞和小胶质细胞（D组）。在脾脏中，MHC II类主要在F4/80上表达⁻细胞，其中大部分可能是B细胞（B组）。基本上所有MHC II类⁺感染CNS的细胞表达B7-1和/或B7-2（G组和H组）。大多数表达B7-1和B7-2的细胞也是MHC II类⁺.脾MHCⅡ类⁺细胞弱表达B7-1和B7-2（E组和F组）。在第23天p.i获得相同的结果。通过排除碘化丙啶收集活细胞的FACS数据。在分析过程中，通过电子门控技术排除淋巴细胞和髓鞘碎片。数字是每个象限中选通事件的百分比。

在许多实验系统中，包括R-EAE、自身免疫性糖尿病和同种异体移植排斥反应，B7分子在APC上传递的T细胞共刺激信号被认为是免疫反应的重要调节器(33,49). 因此，通过双色流式细胞术分析TMEV感染小鼠脊髓滤过性单核细胞来检测B7-1和B7-2的表达。分析显示，每次40天时，MHC II类表达与B7-1或B7-2基本一致（图。（图2G2G和H）。无法直接确定B7-1和B7-2群体是否重叠或互斥，但这两个标记的组合百分比等于100%以上，这意味着在I-A上同时表达^秒+细胞。因此，可以推断出大F4/80⁺TMEV感染小鼠中枢神经系统的细胞表达MHC II类和一个或两个B7分子。如前所述，受感染小鼠的脾脏中含有F4/80⁺MHCⅡ类阳性和阴性细胞。脾MHCⅡ类⁺细胞沿着从阳性到阴性的连续体表达B7-1（图。（图2E）2E）似乎是弱B7-2阳性（图。（图2F），2F）表达水平低于脊髓浸润。

其他实验（未显示）证实了这些结果，也表明感染后，表达B7-1和B7-2的巨噬细胞和小胶质细胞数量随着时间的推移而增加。此外，B7-1⁺根据百分比、平均荧光强度和每条脐带的数量等参数，巨噬细胞在63天时成为相对于B7-2的优势种群。如下文所述，B7-1表达增加可能与CNS损伤累积后表位扩散的开始有关，这在SJL/J小鼠复发性R-EAE中很明显(49). 有趣的是，我们最近发现髓磷脂特异性CD4⁺TMEV诱导脱髓鞘慢性期出现自身免疫反应(48)这种反应在时间上对应于病毒感染小鼠CNS巨噬细胞和小胶质细胞上B7-1表达增加的转变。

B7-1和B7-2在TMEV感染小鼠中枢神经系统的免疫组织化学定位。

通过免疫组织化学原位检测共刺激分子的表达，以了解这些细胞与TMEV感染脊髓损伤之间的关系。用冷PBS全身灌注处死45天的症状性SJL/J小鼠，解剖脊髓，冰冻切片（5～6μm）染色，检测B7-1和B7-2的表达，并结合CD4或F4/80。平行处理同型匹配抗体对照，未显示背景染色（未显示）。B7-1主要在大鼠F4/80上表达⁺占据病变中心的细胞（图。（图3A）。三A） ●●●●。细胞的外观与先前分析中看到的唾液粘附素阳性细胞的外观相同（图。（图1A）。1A） ●●●●。B7-1未与CD4共定位⁺T细胞（图。（图3B）。三B） ●●●●。相反，B7-2位于更广泛的细胞上，包括F4/80⁺巨噬细胞和小胶质细胞（图。（图3C）三C）和CD4亚群⁺T细胞，主要是较大的CD4⁺位于病变边缘的母细胞（图。（图3D）。三D） ●●●●。B7-1和B7-2染色的空间位置可能与共刺激分子表达相关的病变发展的时间进程有关，如下所述。总的来说，B7-1和B7-2染色的出现证实了我们的流式细胞术结果，并直接证明了这些共刺激分子与脱髓鞘病变内的巨噬细胞和T细胞的联系。

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图3

用免疫组织化学方法证明TMEV感染小鼠脊髓中的B7-1和B7-2。每次45天制备SJL/J脊髓冰冻切片（5至6μm），并依次对F4/80或CD4（绿色）进行染色，然后对B7-1或B7-2（红色）进行染色。B7-1（A）和B7-2（C）在大F4/80上共存⁺巨噬细胞和小胶质细胞，少数F4/80除外⁺病灶边缘的小胶质细胞（箭头所示）。B7-1和B7-2不与小CD4共定位⁺病变中心部分的T细胞（B和D，填充箭头），但是一个大的、爆炸样CD4亚群⁺病变边缘的T细胞表达B7-2（D，开放箭头）。

