兔原发性眼部单纯疱疹病毒感染后局部眼周疫苗比全身疫苗更有效地预防眼病

摘要

人类单纯疱疹病毒（HSV）感染很常见，发生在不同的部位，症状广泛，从隐性脑炎到危及生命的脑炎(2,三). HSV感染粘膜表面，最常见的是生殖器、口腔或眼睛感染。90%以上的眼部HSV感染是由1型HSV（HSV-1）引起的。眼部HSV-1感染可导致角膜炎症和疤痕形成，因为对该病毒的免疫反应不完全明确(1,7,14,27,32). 这种疤痕是角膜失明的主要原因(22,35). 在发达国家，HSV是最常见的严重病毒性眼睛感染，也是感染性失明的最常见原因(22). 在美国，每年约有50万人患有原发性或复发性眼部HSV，需要医生就诊和药物治疗(22). 在美国，每年有1000多例角膜移植是HSV疤痕形成的直接结果(22,35).

兔实验性原发性和复发性眼部HSV-1感染与人类自然发生的感染具有许多共同特征。原发性感染是自限性的，以良性暂时性感染性结膜炎为特征。角膜感染始于上皮性角膜炎，它以树突（神经元样）和后来的地理（变形虫样）模式破坏角膜上皮。当角膜炎及其伴随的病毒诱导的免疫介导的炎症扩散到角膜的深层（基质）时，角膜（暂时）变得浑浊。虹膜炎（虹膜和前房发炎）通常只发生在患有严重角膜炎的眼睛中。角膜混浊和虹膜炎随之而来，且较上皮性角膜炎少见。在兔子和人类中，HSV-1上皮性角膜炎及其树突和地理传播是疱疹性角膜感染的特征。事实上，在临床上，树突溃疡是病理性的（即特定疾病的特征或症状），诊断HSV感染不需要实验室确认。因此，在本报告所述的研究中，上皮性角膜炎是最相关和最重要的眼病参数。

美国食品和药物管理局批准的治疗原发性HSV-1眼部感染的唯一药物包括局部抗病毒药物idoxuridine、vidarabine、trifluorothymidine以及口服阿昔洛韦。在美国以外，也使用局部阿昔洛韦。直到最近，人们还很少关注针对眼部HSV-1感染的疫苗的开发。几乎所有关于HSV疫苗开发的工作都集中在生殖器HSV-2问题上。利用重组DNA技术开发了定义明确的疱疹病毒糖蛋白亚单位疫苗。当在小鼠和豚鼠的HSV-1和HSV-2疾病模型中预防性使用时，这些疫苗提供了保护性免疫(2,8–11,34,36,37).

局部免疫可能对粘膜表面（如眼睛）特别重要。此外，以前在非眼部感染的HSV-1不能预防眼部HSV-1的非原发性首次发作(4)或防止复发性眼部HSV-1感染。因此，有兴趣确定眼部疫苗接种是否比全身疫苗接种更有效，以预防高致病性HSV-1株（McKrae）眼部攻击后兔子的原发感染和由此引起的眼病。使用了两种不同的疫苗，预计都不太理想。无论给药途径如何，这两种疫苗都能对致命的眼部挑战提供保护。然而，在全身注射时，这两种疫苗都没有对眼部疾病提供任何保护。相比之下，这两种疫苗在眼周注射时都能预防眼部疾病，从而支持了以下观点：在预防眼部疾病方面，眼部免疫比全身免疫更重要。

材料和方法

结果

用gB2/gD2亚单位疫苗或活KOS（一种在兔子体内不会产生眼病的非传染性HSV-1毒株）对几组幼稚兔子进行全身或眼周免疫。五个实验组如下：KOS眼用疫苗，11只家兔；KOS系统疫苗，15只兔；gB2/gD2眼用疫苗，15只兔；gB2/gD2系统疫苗，15只家兔；对照组（全身佐剂）16只。

