《维罗尔杂志》。1998年10月；72(10): 7745–7753.
增加副粘病毒F和HN蛋白表面密度促进膜融合：猿猴病毒5F、人副流感病毒3F型和流感病毒HA介导的融合反应比较
,1 ,1和1,2,*
丽贝卡·埃利斯-达奇
生物化学、分子生物学和细胞生物学系1霍华德·休斯医学院，2伊利诺伊州埃文斯顿西北大学60208-3500
桑吉塔·巴盖·乔希
生物化学、分子生物学和细胞生物学系1霍华德·休斯医学院，2伊利诺伊州埃文斯顿西北大学60208-3500
罗伯特·兰姆
生物化学、分子生物学和细胞生物学系1霍华德·休斯医学院，2伊利诺伊州埃文斯顿西北大学60208-3500
生物化学、分子生物学和细胞生物学系1霍华德·休斯医学院，2伊利诺伊州埃文斯顿西北大学60208-3500
*通讯作者。通讯地址：西北大学生物化学、分子生物学和细胞生物学系，2153 North Campus Dr.，Evanston，IL 60208-3500。电话：（847）491-5433。传真：（847）491-2467。电子邮件：ude.uwn@bmalar. 1998年4月1日收到；1998年6月23日接受。
摘要
当F和HN的表面密度不同时，副粘病毒猴5型（SV5）和人副流感病毒3型（HPIV-3）融合蛋白（F）和血凝素-神经氨酸酶（HN）蛋白促进的膜融合反应被表征。使用定量含量混合分析发现，SV5 F介导的融合程度取决于SV5 F蛋白的表面密度，但与SV5 HN蛋白的密度无关，表明HN在反应中仅起结合作用。然而，发现HPIV-3 F蛋白促进融合反应的程度取决于HPIV-3 HN蛋白的表面密度，这表明HPIV-3 HN蛋白是融合反应的直接参与者。脂质混合动力学分析表明，融合的初始速率和最终程度都随着SV5 F蛋白表面密度的增加而增加，这表明在SV5 F蛋白质促进的膜融合过程中，多个融合孔可能是活跃的。还发现，随着流感病毒血凝素蛋白表面密度的增加，脂质混合的初始速率和程度也增加，这表明这两种病毒融合蛋白促进融合的机制相似。
迄今为止，我们对蛋白质介导的膜融合的理解大多来自于对病毒融合蛋白的研究，病毒融合蛋白存在于包膜病毒的膜中。流感病毒血凝素（HA）促进的膜融合经历了多个步骤，从低pH值触发HA分子发生一系列显著的结构变化开始(10,61)，病毒进入时发生在内体内的事件。大量证据表明，多个HA三聚体随后聚集在一起，形成融合孔(18,20). 虽然随后发生脂质混合和完全融合的机制尚不清楚，但对于HA来说，蛋白质的跨膜结构域和周围脂质的结构都起着重要作用(13,32).
已知副粘病毒（如猴病毒5（SV5））的融合（F）蛋白可在中性pH值下促进融合，从而使病毒进入质膜。然而，尽管低pH值不是融合启动的触发因素，但副粘病毒F蛋白和特性良好的HA蛋白之间似乎有许多相似之处。HA和F蛋白都是作为生物非活性前体蛋白合成的，必须将其裂解成二硫键二聚体才能具有生物活性(33,52). 两者都形成高阶低聚物：X射线衍射研究表明HA是三聚体(61)化学交联研究表明，F也是三聚体(50). HA和F都含有一种疏水性拉伸物，称为融合肽，位于跨膜结构域片段的N末端，该片段已被证明插入靶膜(2,22,39)，突变分析表明它对融合很重要(28,48,58). 此外，HA和F在融合肽和跨膜结构域附近都有七肽重复序列结构域；突变分析表明，这些结构域对融合活性也很重要(9,48,54). 对于HA，已经证明这些七肽重复序列是从亚稳中性pH构象向低H构象过渡的关键结构域(10). 最后，缺乏F蛋白细胞质尾部的突变体(6)或HA蛋白的胞质尾部和跨膜结构域(32)已经显示出促进半融合，这表明HA和F融合促进的机制具有共同的元素。
虽然HA除了其融合活性外，在病毒与细胞的初级附着中也有作用，但副粘病毒的F蛋白在病毒与细胞质表面的初级附着过程中没有已知的作用。相反，这种功能是由第二种病毒糖蛋白执行的，即血凝素-神经氨酸酶（HN）蛋白(26,51). 对于许多副粘病毒来说，F蛋白介导的膜融合似乎需要同型HN蛋白(12,19,30,38,59,60). 然而，副粘病毒SV5的F蛋白已被证明在缺乏其同源型HN的情况下促进融合(5,29). 有人认为，对于那些需要同型HN蛋白进行融合的副粘病毒来说，HN分子与靶细胞上唾液酸部分的结合会导致HN的构象变化，进而触发启动融合所必需的F蛋白的假定构象变化(34,53). 对于SV5，其融合活性不需要其同型HN，已经假设与靶膜紧密接触或与尚未识别的受体结合可能会诱导启动融合所需的假定构象变化(34).