从慢性感染小鼠脊髓分离的单核细胞内源性呈现病毒抗原。

TMEV感染小鼠脊髓中大量巨噬细胞和小胶质细胞表达可检测到的MHC II类和共刺激分子，表明这些细胞可能是功能性APC。此外，我们以前曾报道过，通过Percoll密度梯度离心和玻璃贴壁分离的CNS单核细胞含有感染性病毒，证明病毒抗原存在于主要MHCⅡ类表达人群中(5,41). 因此，设计了直接测试CNS浸润巨噬细胞和小胶质细胞抗原提呈功能的实验。通过在37°C的塑料组织培养皿中粘附来富集脊髓滤过性单核细胞，并检查粘附细胞在体外激活长期TMEV特异性Th1细胞系的能力。TMEV特异性T细胞系sTV1来自TMEV诱导的SJL/J淋巴结细胞(16)并已被广泛描述。该细胞系对病毒衣壳蛋白VP2的氨基酸74至86具有特异性，VP2是SJL/J小鼠的免疫优势T细胞表位(15). 与其增强体内病毒特异性延迟型超敏反应（DTH）的功能能力一致(16)在体外用TMEV刺激24和48小时后取组织培养上清液，结果显示该细胞系为Th1细胞，即产生IL-2和IFN-γ，但不产生IL-4（数据未显示）。

从TMEV诱导脱髓鞘小鼠（平均得分1.7,83天p.i.）或R-EAE小鼠（平均分数1.7,29天免疫后）中分离出可塑性黏附脊髓滤核单核细胞。后者被用作对照，因为它们不能携带感染性TMEV或病毒抗原进入培养物，但在表型上与TMEV衍生的单核细胞性质相似。尽管在疾病发作后，为了优化细胞恢复，在稍晚的时候采集了CNS浸润细胞，但MHC II类和共刺激分子的表达与图中的表达没有显著差异。图11到到3。三如前所述，随着疾病的进展，B7-1表达相对于B7-2逐渐增加。辐照潜在APC并用于呈现TMEV（5μg/ml）或VP2_74–86（0.5μM）至sTV1 T细胞系。平行建立正常、经辐照的SJL/J脾脏APC的培养物。如图所示。图4，4，从患有R-EAE的小鼠脊髓中分离的单核细胞能够处理和呈递紫外线灭活的TMEV，并直接呈递VP2_74–86以剂量依赖性方式决定sTV1 Th1株，但在没有添加抗原的情况下未能激活病毒特异性T细胞株（这是从含有CNS衍生APCs的所有组中减去的背景值）。同样，从TMEV感染小鼠的脊髓分离出的TMEV脉冲单核细胞也刺激sTV1系的剂量依赖性增殖。最重要的是，来自病毒感染小鼠的CNS APC能够激活VP2_74–86-没有添加病毒或肽的特定Th1系。在本实验中，脾APC在呈现病毒或肽方面不如CNS衍生APC有效。因此，从R-EAE或TMEV诱导脱髓鞘小鼠脊髓中分离出的单核细胞可以在体外有效地处理病毒特异性T细胞系并将其提供抗原。这些结果表明，有大量经过处理的MHCⅡ类相关VP2_74–86近3个月前感染TMEV的SJL/J小鼠的CNS中回收的单核细胞中存在内源性肽，因为这些细胞能够在没有外源性添加病毒的情况下刺激T细胞增殖。

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图4

来自TMEV感染小鼠的CNS衍生单核细胞内源性向VP2表达病毒表位_74–86-特异性sTV1 T细胞系。从症状性TMEV感染的SJL/J小鼠制备CNS衍生的可塑性粘附单核细胞(n个=23，平均临床评分=1.7）或来自患有R-EAE的小鼠(n个=24，平均临床得分=1.7）。各种数字（4×10^三至2.5×10⁵)CNS APC群体中的⁴存在和不存在紫外线活化TMEV病毒（5μg/ml）或VP2的sTV1细胞_74–86（0.5μM）。培养物中含有[^三H] 42小时TdR，24小时后收获。对于CNS衍生的APC，减去的背景值是在无抗原的情况下从相同数量的R-EAE衍生的CNS APC培养物中获得的每分钟计数。

为了检测内源性刺激的特异性，用hMyo激发的SJL/J淋巴结细胞制备了一个长期T细胞系。B10.S小鼠T细胞对肌红蛋白反应的精细特异性(H-2型^秒)已经有了很好的特征(1). 在确认hMyo的特异性后，发现该株系分泌IFN-γ（2.8×10⁴刺激后72小时为±1500 pg/ml）和IL-2（72小时为4264±257 pg/ml。从TMEV感染小鼠（平均得分为1.9，80天p.i.）或R-EAE小鼠（平均分数为1.2，免疫后18天）的脊髓中制备可塑性粘附的浸润性单核细胞。R-EAE细胞再次提供了病毒阴性对照。对这些细胞进行辐照，并分别将TMEV（5μg/ml）或hMyo（10μM）呈现给sTV1或hMyo-specific T细胞系。在平行培养中测试正常、辐照、脾APC。在中枢神经系统衍生的APC的最佳浓度（4×10⁴/well）和脾脏APC（4×10⁵/井）如图所示。图5。5当用相关抗原进行脉冲处理时，受照射的脾APC诱导hMyo特异性Th1株（B组）和TMEV特异性sTV1株（D组）显著增殖。来自TMEV感染小鼠的hMyo脉冲CNS衍生单核细胞诱导hMyo特异性Th1细胞系（F组）显著增殖，但在没有添加hMyo的情况下未能激活这些细胞（E组）。类似地，来自R-EAE小鼠的CNS单核细胞在用TMEV刺激时刺激sTV1系的增殖（H组），但在没有添加抗原的情况下未能激活这些细胞（G组）。然而，来自TMEV感染小鼠的CNS单核细胞在添加TMEV的情况下激活了sTV1细胞（I组）和存在TMEV（J组）。hMyo T细胞系没有背景增殖，这证实了sTV1对TMEV感染小鼠脊髓单个核细胞的增殖是病毒特异性的，而不是这些APC传递的非特异性T细胞刺激的结果。