防止死亡。

最后一次疫苗接种三周后，用HSV-1 McKrae对兔子进行眼部挑战。无论接种途径如何，每种疫苗的死亡率保护都是相似的（图。​（图1）。1). KOS疫苗明显比对照组更有效(P（P）=0.008[眼部]和0.002[全身]；费希尔精确测试）。单个gB2/gD2疫苗组的存活率没有显著高于对照组(P（P）=0.14[全身]和0.054[眼部]；费希尔精确测试）。然而，由于两个gB2/gD2疫苗组相似，可以将数据结合起来以提高分析的能力。与模拟接种相比，这带来了显著的保护(P（P）= 0.036; 费希尔精确测试）。

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图1

HSV-1 McKrae眼部攻击后接种兔的存活率。按照材料和方法中的描述，用gB2/gD2或HSV-1 KOS对兔子进行静脉或眼内接种。模拟接种对照组（Cont）经静脉注射佐剂。最后一次接种后三周，所有兔子均接受2×10的挑战⁵HSV-1 McKrae双眼PFU如材料和方法所述。挑战后3周确定存活率。每条横线上方的比率表示存活兔子的数量/受到挑战的兔子的数量。比较如下：眼周HSV-1 KOS组与模拟对照组(P（P）=0.008[Fisher精确试验]；系统性HSV-1 KOS组与模拟对照组(P（P）= 0.002); 眼周gB2/gD2与模拟(P（P）= 0.054); 系统性gB2/gD2与模拟(P（P）= 0.14); gB2/gD2组合组与模拟组(P（P）=0.036[双面Fisher精确试验]；P（P）=0.02[单面费希尔精确试验]）。

防止结膜炎。

在检查的任何一天，模拟接种的兔子和全身接种gB2/gD2或KOS的兔子的结膜炎平均严重程度没有差异（图。​（图2A）2A）(P（P）> 0.05; 学生吨测试）。与系统接种相比，当接种途径为眼周时，gD2/gB2亚单位和KOS活疫苗似乎都能预防结膜炎。在接种KOS眼疫苗的兔子中，结膜炎的平均峰值严重程度（眼部激发后第5天）显著低于对照兔子和接种KOS的兔子（图。​（图2B；2B类；P（P）分别=0.048和0.004；学生吨测试）。接种gB2/gD2的兔眼结膜炎似乎也比对照兔少，但差异没有达到统计学意义(P（P）= 0.08; 单面）。然而，接种gB2/gD2疫苗的兔的结膜炎明显少于接种gB2/gD2疫苗的兔（图。​（图2B；2B类；P（P）= 0.008). 因此，对于这两种疫苗，与全身疫苗相比，眼部疫苗对结膜炎的预防作用显著增强。

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图2

预防眼部疾病。将兔子全身或眼周接种三次疫苗，并对其进行眼部攻击，并在第3、5、7、10和14天监测眼病，如材料和方法中所述。每个时间点代表接种或模拟接种兔子（眼部KOS疫苗，11只兔子；全身KOS疫苗（15只兔子）；眼部gB2/gD2疫苗，15只兔子；系统性gB2/gB2疫苗，十五只兔子；佐剂对照，十六只兔子）的11至16只兔子双眼的平均读数。单个星号表示在95%水平上显著低于模拟疫苗对照组的分数，使用Student吨测试；双星号表示眼周疫苗组的数值明显小于相应的全身疫苗组的值。统计分析是在每个实验室的基础上进行的。因此，对每只兔子的双眼读数进行平均，并将每只兔子得出的值用于分析（即。，n个每组是兔子的数量，而不是眼睛的数量）。当以每眼为基础进行分析时（未显示），相同的组显示出统计显著性。