虽然副粘病毒F蛋白的许多重要融合区域已被确定，但F蛋白介导的膜融合的实际机制仍有待确定。对HA表面密度变化对融合的影响的研究表明，HA的初始融合速率(18)以及聚变起始前的滞后阶段(14,18)取决于HA的表面密度。HA表面密度对融合程度的影响因所使用的测定方法而异(18,20,36). 这些发现表明，在HA介导的融合过程中，多个融合孔被打开，并且HA的几个三聚体可能参与每个孔的形成。为了进一步表征F蛋白介导的融合事件，我们改变了副粘病毒SV5和人类副流感病毒3型（HPIV-3）的F和HN蛋白的表面密度。我们在这里表明，融合的程度和初始速度取决于SV5 F蛋白的表面密度，但融合的程度与SV5 HN蛋白的密度无关，这表明HN在反应中仅起结合作用。然而，HPIV-3 F蛋白促进融合反应的程度取决于HPIV-3 HN蛋白的表面密度，这表明HPIV-3 H蛋白是融合反应的直接参与者。在我们的系统中，我们发现流感病毒A/Udorn/72（H3亚型）HA的融合动力学与SV5 F蛋白的融合动力学相似，融合的初始速率和程度随表面密度而变化，表明这些病毒融合蛋白的融合机制相似。
材料和方法
细胞和病毒。
CV-1细胞TC7亚克隆的单层培养物在含有10%胎牛血清（FCS）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中生长。如前所述，表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒vTF7-3在CV-1细胞中生长(21). 培养SV5和HPIV-3库存，并按照前面所述测定滴度(44).
质粒载体。
SV5 F cDNA(28,41,42)被亚克隆到pGEM2X中，pGEM2的衍生物包含Xho公司I站点(4,5). SV5 HN cDNA(26,41)以及HPIV-3 F和HPIV-3 HN cDNA(23)被亚克隆到pGEM3X中。包含流感病毒A/Udorn/72 HA cDNA的质粒pTF7.5 HA在前面已经描述过(55). 质粒pINT7β-gal(40)，包含β-半乳糖苷酶cDNA，由Edward Berger和Bernard Moss（马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）善意提供。所有cDNA均在pGEM中定向克隆，以便利用噬菌体T7 RNA聚合酶合成mRNA-sense RNA转录物。
F和HN蛋白的表达。
利用重组痘苗病毒T7 RNA聚合酶表达系统瞬时表达SV5、HPIV-3和流感病毒（A/Udorn/72[H3亚型]）HA的F和HN蛋白(21). 用重组痘苗病毒vTF7-3感染CV-1细胞亚流单层，每细胞约10 PFU，并在37°C下培养30分钟。然后去除病毒接种物，并使用如上所述制备的阳离子脂质体将质粒DNA转染细胞(49). 将2.0 ml OPTI-MEM（马里兰州盖瑟斯堡GIBCO-BRL）中总计7.5μg质粒DNA和15μl脂质体用于6 cm直径的组织培养皿。转染后5 h，细胞在磷酸盐缓冲液（PBS）中清洗一次，并在33°C的DMEM中与10%FCS孵育过夜。
通过流式细胞术定量表面密度。