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图5

CNS浸润单核细胞对TMEV特异性（sTV1）和hMyo特异性T细胞系内源性抗原提呈的特异性。用TMEV小鼠制备的可塑性粘附CNS浸润单核细胞(n个=30，平均得分=1.9）和R-EAE(n个=29，平均得分=1.2）与sTV1或hMyo特异性Th1细胞（2×10⁴)分别使用紫外线激活的TMEV（BeAn；5μg/ml）或hMyo（10μM）。结果表示为无添加抗原（开放条）或有添加抗原（填充条）时每分钟的计数。应将来自TMEV感染小鼠的CNS-衍生APC培养物的反应与来自在没有TMEV的情况下培养的R-EAE-衍生CNS-APC培养液的反应进行比较（G组）。

讨论

在这项研究中，我们检测了感染TMEV的小鼠中枢神经系统浸润细胞的表型和功能，以证明病毒抗原存在于中枢神经系统内的T细胞。通过FACS和免疫组织化学，感染小鼠脊髓中MHCⅡ类的表达主要见于脱髓鞘病变中的巨噬细胞和小胶质细胞。此外，这些携带MHC II类的巨噬细胞表达B7-1和B7-2共刺激分子的水平超过了感染小鼠脾脏中发现的水平。免疫组织化学显示，B7-1主要表达于脊髓损伤的大细胞上，这些大细胞可能是浸润性巨噬细胞，而B7-2在F4/80上均表达⁺巨噬细胞、小胶质细胞和CD4亚群⁺T细胞。最有趣的是，塑料粘合剂F4/80⁺、I-A^秒+从TMEV感染小鼠脊髓新分离的细胞能够处理TMEV和hMyo并将其呈现给抗原特异性T细胞系，并激活TMEV VP2_74–86-没有添加抗原的特异性T细胞系。这一发现为持续感染SJL/J小鼠中枢神经系统内病毒表位的内源性加工和呈现提供了确凿证据。

与巨噬细胞和小胶质细胞相比，星形胶质细胞很少表达可检测到的MHC II类，尽管可以清楚地看到与中枢神经系统损伤相关的纤维性胶质增生（图。（图1B）。1B） ●●●●。星形胶质细胞是丰富的胶质细胞，对中枢神经系统损伤有反应。因此，重要的是I-A^秒一般来说，持续感染小鼠脊髓切片中的标记与GFAP的标记并不重叠。有充分证据表明，体外星形胶质细胞可以向T细胞提供包括髓鞘表位在内的抗原，特别是在通过IFN-γ治疗上调表面MHC表达后(51,59). Borrow和Nash(2)结果表明，经IFN-γ处理的培养的新生星形胶质细胞可在体外将TMEV呈递给抗原特异性T细胞。此外，来自不同品系小鼠的星形胶质细胞上调MHC II类表达的能力与其对TMEV诱导脱髓鞘的敏感性相关(2). 表面上，这些结果表明星形胶质细胞参与了脱髓鞘的诱导。然而，据报道，活化的星形胶质细胞在体外可抑制T细胞反应(42)，使用嵌合动物的研究表明，非造血细胞在诱导EAE方面效率很低(50). 相反，仅造血细胞之间的MHC兼容性就足以诱导EAE(20,22,50). 据报道，骨髓嵌合体动物中的小胶质细胞具有抗辐射性，并且被缓慢替换或根本不替换(20). 因此，在骨髓嵌合体动物中，小胶质细胞主要是受体H-2型型，提示即使小胶质细胞也可能不需要诱导EAE。我们的研究结果并没有直接涉及患有TMEV诱导的脱髓鞘疾病小鼠星形胶质细胞的抗原提呈功能。表达I-A的少数星形胶质细胞可能^秒是一个非常强大的APC群体，或者MHC II类的表达水平（低于免疫组织化学检测的极限）足以让星形胶质细胞参与体外抗原呈递研究所建议的CNS浸润性T细胞的活化(51,59).