疫苗免疫原性。

所有兔子在最后一次接种疫苗后3周，即用HSV-1攻击之前，都放血。对所有血清分别进行中和和ELISA（针对HSV-2和HSV-2糖蛋白）（表​（表11和​和2）。2). 无论接种途径如何，两种疫苗诱导的HSV-2中和抗体滴度均显著高于佐剂对照组（表​（表11和​和2）。2). 在这两种疫苗中，系统接种显示出比眼部接种诱导更高的中和抗体滴度的趋势，但差异没有统计学意义。

表1

疫苗诱导的体液免疫反应

疫苗（兔子数量）	滴定度（几何平均值±SD）一
	中和b条	gD2酶联免疫吸附试验	gB2酶联免疫吸附试验
KOS目镜（10用于中和，8用于ELISA）	39* ± 18	4,768 ± 4,630	12,617 ± 2,945
KOS系统（12）	101* ± 81	8,571 ± 4,586	13,233 ± 10,363
gB/gD目镜（13）	303 ± 115	17,108 ± 9,657	20,698 ± 11,972
gB/gD系统（14）	430 ± 357	27,097 ± 14,962	73,151 ± 67,048
佐剂对照（13）	24*	34* ± 16	45*±34

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^一星号后面的中和滴度包括一个或多个<24的值，即检测基线。为了确定平均值和进行统计分析（表​（表2），2)，24被替换为<24。带有星号的ELISA滴度包括一个或多个<30的值，即该检测的基线值。为了确定平均值和进行统计分析（表​（表2），2)，30被替换为<30

^b条对HSV-2进行中和试验

表2

表中数据的统计分析1

比较	P值一
	中和	gD2酶联免疫吸附试验	gB2酶联免疫吸附试验
KOS目镜vs控制	0.03	<0.0001	<0.0001
KOS系统与控制	0.003	<0.0001	<0.0001
KOS眼部vs KOS全身	0.07	0.016	0.85
gB/gD眼部vs对照	<0.0001	<0.0001	<0.0001
gB/gD系统与对照	<0.0001	<0.0001	<0.0001
gB/gD眼部vs gBgD全身	0.46	0.069	0.0004

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^一通过Mann-Whitney秩和检验确定。 

两种疫苗诱导的抗gB2和gD2的ELISA滴度均显著高于对照疫苗水平，而与接种途径无关（表​（表11和​和2）。2). KOS系统接种诱导的平均gD2-ELISA滴度显著高于同一疫苗眼接种诱导的滴度。KOS诱导的gB2-ELISA滴度在系统接种后也略有升高，但差异不显著。用gB2/gD2系统接种诱导的平均gB2-ELISA滴度显著高于用gB2/gD2眼部接种诱导的滴度。用gB2/gD2进行系统接种似乎也能诱导更高的针对gD2的ELISA滴度，但这种差异没有统计学意义。因此，与同一疫苗的眼部接种相比，系统接种倾向于诱导更强的中和抗体滴度和更强的ELISA滴度。

为了检查对疫苗接种和激发的局部眼部免疫反应，将各组兔子接种一次疫苗，无论是眼周还是全身，然后如上所述进行眼部激发。ELISA在不同时间测定gD2特异性泪液sIgA（图。​（图3）。三). 第3至21天的每个点代表每组10至14只眼的平均眼泪滴度。在挑战后第3天，两个疫苗组相似，HSV-1特异性泪液sIgA显著高于模拟组（目测组与模拟组，P（P）=0.045[单侧学生吨测试]；系统与模拟，P（P）=0.01[Mann-Whitney秩和检验]）。这一发现表明，在两个接种组中，启动的sIgA反应都有早期刺激作用。眼科和全身疫苗组之间，或任何疫苗组和模拟组之间在任何其他时间均无显著差异。然而，在HSV-1特异性泪液sIgA反应高峰时（挑战后第10天），模拟组的sIgA-多于任何一个疫苗组，系统疫苗组的sIgA-多于眼部疫苗组。这一结果与疫苗的保护效果相反。

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图3

单纯疱疹病毒特异性撕裂sIgA。按照材料和方法中的描述，用gB2/gD2对兔子进行一次全身或眼周免疫，并在21天后进行眼部激发。在指定的时间采集眼泪，并通过ELISA测定单个眼泪样本中HSV-1 gD2特异性sIgA的相对量。箭头表示接种疫苗（第21天）和眼部挑战（第0天）。星号表示两个疫苗组的ELISA滴度均显著高于模拟疫苗组(P（P）< 0.05).