在隔夜培养后，将转染的CV-1细胞置于冰上冷冻10分钟，并按照前面所述进行流式细胞术分析(28). 单克隆抗体（MAb）F1a对SV5 F特异性，MAb HN4b对SV5 HN特异性(47)，MAb 145/50对HPIV-3 F蛋白特异，MAb 66/4对HPIV-3HN蛋白特异(16,17)和针对流感病毒A/Udorn/72 HA（Kathleen Coelingh的礼物）的MAb D6/1作为一级抗体，荧光素-异硫氰酸盐结合的山羊抗鼠免疫球蛋白G作为二级抗体。所有抗体均在抗体过量的情况下使用（数据未显示）。通过流式细胞术测量10000个细胞的荧光强度（FACSCaliber；Becton Dickinson，Mountain View，Calif.）。作为转染变异性的对照，CV-1细胞在流式细胞术分析前一天感染了每细胞10个SV5或HPIV-3 PFU。感染后18小时（p.i.），将感染细胞培养物与DNA转染样品一起进行流式细胞术。将平均荧光强度（MFI）与SV5-或HPIV-3-感染细胞中观察到的荧光强度进行比较。
HPIV-3感染细胞表面F和HN分子摩尔比的量化。
CV-1细胞在37°C下与每细胞10个HPIV-3 PFU孵育1小时，并用最终量为2%FCS和40μCi的90%Cys和Met缺乏DMEM–10%DMEM替换培养基[35S] 每毫升蛋氨酸（Amersham International，Arlington Heights，Ill.）。培养17小时后，如前所述，对细胞进行裂解和免疫沉淀(35)或置于4°C下进行抗体捕获。在这两个程序中，4μl MAb C191/9到HPIV-3 F或40μl组织培养上清液到HPIV-3HN（之前测定的每个量都是为了提供抗体过剩条件）用作一级抗体，1μl兔抗鼠免疫球蛋白G用作二级抗体。抗体捕获板用冷PBS清洗两次，并在PBS–1%牛血清白蛋白的抗体溶液中摇晃培养1小时。然后用冷PBS洗涤细胞五次，溶解细胞，并进行上述免疫沉淀。样品在15%丙烯酰胺凝胶上进行分析，放射性在FujiBAS 1000生物成像仪上进行定量（Fuji Medical Systems，Stamford，Conn.）。
β-半乳糖苷酶含量混合测定。
在过夜培养后，通过激活报告基因β-半乳糖苷酶的方法检测转染细胞的含量混合活性(5,40). 如前所述，通过β-半乳糖苷酶的比色裂解物测定法测量细胞融合(40)结果由平板阅读器读取（ELX800；Bio-tek Instruments，Inc.，Winooski，Vt.）。对于测试胰蛋白酶处理效果的实验，在神经氨酸酶处理后，清洗细胞，用含有2.5 mM CaCl的OPTI-MEM中的TPCK（甲苯磺酰苯丙氨酸氯甲基酮）-胰蛋白酶（5μg/ml）模拟处理或处理1小时2.
脂质混合的荧光光谱分析。
如前所述，用脂质探针十八烷基罗丹明B（R18）标记新鲜人红细胞（RBC）(5). 隔夜培养后，用PBS清洗转染细胞，并在37°C的DMEM中用每毫升50 mU的神经氨酸酶（V型产气荚膜梭菌；密苏里州圣路易斯Sigma Chemical Co.）培养1小时。然后用PBS清洗细胞两次，并用3 ml R18-标记的红细胞（0.02或0.05%红细胞压积）在4°C下培养30分钟，偶尔轻轻摇晃以确保均匀扩散。用冰镇PBS多次洗涤去除多余的未结合红细胞，并在4°C的含50 mM EDTA的PBS溶液中培养30分钟，从培养皿中去除红细胞复合物。用冷PBS清洗红细胞复合物，并将其置于冰上，直至再次使用。将50微升RBC细胞复合物添加到3 ml预热的PBS中，并在荧光分光光度计（Aminco Bowman系列2）中连续测量荧光，时间分辨率分别为560-nm和590-nm。为了减少散射，在发射光路中放置了570-nm截止滤波器。荧光百分比计算为100(F−F0/F类t吨−F0)，其中F类0和F类分别是时间零点和给定时间点的荧光强度，以及F类t吨是0.1%Triton X-100存在时的荧光强度，当未观察到自猝灭时取荧光(7).