虽然使用嵌合体动物的研究支持造血细胞（包括巨噬细胞和小胶质细胞）在EAE诱导中的重要性，但由于这两个群体的共同起源和相似的表型，很难区分这两个人群在中枢神经系统炎症中的作用。在正常和炎症CNS组织的小胶质细胞上发现了一系列巨噬细胞谱系标记物，包括F4/80、MOMA-2和Mac-1(53). 虽然这些在包括小胶质细胞在内的多种类型的巨噬细胞上都有发现(53)sialadhesin的表达仅限于通过血脑屏障受损而暴露于血清因子的浸润性巨噬细胞和小胶质细胞(52). 因此，在正常的中枢神经系统实质中，唾液粘附素区分了静止的小胶质细胞和巨噬细胞，而在炎症部位，一些小胶质细胞也可能被诱导表达唾液粘附素。我们的结果显示，MHCⅡ类主要在唾液粘附素阳性细胞上表达，因此，这些细胞很可能是参与病变的巨噬细胞和小胶质细胞。少数唾液腺凝集素阴性细胞似乎是I-A^秒+在病变边缘（图。（图1A）1A）可能是活化的小胶质细胞。从功能上讲，Ford等人(12)表明FACS分选大鼠小胶质细胞（CD11b/c⁺CD45型^低的)在将豚鼠MBP呈现给MBP特异性T细胞系时表现不佳[^三H] TdR摄取或IL-2生成。相反，CD11b/c⁺CD45型^高的正常大鼠脑中的巨噬细胞是能够刺激最大增殖和IL-2生成的功能性APC。这些结果表明，即使在正常的中枢神经系统中，APC的主要群体也由少数浸润性巨噬细胞组成，这些浸润性巨噬细胞可能与前面描述的辐射敏感性、血管周围巨噬细胞和小胶质细胞相对应(20,25)或其他瞬时巨噬细胞，如脉络丛中的巨噬细胞(25,53).

这些发现对TMEV诱导脱髓鞘的发病机制有一些启示。首先，TMEV感染后引发脱髓鞘的事件不需要涉及大胶质细胞或小胶质细胞，因为存在CD45^高的Mac-1型⁺正常成人中枢神经系统中存在的巨噬细胞能有效地提呈抗原。此外，由于脑内接种TMEV会产生短暂的外周病毒血症，因此可能首先在中枢神经系统外产生特异性免疫反应。这种可能性与我们之前的结果一致，即诱导外周病毒特异性耐受可抑制病毒特异性DTH和增殖反应的发展，并保护小鼠免受脱髓鞘的发展(27,28). 第二，一旦病毒从外周清除，中枢神经系统炎症形成，抗原就会出现在中枢神经系统持续感染的巨噬细胞上，从而维持疾病的进展。这种可能性与MHCⅡ类和唾液粘附素阳性F4/80的位置一致⁺巨噬细胞和小胶质细胞，结果表明病毒抗原的主要负担是浸润的巨噬细胞(5,41,56). 持续感染的星形胶质细胞上的抗原也可能出现，但可能不是疾病进展所必需的。第三，巨噬细胞的抗原提呈能力大于小胶质细胞(12)间接表明，在没有IFN-γ预处理的情况下，我们观察到的病毒抗原的内源性呈现很可能发生在浸润的巨噬细胞上，而不是小胶质细胞或星形胶质细胞上。Sedgwick等人之前的工作(57)显示了独特的CD45^低的CD11b/c公司⁺JHM冠状病毒性脑脊髓炎大鼠体内发现小胶质细胞群，伴随大量CD45流入^高的巨噬细胞；然而，当从炎症病变中分离出来时，这些细胞的抗原提呈能力没有得到测试。很有意思的是，在正常和TMEV感染的SJL/J小鼠中，基于CD45表达水平的巨噬细胞和小胶质细胞之间的区别是否成立，以及这些细胞类型在持续感染以及处理和呈现病毒抗原的能力上是否存在差异。虽然已发表的小胶质细胞APC功能的研究使用了脑组织培养的细胞(19,57)，我们无法直接从原始的SJL/J脊髓中获得足够的小胶质细胞来直接比较原始和激活的浸润性巨噬细胞和小胶质细胞的APC功能。

CNS浸润巨噬细胞共刺激分子的表达进一步证明，这些细胞是TMEV感染期间CNS中的主要APC。通过FACS（图。（图2），2)，大部分I-A^秒+细胞为F4/80⁺以及B7-1⁺或B7-2⁺免疫组织化学分析证实了这一发现（图。（图2）2)这揭示了B7-1和B7-2同时定位于大F4/80⁺细胞。B7在细胞表面表达的时间调控尚未完全解决所有细胞类型的问题。一些小组报告称，B7-2在活化的B细胞表面快速诱导，而B7-1在3-4天后达到峰值(32)而其他人则报告了脂多糖或抗IgD-右旋糖酐激活的B细胞上B7-1和B7-2的动力学增加的相似性(18). 奇怪的是，CD4⁺病变中的T细胞主要表达B7-2，尤其是在病变边缘较大的囊状细胞上，这表明这些细胞比支配病变中心的T细胞激活得晚。

TMEV诱导脱髓鞘和R-EAE之间MHC II类和B7表达的比较对于我们最近关于SJL/J小鼠R-EAE期间体内B7分子操纵的数据很重要(49). 与TMEV感染小鼠一样，F4/80⁺细胞表达高水平的MHC II类、B7-1和B7-2。同样，B7-1成为主要的共刺激分子，因为其在R-EAE小鼠中的表达随着时间的推移相对于B7-2的表达增加。体内注射抗B7-1或B7-2的单克隆抗体表明，这些分子在EAE的诱导和进展中具有不同的功能(29,49). 此外，在疾病缓解期间用Fab片段阻断抗B7-1抗体，通过阻止内源性髓磷脂表位特异性T细胞的活化（即表位扩散）来抑制随后的疾病复发，而内源性髓鞘表位在介导R-EAE复发的发病机制中起主要作用(44,49). 我们最近发现，在慢性疾病过程中，TMEV感染的SJL/J小鼠的脾脏和淋巴结中出现DTH和对多个致脑髓鞘表位的增殖反应(47,48). 因此，F4/80的B7-1相对增加⁺在R-EAE中，似乎对疾病进展很重要的细胞在TMEV诱导的脱髓鞘进展中也可能同样重要，而且可能作为免疫治疗的靶点。目前正在进行实验，以阐明协同刺激在内源性抗原提呈、表位扩散和疾病进展中的作用。初步研究表明，CNS浸润细胞内源性呈现TMEV表位是B7依赖性的，因为CTLA-4 Ig阻止了增殖（未发表的数据）。