讨论

我们之前的研究表明，用佐剂MF59/MTP-PE中的gB2/gD2对潜伏感染的兔子进行眼周疫苗接种，可以对复发性HSV-1提供治疗保护，这是通过眼部自发复发病毒脱落的统计学显著减少来判断的(23)和自发性复发性角膜疾病(24). 本研究比较了眼周疫苗和全身疫苗预防原发性眼部HSV-1感染的能力，作为我们调查眼周疫苗对原发性和复发性眼部疱疹感染的作用和疗效的一部分。用于眼周疫苗接种的结膜下途径允许使用佐剂，并确保疫苗在当地交付和保存。结膜下注射是临床眼科常用的方法。

在这项研究中，选择了两种预期不完全有效的疫苗。之所以这样做，是因为其目的是确定局部眼周免疫接种是否比全身免疫接种提供更好的眼部保护。显然，无论疫苗途径如何，对眼部疾病都能提供100%保护的疫苗都不允许我们轻易确定哪种途径更有效。使用活疫苗和亚单位疫苗来确定所发现的任何路线特异性对于不同类型的疫苗是否一致。

带有MF59的gB2/gD2被选为次优亚单位疫苗，因为这两种糖蛋白都是2型而不是1型（McKrae挑战病毒是1型），而且佐剂缺乏我们最近成功的治疗性疫苗研究中添加的免疫刺激剂MTP-PE(23,24). 本研究选择无毒HSV-1 KOS株作为不太理想的活疫苗，因为与其他可用的野生型HSV-1株（例如用作攻击病毒的强毒株McKrae）相比，其在兔子体内复制和传播的能力较低。因此，预计HSV-1 KOS将是一种次优的HSV-1活疫苗。这一假设得到了一项小型试点研究的支持，该研究表明，用HSV-1 McKrae系统接种但不接种HSV-1 KOS的兔子可以完全预防眼病（未显示）。

与HSV-1诱导的眼部疾病的系统性疫苗相比，眼周疫苗的效力有所提高（总结见表​表3）三)更令人印象深刻的是，为了加强眼睛接种疫苗所观察到的任何增强保护作用都有意义的可能性，疫苗接种偏向于全身接种。因此，低剂量的gB/gD用于眼周注射（每只眼睛7.5μg每种糖蛋白，而系统注射25μg每一种糖蛋白），低剂量病毒和较少的HSV-1 KOS眼周接种（2×10⁵PFU/眼与2×10⁷PFU系统化；两次眼周免疫和三次全身免疫）。由于这些研究专门选择了次优疫苗，即使是眼部疫苗也不一定能对眼部疾病提供显著保护。然而，在所有检测到全身和眼周途径疫苗在眼部保护方面存在差异的情况下，局部眼周疫苗的效果更好。

根据中和和ELISA滴度判断，本研究中使用的两种疫苗在通过全身途径（i.m.或皮下）接种时诱导了更强的体液免疫反应，而不是通过眼部途径（局部在角膜或结膜下注射）。这一发现表明，在原发性HSV-1感染的兔眼模型中，疫苗诱导血清中和滴度和血清ELISA滴度的能力不能预测疫苗对眼病的效力，并且支持疫苗对眼病的效力是由于局部/粘膜免疫而不是全身免疫的假设。