R18标记的红细胞与转染细胞融合的共焦显微镜。
在含有盖玻片的直径为6 cm的培养皿中对CV-1细胞进行转染，将细胞培养过夜，然后按照上述方法进行清洗和神经氨酸酶处理。然后用5μM SYTO 12核酸染料（Molecular Probes，Eugene，Oreg.）在无磷DMEM（GIBCO-BRL）中在37°C下培养细胞30分钟，并用冰镇PBS清洗，R18标记的RBC如上所述与CV-1细胞结合。用PBS清洗去除多余的未结合红细胞，并将平板储存在4°C下。通过用预热至37°C的PBS替换冷PBS来启动融合，并将细胞在37°C下孵育不同时间。通过用冰冷的PBS代替来停止融合。在共聚焦显微镜系统（蔡司LSM 410；Carl Zeiss，Inc.，Thornwood，NY）中观察融合，在荧光素和罗丹明通道上记录双图像。
结果
不同表面密度病毒糖蛋白的表达。
由于SV5 F蛋白和SV5 HN或流感病毒HA等附着蛋白的表达需要通过本研究中使用的定量融合分析检测融合，因此寻求一种瞬时表达的方法，该方法可以很容易地允许两种蛋白的表面密度发生变化。因此，当不同数量的编码F的质粒转染到细胞中并使用痘苗病毒-T7 RNA聚合酶系统表达时，测定SV5 F蛋白的相对表面表达水平。总DNA量保持在每6 cm直径培养皿7.5μg的恒定水平，质粒pGEM2XSV5F（SV5 F DNA）的量在0.05至5.0μg之间变化。转染细胞用F特异性单抗F1a处理，并用流式细胞仪分析细胞表面荧光。为了控制实验间转染效率的变化，在18 h p.i.时定期比较MFI和SV5感染细胞的MFI，如图所示。A、 随着SV5 F DNA添加量的增加，SV5 F蛋白的表面密度增加，增加速度显著减缓，每6厘米直径培养皿中质粒DNA的增加量超过2.5μg。流式细胞术数据还表明，表达F（峰高[图。B] ）在很大程度上不受SV5 F DNA数量增加的影响，并且表达不同水平F（峰值形状[图。B] ）在不同人群中没有出现偏差。
SV5 F蛋白不同表面密度的表达。（A） 用不同数量的SV5 F DNA和pGEM3X DNA转染vTF7-3感染的CV-1细胞的复制板（如材料和方法中所述），得到最终的DNA量为7.5μg/6-cm直径的板。按照材料和方法中的描述，使用MAb F1a对样品进行流式细胞术分析。将MFI与18 h p.i.时SV5感染细胞中观察到的MFI进行比较，并减去模拟转染样品的MFI。（B） 流式细胞术分析的原始数据示例，显示模拟感染细胞或转染0.1μg SV5 F DNA和2.5μg SV5F DNA的细胞的数据。
SV5F蛋白含量增加对膜融合程度的影响。
为了确定增加F蛋白表面密度对F蛋白膜融合程度的影响，将2.5μg pGEM3XHN（SV5 HN DNA）和不同数量的SV5 F DNA转染vTF7-3感染的CV-1细胞的复制板。利用F-特异性MAb F1a通过流式细胞术测定MFI，并将其作为18 h p.i时SV5感染细胞中观察到的MFI的百分比。融合程度通过β-半乳糖苷酶报告基因激活融合试验测定。在低F表面密度下，发现融合程度与F表面密度的增加平行增加，这表明额外的F三聚体可以增加融合事件的数量（图。). 融合程度的增加与F表达水平开始稳定在表面密度，约占SV5感染细胞中发现的表面密度的50%。研究发现，当SV5 F蛋白表达水平高于18小时后感染SV5的细胞的100%时，融合率会再次下降。抑制水平下F蛋白的表面密度不会导致HN蛋白表达的显著下降（数据未显示），提示HN丢失不是融合程度降低的原因。F蛋白在高表面密度下的抑制也不是由于存在未分离的F蛋白，因为用外源胰蛋白酶处理并不能解除抑制（数据未显示）。
SV5 F蛋白含量增加对膜融合程度的影响。用2.5μg SV5 HN DNA和不同数量的SV5 F DNA和pGEM3X DNA转染感染vTF7-3的CV-1细胞，得到最终数量为7.5μg DNA/6 cm直径的平板。使用MAb F1a进行流式细胞术，一式两次，并将MFI与18 h p.i时SV5感染细胞中观察到的MFI进行比较。按照材料和方法中的描述，进行三次β-半乳糖苷酶融合试验。
SV5 HN蛋白表面密度对SV5 F蛋白促进融合的影响。