除了星形胶质细胞、活化的小胶质细胞和浸润的巨噬细胞外，CNS内还有其他候选APC需要简要考虑。抗原特异性B细胞是特别有效的APC(31)并参与CNS内T细胞的活化。先前对B细胞限制性CD45亚型B220进行量化的FACS实验表明，在TMEV感染的脊髓中，很少一部分单核细胞浸润为B细胞，通常少于1%（数据未显示）。在我们对MHC II类表达的分析中，少数F4/80⁻，MHC II级⁺从脊髓分离的细胞中检测到了事件（图。（图2），2)，可能代表少量MHC II类⁺B细胞。然而，由于其在CNS中的数量非常少，直接隔离和测试B220的APC功能是不切实际的⁺B细胞。因此，CNS驻留的B细胞仍有可能在疾病过程中发挥APC功能。

也许最有趣的观察是几个月前从感染TMEV的小鼠脊髓分离出的黏附细胞通过呈现体内病毒表位内源性激活TMEV特异性T细胞的能力（图。（图44和和5）。5). 从R-EAE小鼠脊髓分离的类似细胞在没有添加病毒的情况下无法激活病毒特异性T细胞，从而证实了这种激活的抗原特异性。此外，TMEV衍生的CNS APC没有刺激hMyo特异性T细胞株（图。（图5）5)无需添加外源性、特异性抗原。在APC分离过程中，病毒抗原的主要来源不太可能来自受感染细胞碎片的处理和呈现，尤其是因为大多数病毒抗原(9,41)和传染性病毒(5)已经存在于浸润性巨噬细胞群中。在这方面，将脾APC纳入从幼年小鼠制备的分离脊髓匀浆中不会导致高度敏感的PLP激活_139–151-当这些细胞接受相同的Percoll梯度、塑料粘附分离程序并测试APC活性时（数据未显示）。

从TMEV感染小鼠的中枢神经系统中分离出的细胞含有病毒抗原，并在体外向T细胞呈递病毒抗原，这一发现对于理解MS的发病机制具有重要意义，其原因如下。首先，许多研究人员在M5患者的病变中观察到HLA II类(23,60,62). 阳性细胞已被鉴定为巨噬细胞、星形胶质细胞和内皮细胞。最近三个不同的实验室显示了B7分子在MS病变中的表达(10,64,65). 因此，MS病变中的几种类型的细胞可充分激活中枢神经系统内的T细胞。其次，在病变中观察到了携带IL-2R的细胞(23)以及活化T细胞的产物，包括IFN-γ(61)和IL-2(23). 这一发现进一步表明存在局部抗原。第三，多发性硬化症的流行病学强烈表明一种广泛的、慢性的、通常是亚临床的传染源，可能是一种病毒(30). 病毒抗原（导致旁观者脱髓鞘）、与病毒抗原交叉反应的神经抗原（分子模拟）以及由病毒诱导的中枢神经系统损伤（表位扩散）释放的神经抗原在中枢神经系统内的出现，都是病毒在中枢神经系统内引发致病性免疫反应的可能机制。我们的结果直接证明，TMEV感染小鼠中枢神经系统内的APC群体中存在足够的病毒抗原，以激活敏感的病毒特异性T细胞系。因此，慢性中枢神经系统感染作为MS病因学中的始发事件似乎在机制上是合理的。最后，我们的结果可能对考虑MS的新疗法很重要。表位扩散现象可能使MS抗原特异性治疗的目标难以实现。然而，如果表位扩散证明对MS的进展与R-EAE中的表位扩散同样重要(44)也许是TMEV感染(48)，靶向有效分子可能是B7-1和/或B7-2。然而，需要采取谨慎的方法，因为目前的数据似乎表明，这些分子的功能从急性疾病转变为慢性疾病，从可能的改善转变为潜在的有害。

致谢

这项工作得到了美国国家卫生研究院公共卫生服务资助NS-23349和NS-21913以及霍华德·休斯（Howard Hughes）博士前奖学金（J.G.P.）的支持。

参考文献

1Berkower I，Buckenmeyer G K，Gurd F R，Berzofsky J A.免疫不同肌红蛋白的小鼠T淋巴细胞识别的可能免疫优势表位。美国国家科学院程序。1982;79:4723–4727. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

2Borrow P，Nash A A.对泰勒病毒诱导脱髓鞘病的敏感性与星形胶质细胞II类诱导和抗原提呈相关。免疫学。1992;76:133–139. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