这些疫苗诱导HSV-1特异性泪液sIgA的能力似乎也不能预测疫苗对眼病的疗效。事实上，有一种相反的趋势。与更有效的眼部疫苗接种相比，系统性疫苗接种倾向于产生更高的泪液sIgA滴度峰值。此外，模拟疫苗组家兔眼部激发后产生的泪液sIgA滴度峰值往往高于两种疫苗组。这种类型的结果是，在眼部激发后，保护最差的组出现最高的局部眼部免疫反应，这表明较高的免疫反应是由于疫苗的效力较差，病毒在眼睛中复制更多的结果。当然，这可能会使特异性免疫反应与疫苗效力的相关性复杂化，并且与我们之前在小鼠身上的一些发现类似，在小鼠眼部HSV-1攻击后，在接种了更有效疫苗的小鼠角膜中检测到的浸润免疫细胞较少(14).

有趣的是，无论疫苗途径如何，疫苗对死亡率的效果都是相似的。因此，针对眼病的疫苗效果似乎需要眼睛的局部或粘膜免疫反应，而针对死亡率的疫苗效果可以通过系统免疫获得。系统免疫可以通过减少病毒在三叉神经节或大脑中的复制，或减少病毒在眼睛和三叉神经节之间或三叉神经神经节和大脑之间的传播，从而防止病毒性脑炎引起的死亡，而不会减少眼疾。

各种不同的免疫反应被认为在保护小鼠眼睛免受HSV-1感染方面最为重要。CD4细胞⁺T细胞和CD8⁺据报道，T细胞可以保护眼睛免受HSV-1感染，并与HSV-1眼部疾病有关(6,13,15,16,19,27,28,33). 在小鼠模型中，疫苗诱导抗HSV-1血清抗体滴度的能力与疫苗对HSV-1眼部感染的疗效之间存在非常强的相关性(5,12). 即使腹腔注射中和抗体也能完全阻断HSV-1诱导的眼部疾病(18,39). 相反，在本报告中，我们没有发现血清抗体与兔的眼部疾病防护之间存在任何相关性。人类的血清抗体似乎也没有对眼部HSV-1、，由于眼部HSV-1复发率高的个体通常会产生非常高的HSV-1中和抗体滴度，但仍会继续复发。因此，保护小鼠眼睛免受HSV-1感染的免疫反应（和疫苗效力）似乎不能预测疫苗在人类中的效力。特别是，由于血清抗体本身可以保护小鼠眼睛免受眼部HSV-1的感染，因此，将小鼠模型作为了解眼部HSV-1疫苗效力的唯一依据，可能会导致我们低估疫苗诱导的人类局部/粘膜免疫的重要性。因此，尽管兔免疫学的最新研究水平仍明显落后于小鼠，但兔可能是研究针对原发性和复发性眼部HSV-1疫苗效力的更有用模型。

为什么体液免疫保护小鼠眼睛而不是兔或人的眼睛免受眼部HSV-1感染？一种可能性是老鼠眼睛的尺寸较小。在兔子和人的角膜中，毛细血管仅见于角膜外1毫米处，有效地将中央角膜与循环免疫因子隔离开来。在小鼠中，毛细血管也局限于角膜外1毫米处。然而，由于小鼠角膜比兔子和人类的角膜小，循环免疫因子可以从这些外围毛细血管迅速扩散到中央角膜，从而使血清抗体保护小鼠角膜。

与小鼠相比，分析兔子的细胞介导免疫和眼粘膜免疫因子（泪液sIgA除外）的能力仍处于初级阶段。因此，在本研究中，负责疫苗对HSV-1诱导的眼部疾病有效性的局部/粘膜免疫因素尚未确定。虽然本文报道的sIgA分析表明泪液sIgA-不是抵抗原发性HSV-1眼部挑战的关键保护性免疫反应，但使用复发性眼部HSV-1疫苗模型的初步研究表明，泪液sIgA可能在抵抗复发性眼HSV-1方面发挥作用。

致谢

参考文献