为了确定用于提供结合功能的SV5 HN蛋白的表面密度是否影响SV5 F蛋白促进的融合程度，转染三组CV-1细胞，以表达恒定量的SV5 F蛋白质和不同水平的SV5 H N表面密度。用SV5 F特异性MAb F1a或SV5 HN特异性MAbHN4b进行流式细胞术。融合程度通过β-半乳糖苷酶融合试验确定。虽然在没有SV5 HN蛋白（需要提供结合功能）的情况下未观察到融合，但在检测到最低数量的SV5 HN蛋白的情况下，获得了最大融合程度，相当于SV5感染细胞中的30%（图。). HN蛋白表面密度增加15倍，达到SV5感染细胞表面密度的200%以上，并没有增加SV5 F蛋白促进的融合程度。在这些条件下，F蛋白的表面密度不受SV5-HN-DNA表达量增加的显著影响（图。). 此外，当检测SV5感染细胞中80%至150%的F表面密度时，HN表达的变化并不影响F促进融合（数据未显示）。因此，这些数据表明，F蛋白与HN蛋白的比率，通过生物素化分析，似乎约为感染细胞表面每HN四聚体一个F三聚体(第18页)，对SV5介导的融合不重要，进一步证明HN蛋白允许结合但不直接参与融合反应。
SV5 HN蛋白表面密度对SV5 F蛋白促进融合的影响。用2.5μg SV5 F DNA和不同数量的SV5 HN DNA和pGEM3X DNA转染vTF7-3感染的CV-1细胞，得到最终数量为7.5μg DNA/6 cm直径的平板。用MAb F1a或MAb HN4b重复进行流式细胞术。β-半乳糖苷酶融合试验一式三份。
HPIV-3 HN蛋白表面密度对HPIV-3 F蛋白促进融合的影响。
对于SV5以外的大多数副粘病毒，HN蛋白被认为参与了融合反应。因此，确定了改变副粘病毒HPIV-3中HN蛋白的表面密度对HPIV-3 F蛋白促进融合的影响。用HPIV-3 F和HN DNA转染CV-1细胞，以获得恒定量的HPIV-3 F-蛋白和不同量的HPIV-3 HN蛋白的表达。使用HPIV-3 F-特异性MAb 145/50或HPIV-3 HN特异性MAb66-4进行流式细胞术分析，并进行β-半乳糖苷酶融合分析。发现融合程度随着HPIV-3 HN表面密度的增加而增加（图。)直到F和HN以与HPIV-3感染细胞相似的比率出现在表面。当表达不同数量的HPIV-3 F蛋白时，也观察到HPIV-3 F-和HN蛋白以相似比率的最大融合（数据未显示）。通过抗体捕获对HPIV-3感染的细胞表面上的F和HN分子的摩尔比的分析表明，HN四聚体与F三聚体的比率约为1:1（数据未显示）。这些数据表明，HN蛋白可能在HPIV-3 F蛋白促进的融合反应中发挥直接作用，当F和HN低聚物以等摩尔比存在于表面时，融合最有效。
HPIV-3 HN蛋白表面密度对HPIV-3 F蛋白促进融合的影响。将0.5μg HPIV-3 F DNA（在HPIV-3感染的细胞中观察到大约100%的F蛋白表达所需的量）和不同数量的HPIV-3 HN DNA和pGEM3X DNA转染vTF7-3感染的CV-1细胞，得到每6厘米直径板7.5μg DNA的最终量。流式细胞术分析一式两份，MAb 145/50特异性用于HPIV-3 F或MAb 66/4特异性用于HRIV-3 HN。β-半乳糖苷酶融合分析一式三份。
SV5 F蛋白表面密度增加对融合率的影响。
为了确定SV5 F蛋白表面密度的变化是否影响融合的初始速度和融合程度，转染了重复的CV-1细胞组，以表达不同表面密度的SV5 F蛋白质和恒定量的唾液酸结合蛋白，在本例中为流感病毒HA。使用F特异性MAb F1a对一组平板进行流式细胞术处理，以便确定表面表达水平。另一组平板用于通过监测融合后R18的荧光去猝灭来确定融合动力学。R18标记的人红细胞在4°C下与CV-1细胞结合，每个细胞平均产生一到两个红细胞，将40μl红细胞受体细胞复合物注入含有3 ml预热至37°C的PBS的试管中，开始融合，并在荧光计中测定荧光去淬动力学。SV5 F蛋白的表面密度越高，融合的程度和初始速度都会增加（图。A） ●●●●。然而，在非常高的F表面密度（SV5感染细胞的120%）下，观察到范围和初始速率都降低（数据未显示），这与使用β-半乳糖苷酶融合试验时发现的结果一致。