3Cash E，Rott O。小胶质细胞有资格作为未激发CD4的刺激物⁺和CD8⁺中枢神经系统中的T淋巴细胞。临床实验免疫学。1994;98:313–318. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

4Clatch R J、Melvold R W、Dal Canto M C、Miller S D、Lipton H L。多发性硬化症的Theiler鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）模型显示了HLA-a、B和C的鼠等效物的强烈影响。神经免疫杂志。1987;15:121–135.[公共医学][谷歌学者]

5Clatch R J、Miller S D、Metzner R、Dal Canto M C、Lipton H L。从小鼠中枢神经系统分离的单核细胞/巨噬细胞含有感染性泰勒氏鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）病毒学。1990;176:244–254.[公共医学][谷歌学者]

6Cserr H F，Knopf P M。颈部淋巴管、血脑屏障和大脑免疫反应：一种新观点。今日免疫学。1992;13:507–512.[公共医学][谷歌学者]

7Dal Canto M C.泰勒病毒性脑脊髓炎脱髓鞘和髓鞘细胞原发感染之间的解耦关系。感染免疫。1982;35:1133–1138. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

8Dal Canto M C，Barbano R L。泰勒病毒感染急性和复发性脱髓鞘病变中MAG、MBP和P0蛋白的免疫细胞化学定位。神经免疫杂志。1985;10:129–140.[公共医学][谷歌学者]

9Dal Canto M C，Lipton H L。急性和慢性脱髓鞘泰勒病毒感染中病毒的超微结构免疫组织化学定位。《美国病理学杂志》。1982;106:20–29. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

10De Simone R、Giampaolo A、Giometto B、Gallo P、Levi G、Peschle C、Aloisi F。共刺激分子B7在培养的人类小胶质细胞和多发性硬化急性病变中表达。神经病理学实验神经学杂志。1995;54:175–187.[公共医学][谷歌学者]

11Fontana A、Fierz W、Wekerle H。星形胶质细胞向致脑T细胞系提供髓鞘碱性蛋白。自然。1984;307:273–276.[公共医学][谷歌学者]

12Ford A L，Goodsall A L，Hickey W F，Sedgwick J D.通过流式细胞术分选从其他中枢神经系统巨噬细胞分离出的正常成人分支小胶质细胞。比较了髓磷脂碱性蛋白反应CD4+T细胞的表型差异和直接体外抗原递呈。免疫学杂志。1995;154：4309–4321。[公共医学][谷歌学者]

13Frei K、Siepl C、Groscurth P、Bodmer S、Schwerdel C、Fontana A.干扰素-γ处理的小胶质细胞的抗原呈递和肿瘤细胞毒性。欧洲免疫学杂志。1987;17:1271–1278.[公共医学][谷歌学者]

14Friedmann A、Frankel G、Lorch Y、Steinman L.单克隆抗I-A抗体逆转Theiler病毒感染小鼠的慢性瘫痪和脱髓鞘：治疗时机的关键重要性。《维罗尔杂志》。1987;61:898–903. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

15Gerety S J、Clatch R J、Lipton H L、Goswami R G、Rundell M K、Miller S D。泰勒氏鼠脑脊髓炎病毒诱导的脱髓鞘疾病中II类限制性T细胞反应。四、易感SJL/J小鼠VP2衣壳蛋白N末端免疫显性T细胞决定簇的鉴定。免疫学杂志。1991;146:2401–2408.[公共医学][谷歌学者]

16Gerety S J、Rundell M K、Dal Canto M C、Miller S D。泰勒鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）诱导的脱髓鞘疾病中II类限制性T细胞反应。六、免疫病理性CD4增强脱髓鞘作用及其特征⁺免疫显性VP2表位特异性T细胞系。免疫学杂志。1994;152:919–929.[公共医学][谷歌学者]

17Graves M C、Bologa L、Siegel L、Londe H.Theiler’s病毒在脑细胞培养中的作用：神经元和少突胶质细胞的溶解以及星形胶质细胞和巨噬细胞的持久性。神经科学研究杂志。1986;15:491–501.[公共医学][谷歌学者]

18Hathcock K S，Laszlo G，Pucillo C，Linsley P，Hodes R J.B7-1和B7-2共刺激配体的比较分析：表达和功能。《实验医学杂志》。1994;180:631–640. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

19Havenith C E G，Askew D，Walker W S。小鼠常驻小胶质细胞：分离和鉴定原始CD4+和CD8+T细胞的免疫调节特性。格利亚。1998;22:348–359.[公共医学][谷歌学者]

20Hickey W F，Kimura H。中枢神经系统血管周围小胶质细胞是骨髓衍生的，在体内呈抗原。科学。1988;239:290–292.[公共医学][谷歌学者]

21Hickey W F，Osborn J P，Kirby W M。Lewis大鼠急性实验性变态反应性脑脊髓炎期间星形胶质细胞Ia分子的表达。细胞免疫学。1985;91：528–535。[公共医学][谷歌学者]

22Hinrichs D J，Wegmann K W，Dietsch G N。实验性变态反应性脑脊髓炎向骨髓嵌合体的转移。内皮细胞不是限制因素。《实验医学杂志》。1987;166:1906–1911. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