SV5 F蛋白表面密度增加对融合率的影响。（A） 用2.5μg的pTF7.5 HA DNA和不同数量的SV5 F DNA和pGEM3X DNA转染感染vTF7-3的CV-1细胞，每6-cm直径的平板最终产生7.5μg的DNA。用重复样本进行MAb F1a流式细胞术分析。按照材料和方法中的描述进行荧光光谱分析。所示的单个曲线代表了三个独立的实验。（B） 除SV5 HN DNA被pTF7.5 HA DNA取代外，对面板A进行荧光光谱法和流式细胞术分析。（C） 用不同量的HA（A/Udorn/72[H3亚型]）DNA和pGEM3X DNA转染vTF7-3感染的CV-1细胞，得到最终量为7.5μg/6cm直径的平板。对重复样本进行MAb D6/1流式细胞术分析；结果显示为最高表达样本值的百分比。
以SV5 HN为结合蛋白，研究了不同数量SV5 F蛋白的融合动力学。在发现与流感病毒HA作为结合蛋白（每个细胞一到两个红细胞）进行最佳融合的条件下，我们发现F蛋白与SV5 HN作为结合蛋白进行的融合速度过快，无法可靠测量。因此，红细胞结合水平增加到平均每个细胞5到8个红细胞，正如之前所示，每个细胞的红细胞数量增加导致融合的初始速度降低(18). 在这些条件下，使用SV5 F和HN蛋白，观察到初始融合率和融合程度增加，SV5 F蛋白的表面密度高达SV5感染细胞表面密度的75%（图。B） ；表面密度超过SV5感染细胞表面密度75%的初始速率太快，无法准确测量。
为了直接比较SV5 F蛋白膜融合与流感病毒HA的融合动力学，转染了重复的平板以产生不同表面密度的流感病毒A/Udorn/72（H3亚型）HA。使用MAb D6/1对一组进行流式细胞术处理，以确定流感病毒HA的相对表面密度。另一组用于测定R18标记的红细胞的荧光去淬，每个细胞平均结合6到8个红细胞。通过在60秒时添加0.25 M柠檬酸来启动融合，以将样品pH值降至5.0。如前所述(18)发现初始融合率随表面密度的增加而增加（图。C） ●●●●。即使在29°C下进行融合检测（数据未显示），也未发现延迟期，这与痘苗病毒-T7聚合酶系统实现的高蛋白表达水平一致。此外，发现融合程度各不相同，与SV5F蛋白的融合程度相似，但与H2亚型HA的融合程度不同（A/Japan/305/57）(18). 添加的红细胞从0.02%到0.1%之间的变化，导致每个细胞的红细胞平均数量不同，不会影响观察到的融合程度的变化（数据未显示）。
共焦显微镜检查融合。
为了确认荧光分析获得的数据，通过共焦显微镜检查R18标记的红细胞与表达SV5 F蛋白的细胞的融合。转染两组CV-1细胞，以表达恒定量的SV5 HN蛋白和不同量的SV5F蛋白（SV5感染细胞中的0-130%）。对一组培养物进行流式细胞术分析，以确定F蛋白表面密度。对于显微镜检测，将盖玻片上的第二组培养物在37°C下用神经氨酸酶处理60分钟，然后用SYTO 12（5μg/ml；Molecular Probes）染色30分钟，SYTO 12是一种核酸特异性探针，可对所有细胞进行染色。然后将R18-标记的红细胞与培养物结合，通过添加预热的PBS并在37°C下孵育不同时间来启动融合，并通过转移到0°C来终止反应。在共焦显微镜上检查盖玻片，使用荧光素通道进行SYTO 12染色，使用罗丹明通道进行R18染色。在37°C下开始融合之前，仅表达HN的细胞或表达HN并增加F蛋白表面密度的细胞（20、60或18小时p.i.时SV5感染细胞中发现的100%）显示出类似的RBC结合水平（图。和数据未显示）。一个例外是F的最高表面密度（130%），这通常导致RBC结合较少。在37°C下孵育2.5分钟后，在检测到的所有F表面密度下检测到融合（图。A和). 融合事件的数量（图。)以及扩散到受体细胞的速率（图。A） 发现表面密度增加，高达SV5感染细胞表面密度的100%。在37°C下5分钟后，R18染料转移和扩散的程度增加，在此之后几乎没有检测到额外的融合。一个有趣且出乎意料的观察结果是，对于单独表达HN的细胞，RBC从细胞中洗脱，在37°C下15分钟后几乎完全丧失，而对于表达仅引起低程度融合的F蛋白量的细胞（SV5感染细胞在18小时p.i.时F的20%），未融合红细胞在37°C下保持结合长达15分钟（检查的最长时间）（图。B） ●●●●。这一观察结果表明，即使没有发生可检测的融合，F蛋白的存在也阻止了红细胞从细胞中释放。
共焦显微镜检查融合。用2.5μg SV5 HN DNA和增加数量的SV5 F DNA和pGEM3X DNA转染感染vTF7-3的CV-1细胞的6厘米直径培养皿，无论有无盖玻片，最终产生7.5μg DNA。在无盖玻片的平板上使用MAb F1a进行流式细胞术分析，一式两份。按照材料和方法中的描述进行共焦显微镜分析。（A） 不同时间点（分钟）共聚焦图像的代表部分（完整视野的四分之一），用于在18小时p.i.时观察到表达60%或100%SV5感染细胞中SV5 F蛋白表面密度的细胞（B）来自仅表达HN（无SV5 F）细胞的代表共聚焦图像或表达20%SV5 F蛋白表面密度的细胞，在18小时p.i.时观察到SV5感染细胞。
通过共聚焦显微镜对融合进行定量。融合事件的数量由共焦显微镜图像分析确定，如图所示。在融合事件的计数过程中使用罗丹明通道的数据，以便对即使少量染料扩散的情况进行适当量化。每个时间点至少统计三个完整字段。
讨论
虽然关于流感病毒HA蛋白在低pH值下促进膜融合的机制已有很多研究（参考文献综述25)病毒在中性pH下与质膜融合的机制仍不太清楚。副粘病毒介导的细胞融合是在中性pH条件下促进融合的一个较好的模型系统。然而，这里提供的数据清楚地表明，副粘病毒之间在有效融合促进所需的F和HN蛋白之间的适当比例的相对重要性方面存在重大差异。对于SV5，HN蛋白表面密度超过15倍的差异对SV5 F蛋白促进的融合程度没有影响。这些数据表明，对于SV5，HN蛋白在融合过程中不起直接作用，这一结论与先前的观察结果一致，表明SV5 F蛋白可以在缺少其同源HN蛋白的情况下促进融合(三,5,6,29,43,45). 然而，融合动力学的检查在这里和之前都有介绍(三,5)表明SV5 HN蛋白可以提高SV5 F蛋白促进的融合初始速度。由于SV5 F与HN蛋白的比率对于融合并不重要，并且其他结合蛋白可以替代HN（参考文献5和图。)似乎有理由认为，SV5 HN蛋白共表达时观察到的初始融合率的提高是由于HN能够优化SV5 F蛋白促进融合的条件，可能是通过在靶细胞和受体细胞之间提供最佳距离。
HPIV-3 F蛋白促进的融合，至少在最初阶段，似乎与SV5观察到的融合在力学上不同。以前已经表明，HPIV-3 F蛋白需要其同型HN蛋白来促进融合(5,29,30). 这里提供的数据表明，这两种蛋白的比率直接影响HPIV-3 F蛋白促进的融合程度，当蛋白以等摩尔比率存在于表面时，融合最有效，如在HPIV-3感染细胞中发现的那样。有人认为HN与其受体唾液酸的结合可能反过来触发F的构象变化，从而释放融合肽（参考文献综述34)当蛋白质以等摩尔比存在于细胞-细胞连接处时，这种HN-F相互作用最有效，这似乎是合理的。
SV5 F蛋白驱动融合反应的几个方面似乎与流感病毒HA驱动融合反应相似。发现随着SV5 F蛋白表面密度的增加，细胞-细胞融合的初始速度增加。还观察到流感病毒HA蛋白具有较高表面密度的初始融合率增加（参考文献18和图。C） ●●●●。这一发现表明，F蛋白的表面密度越高，融合孔越大。随着融合程度的增加，无法从荧光光谱数据中确定SV5 F蛋白促进的融合过程中形成的多个微孔是否位于单个或多个RBC和受体细胞之间。然而，当用共焦显微镜检查融合时，随着SV5 F蛋白表面密度的增加，RBC细胞事件的数量和单个RBC的染色扩散率均增加，这表明融合的初始速率的增加是由于单个RBC和受体细胞之间的多个孔以及多个RBC受体细胞融合事件。
观察发现，在细胞表面表达F蛋白可以阻止表达F和HN的细胞释放红细胞（图。B） 表明SV5 F蛋白在融合启动前与靶细胞相互作用。这种相互作用可能代表F蛋白与特定受体的相互作用，也可能是F蛋白融合肽插入靶膜的结果，这种相互作用已被证明与流感病毒HA在没有唾液酸结合的情况下导致稳定的细胞间相互作用(13). 在低表面密度下，有足够的F蛋白与靶细胞相互作用以促进这种初始相互作用，但不足以有效促进融合，这表明，正如流感病毒HA介导的融合所建议的那样，SV5 F蛋白需要多个寡聚体来促进融合。
在分析融合动力学时，即使在30°C（可测量SV5 F蛋白促进细胞间融合的最低温度）下进行荧光光谱测定，我们也没有观察到在任何检测的表面密度下开始融合之前的延迟（数据未显示）。流感病毒HA介导的融合在融合开始前表现出滞后性(14,18,20,37,57)，Semliki Forest病毒E2E1(8)和水泡性口炎病毒G蛋白(15)以及仙台病毒与细胞融合期间(27). 流感病毒HA促进的膜融合的滞后期已被证明取决于HA的表面密度(14,18)并被假设为代表三聚体在低氢诱导构象变化后在融合孔积聚所需的时间。这里测试的SV5 F蛋白的表面密度很可能高到足以防止检测到滞后期，因为在检测用该系统表达的流感病毒HA时没有检测到滞后阶段。这一发现与之前的观察结果一致，这些观察结果表明，流感病毒颗粒（含高表面密度HA）与靶细胞之间的融合滞后期非常短暂，就像水疱性口炎病毒G蛋白介导的融合滞后阶段一样，只有通过停流技术检查后才能检测到(14,15). 最后，SV5 F蛋白三聚体可能在4°C培养期间发生任何必要的结合，导致转移到37°C后立即融合。在这方面，已经证明流感病毒HA可以在0°C下以非常低的速率促进融合(57)，表明一些病毒融合蛋白的结合可以在低温下发生。