23Hofman F M、von Hanwehr R I、Dinarello C A、Mizel S B、Hinton D、Merrill J E。多发性硬化脑中识别的免疫调节分子和IL 2受体。免疫学杂志。1986;136:3239–3245.[公共医学][谷歌学者]

24Jenkins M K。协同模拟的起伏。免疫。1995;1:443–446.[公共医学][谷歌学者]

25Jordan F L，Thomas W E.脑巨噬细胞：起源和相互关系问题。大脑研究评论。1988;13:165–178.[公共医学][谷歌学者]

26June C H、Bluestone J A、Nadler L M、Thompson C B。B7和CD28受体家族。今日免疫学。1994;15:321–331.[公共医学][谷歌学者]

27卡普斯·W·J、彼得森·J·D、米勒·S·D·Anergy体内：抗原特异性CD4的下调⁺Th1而非Th2细胞因子反应。国际免疫学。1994;6:721–730.[公共医学][谷歌学者]

28Karpus W J、Pope J G、Peterson J D、Dal Canto M C、Miller S D。通过外周免疫耐受诱导抑制泰勒病毒介导的脱髓鞘。免疫学杂志。1995;155:947–957.[公共医学][谷歌学者]

29Kuchro V K、Das M P、Brown J A、Ranger A M、Zamvil S S、Sobel R A、Weiner H L、Nabavi N、Glimcher L H B7-1和B7-2共刺激分子差异激活Th1/Th2发育途径：应用于自身免疫疾病治疗。单元格。1995;80:707–718.[公共医学][谷歌学者]

30Kurtzke J F.多发性硬化症作为一种感染的流行病学证据。临床微生物学评论。1993;6:382–427. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

31Lanzavecchia A.受体介导的抗原摄取及其对Ⅱ类限制性T淋巴细胞抗原提呈的影响。免疫学年度回顾。1990;8:773–793.[公共医学][谷歌学者]

32Lenschow D J，Su G H，Zuckerman L A，Nabavi N，Jellis C L，Gray G S，Miller J，Bluestone J A.CTLA-4附加配体的表达和功能意义。美国国家科学院程序。1993;90:11054–11058. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

33Lenschow D J，Walunas T L，Bluestone J A.CD28/B7 T细胞共刺激系统。免疫学年度回顾。1996;14:233–258.[公共医学][谷歌学者]

34Levy M，Aubert C，Brahic M.Theiler在体外培养的脑巨噬细胞中的病毒复制。《维罗尔杂志》。1992;66:3188–3193. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

35Lipton H L，Dal Canto M C。SJL/J小鼠泰勒病毒感染中的慢性神经系统疾病。神经科学杂志。1976年a；30:201–207.[公共医学][谷歌学者]

36Lipton H L，Dal Canto M C.泰勒病毒诱导的脱髓鞘：通过免疫抑制进行预防。科学。1976年b；192:62–64.[公共医学][谷歌学者]

37Lipton H L，Dal Canto M C。免疫抑制对小鼠泰勒病毒感染的对比作用。感染免疫。1977;15:903–909. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

38Lipton H L，Dal Canto M C.近交系小鼠对泰勒鼠脑脊髓炎病毒慢性中枢神经系统感染的敏感性。感染免疫。1979;26:369–374. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

39Lipton H L，Gonzalez Scarano F.感染泰勒氏病毒的小鼠的中枢神经系统免疫。I.局部中和抗体反应。传染病杂志。1978;137:145–151.[公共医学][谷歌学者]

40Lipton H L，Melvold R.小鼠对泰勒病毒诱导脱髓鞘病易感性的遗传分析。免疫学杂志。1984;132:1821–1825.[公共医学][谷歌学者]

41Lipton H L，Twaddle G，Jelachich M L。主要的病毒抗原负荷存在于Theiler氏鼠脑脊髓炎病毒诱导的脱髓鞘病的巨噬细胞中。《维罗尔杂志》。1995;69:2525–2533. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

42Matsumoto Y，Ohmori K，Fujiwara M。中枢神经系统中脑细胞的免疫调节：在活体模拟条件下，小胶质细胞而非星形胶质细胞向致脑T细胞呈现髓鞘碱性蛋白。免疫学。1992;76:209–216. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

43McRae B L、Kennedy M K、Tan L J、Dal Canto M C、Miller S D。使用蛋白脂质的致脑表位诱导活动性和过继性慢性复发性实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。神经免疫杂志。1992;38:229–240.[公共医学][谷歌学者]

44McRae B L，Vanderlugt C L，Dal Canto M C，Miller S D。表位扩散在SJL/J小鼠EAE复发病理中的功能证据。《实验医学杂志》。1995;182:75–85. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

45Miller S D、Clatch R J、Pevear D C、Trotter J L、Lipton H L。泰勒鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）诱导的脱髓鞘疾病中II类限制性T细胞反应。I.TMEV亚基和相关小RNA病毒之间的交叉特异性，但不包括髓鞘蛋白。免疫学杂志。1987;138:3776–3784.[公共医学][谷歌学者]