SV5 F蛋白促进的融合程度明显取决于蛋白质的表面密度，这由三种不同的融合定量方法判断（图。,、和). 以前已经证明，仙台病毒（另一种副粘病毒）的F蛋白的横向迁移对细胞间融合至关重要(24)仙台F蛋白在细胞间接触区域短暂积累(1)在细胞与细胞接触5分钟后出现最大积累，随后是分子扩散。我们的结果表明，必须存在SV5 F蛋白的阈值局部密度，才能在接触区域有足够的三聚体积累，因为即使在检测到的最低表面密度下，细胞表面也存在许多三聚体F蛋白，但很少出现融合事件。此外，由于在长持续时间（β-半乳糖苷酶）和短持续时间（荧光分光光度计和共焦检查）的融合检测中发现了程度上的差异，结果表明，延长时间并不能克服F表面密度降低对融合程度的影响。此外，多次检测的结果表明，较高水平的SV5 F蛋白的表达在融合的程度和初始速度上都受到抑制。这种抑制不是由于表面存在未分离的F蛋白，因为用外源胰蛋白酶处理并没有减轻高水平F蛋白的抑制作用，也没有降低高水平F蛋白质检测到的HN蛋白水平。共焦分析中，当F蛋白水平高于SV5感染细胞中100%水平时，检测到的红细胞结合量略低，这可能表明高水平的F蛋白可能会干扰HN蛋白的功能。或者，在高浓度下，F蛋白可能具有较慢的流动性或自结合，导致融合事件更少。最后，在F蛋白的高表面密度下，三聚体F蛋白激活所需的一种尚未识别的细胞受体可能饱和。
正如SV5 F蛋白所示，融合程度随流感病毒A/Udorn/72 HA表面密度的增加而变化（图。C） ●●●●。流感病毒X-117 HA的融合程度也发生了变化，其中温度、pH或尿素浓度的升高会导致不同数量的活化HA(11). H2亚型HA（A/Japan/305/72）的荧光去淬实验表明，表面密度的差异对融合程度没有影响(18)尽管在用脂质体融合试验对表达H2亚型HA的细胞株进行实验时，观察到融合程度存在差异(20)，表明分析之间存在差异。此外，这里给出的结果与达涅利及其同事的结果之间可能存在差异(18)是本文检测的较高表面密度或两个系统之间脂质迁移率差异的结果。然而，使用的HA亚型似乎也是一个重要因素。流感病毒H2亚型HA在低pH下孵育不会灭活(20)蛋白酶敏感性和MAb反应性研究表明，这种HA（H2亚型）可以作为稳定的中间产物存在(46)在没有靶膜的情况下。流感病毒H3亚型HA，包括Udorn株、X-31株和X-117株的HA，在低pH条件下培养灭活(31,56)在X-31 HA的情况下，这种失活已被证明与在最初低氢诱导的构象改变之后发生的构象变化有关(57). 我们认为，对于SV5 F蛋白，对于流感病毒HA的H3亚型，在假定的初始构象变化和随后的三聚体结合之间的较长时间是不能容忍的，融合孔的形成在短时间内进行，或者F蛋白进入一种无法与其他F蛋白三聚体结合的非活性构象。这种“do-or-die”方案将防止单一不适当的构象变化导致融合孔复合体。需要进一步的工作来证实这一假设，并确定其他中性-pH融合蛋白促进膜融合的机制是否符合这一范式。
致谢
我们感谢Bernard Moss和Edward Berger（美国国立卫生研究院）提供的vTF7-3和pINTT7β-gal，感谢Brian Murphy和Kathleen Coelingh提供的单克隆抗体，感谢Reay Paterson、Grace Lin、Andrew Pekosz和George Leser的有益讨论。
这项工作得到了国家过敏和传染病研究所AI-23173研究拨款的支持。R.E.D.得到了公共卫生服务NRSA F32 AI-09607的支持。R.E.D.和S.B.J.是合伙人，R.A.L.是霍华德·休斯医学研究所的研究员。
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