46Miller S D、Gerety S J、Kennedy M K、Peterson J D、Trotter J L、Tuohy V K、Waltenbaugh C、Dal Canto M C、Lipton H L。泰勒鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）诱导的脱髓鞘疾病中II类限制性T细胞反应。三、神经抗原特异性免疫耐受未能影响脱髓鞘的临床过程。神经免疫杂志。1990;26:9–23. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

47Miller S D、McRae B L、Vanderlugt C L、Nikcevich K M、Pope J G、Pope L、Karpus W J。实验性自身免疫性脑脊髓炎过程中T细胞储备的演变。免疫学评论。1995;144：225–244。[公共医学][谷歌学者]

48Miller S D、Vanderlugt C L、Begolka W S、Pao W、Yauch R L、Neville K L、Katz-Levy Y、Carrizosa A、Kim B S。持续感染Theiler病毒会通过表位扩散导致CNS自身免疫。自然医学。1997;三：1133–1136。[公共医学][谷歌学者]

49Miller S D、Vanderlugt C L、Lenschow D J、Pope J G、Karandikar N J、Dal Canto M C、Bluestone J A.阻断CD28/B7-1相互作用可防止小鼠EAE的表位扩散和临床复发。免疫。1995;三:739–745.[公共医学][谷歌学者]

50Myers K J，Dougherty J P，Ron Y。实验性自身免疫性脑脊髓炎诱导过程中大脑实质细胞和造血衍生细胞的体内抗原呈递。免疫学杂志。1993;151:2252–2260.[公共医学][谷歌学者]

51Nikcevich K M、Gordon K B、Tan L、Hurst S D、Kroepfl J F、Gardinier M、Barrett T A、Miller S D。干扰素-γ激活的原代小鼠星形胶质细胞表达B7共刺激分子和原始抗原特异性T细胞。免疫学杂志。1997;158:614–621.[公共医学][谷歌学者]

52Perry V H，Crocker P R，Gordon S。血脑屏障调节小胶质细胞上巨噬细胞唾液酸结合受体的表达。细胞科学杂志。1992;101:201–207.[公共医学][谷歌学者]

53Perry V H，Hume D A，Gordon S.成年和发育中小鼠脑中巨噬细胞和小胶质细胞的免疫组织化学定位。神经科学。1985;15:313–326.[公共医学][谷歌学者]

54Pope J G、Karpus W J、Vanderlugt C L、Miller S D。患有泰勒病毒诱导脱髓鞘病的SJL/J小鼠CNS浸润细胞的流式细胞术和功能分析：CD4的证据⁺T细胞介导的病理学。免疫学杂志。1996;156:4050–4058.[公共医学][谷歌学者]

55Rodriguez M，Leibowitz J L，Lampert P W。泰勒病毒诱导的脑脊髓炎中少突胶质细胞的持续感染。Ann Neurol公司。1983;13:426–433.[公共医学][谷歌学者]

56Rossi C P、Delcroix M、Huitinga I、McAllister A、Van Rooijen N、Claassen E、Brahic M。巨噬细胞在泰勒病毒感染过程中的作用。《维罗尔杂志》。1997;71:3336–3340. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

57Sedgwick J D，Schwender S，Imrich H，Döries R，Butcher G W，ter Meulen V.从正常和发炎的中枢神经系统中分离并直接鉴定常驻小胶质细胞。美国国家科学院程序。1991;88:7438–7442. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

58Steiner C M，Rozhon E J，Lipton H L。宿主年龄与泰勒病毒在小鼠中枢神经系统中持续存在的关系。感染免疫。1984;43:432–434. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

59Tan L J，Gordon K B，Mueller J P，Matis L A，Miller S D。IFN-γ激活的SJL/J星形胶质细胞对蛋白脂蛋白表位的呈递和B7-1依赖性的致脑T细胞激活。免疫学杂志。1998;160:4271–4279.[公共医学][谷歌学者]

60Traugott U。多发性硬化：I类和II类MHC表达细胞与病变发展的相关性。神经免疫杂志。1987;16:283–302.[公共医学][谷歌学者]

61Traugott U，Lebon P.α、β和γ干扰素在活动性慢性多发性硬化病变中的演示。Ann NY科学院。1988;540:309–311.[公共医学][谷歌学者]

62Traugott U，Reinherz E L，Raine C S。多发性硬化：活动性慢性病变中T细胞亚群的分布。科学。1983;219:308–310.[公共医学][谷歌学者]

63Welsh C J，Tonks P，Nash A A，Blakemore W F。CBA小鼠中L3T4 T细胞耗竭对泰勒氏鼠脑脊髓炎病毒感染发病机制的影响。维罗尔将军。1987;68:1659–1667.[公共医学][谷歌学者]

64Williams K，Ulvestad E，Antel J P.B7/BB-1抗原在成人小胶质细胞上的表达在体外和原位研究。欧洲免疫学杂志。1994;24:3031–3037.[公共医学][谷歌学者]

65Windhagen A、Newcombe J、Dangond F、Strand C、Woodroof M N、Cuzner M L、Hafler D A。多发性硬化病变中共刺激分子B7-1（CD80）、B7-2（CD八十）和白细胞介素13细胞因子的表达。《实验医学杂志》。1995;182:1985–1996. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

文章来自病毒学杂志由以下人员提供美国微生物学会（ASM）