水泡性口腔炎病毒（VSV）是一种非片段的负链RNA病毒，是鼠疫病毒科家庭。11 kb的VSV基因组编码五种结构蛋白：核衣壳（N）、磷酸蛋白（P）、基质（M）、糖蛋白（G）和RNA依赖的RNA聚合酶（L）。蛋白质的表达水平按照从病毒基因组的3′近端到5′近端的转录顺序逐步减弱(17).
VSV是家畜的自然病原体，可能通过节肢动物媒介传播(10). 尽管VSV可导致牲畜的重大疾病，包括口、蹄和乳头周围的水泡损伤和产奶量减少，但这种疾病很少致命(7). 在流行性疾病的农村地区和实验室环境中接触VSV的个人中观察到人类VSV感染(13). 在人类中，VSV感染通常是无症状的。然而，包括寒战、肌痛和恶心在内的发热性疾病与人类VSV的一些症状病例有关(8,10,11,13). VSV除了感染人类和牲畜外，还感染许多不同的物种。存在VSV感染小鼠模型，其中易感小鼠在感染后12天内出现后肢麻痹和致命脑炎。VSV在小鼠中的发病率、发病程度和致死率取决于多种因素，包括病毒株、接种途径和滴度以及小鼠的年龄和性别(1,9).
1995年，Lawson等人首次报道了一种从质粒DNA产生重组VSV的系统(18)，其他人随后也报告了类似的结果(22). 自那时以来，我们的实验室已将VSV开发成一种高效表达载体，并报道了几种表达外源蛋白的重组VSV的回收(12,15,22,23). 随着这种产生重组VSV的系统的出现，我们已经开始探索VSV作为重组疫苗载体的潜力。
VSV的某些特征表明，表达外源病毒糖蛋白的重组VSV将是非常好的候选疫苗。VSV在许多体外细胞系中生长到非常高的滴度（>109PFU/ml），并在体内引发强烈的体液和细胞免疫反应(7,24,25). VSV在粘膜表面自然感染，粘膜免疫已被证明可引起粘膜和系统免疫(16,19,20). 此外，普通人群中VSV血清阳性率低(三)在人类中缺乏严重的致病性是在人类中使用重组VSV疫苗的一些可能优势。
基于活VSV重组体的疫苗也比其他活重组疫苗载体具有优势。与来自痘病毒科该家族编码数百种蛋白质（包括免疫逃避和免疫抑制蛋白质），VSV基因组相对简单，更容易理解和操作。与病毒的分段基因组相比正粘病毒科家族中，VSV的单链基因组不进行重配，因此不能在体内与野生型病毒重配。细胞质复制、VSV缺乏基因重组以及能够在基因组中容纳大量插入物和多个基因是VSV作为重组疫苗载体的额外属性。
最近报道了一种表达甲型流感病毒血凝素（HA）蛋白（VSV-HA）的VSV(15). 因为能够中和流感病毒的抗体直接作用于HA蛋白，而且HA抗体足以保护动物免受疾病的侵袭(5,17)，我们选择检测重组VSV-HA作为抗a/WSN/33（H1N1）流感病毒（小鼠适应株）疫苗的潜力。流感病毒HA蛋白在重组痘苗病毒和重组委内瑞拉马脑炎病毒中的表达（痘病毒科和多哥病毒科已成功证明使用小鼠模型系统评估流感病毒载体疫苗(2,6). 尽管在VSV载体成为可行的流感病毒候选疫苗之前可能需要对其进行修改，我们采用小鼠模型系统，并证明了鼻内给药的VSV-HA能够引发对表达的流感病毒HA蛋白的体液免疫反应，并提供对致命流感病毒攻击的保护。此外，我们报告了与疫苗载体相关的致病性降低（重组野生型VSV与印第安纳野生型VSV-相比）以及含有VSV表面糖蛋白细胞质尾部截短的载体的进一步衰减(21).
材料和方法
病毒和接种物。
重组野生型VSV（VSVrwt）、VSV-CT1、VSV-CT 9和表达流感A/WSN病毒HA蛋白（VSV-HA）的重组VSV在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中的BHK细胞上生长（含我-谷氨酰胺、丙酮酸钠、高糖和碳酸氢盐浓度[3.7 g/升]；产品编号56-499；GRH Biosciences，Lenexa，Kans.），含5%胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素（PS；100 U/ml）。通过标准菌斑试验测定解冻库存的病毒滴度。使用1%甲基纤维素-1×DMEM（含5%FBS和PS）覆盖物对BHK细胞进行两次菌斑分析。重组VSV在接种前立即解冻并用DMEM（无血清）稀释至适当的滴度。流感A/WSN/33（H1N1）病毒（5.3×107如Castrucci等人所述，用于挑战的PFU/ml）在MDBK细胞中生长(4). 在激发前立即解冻A/WSN流感病毒，并以50μl总体积未稀释的方式给药。用于中和试验的流感A/WSN病毒在补充有10%FBS和PS的DMEM中的MDBK细胞上生长，滴度通过使用1%琼脂糖-1×DMEM（无血清）-胰蛋白酶-甲苯磺酰基苯丙氨酸氯甲基酮（3μg/ml）覆盖物的MDBK细胞上的标准斑块试验测定。病毒、DMEM（无血清）或磷酸盐缓冲盐水（PBS）按如下所述经鼻给药。
接种小鼠。
来自Charles River Laboratories的5至6周龄雌性BALB/c小鼠在抵达时被安置在过滤隔离笼中。小鼠在到达后4天内接种。接种前（第0天），用Metofane（甲氧基氟烷；Mallinckrodt Veterinary，Inc.，Mundelein，Ill.）对小鼠进行轻度麻醉，并用耳塞进行标记。用200-μl移液管将接种物（25μl）滴鼻给每只麻醉小鼠，并在Sartorius天平（1409型）上用塑料烧杯将小鼠称重至±0.02 g。除非另有说明，否则在第21天以与相同种类、滴度和体积的病毒相同的方式给药。激发剂量也按所述进行给药，但总体积为每只小鼠50μl（第35天或第21天）。每天对小鼠进行称重，但不进行麻醉。
中和分析和50%斑块减少。
将接种了相同病毒制剂（或DMEM）的小鼠的血样汇集在一起，并在室温下凝固。去除凝块，并在TOMY MTX-150离心机（TMA-11固定角转子）中以5500 rpm在4°C下离心15 min。将澄清的血清转移到无菌Eppendorf试管中，并在56°C下热灭活30至60分钟。用PBS在96 well板中连续两倍稀释液中稀释热激活的血清。通常，将50μl血清与50μl PBS混合，然后转移50μl进行连续稀释。等体积（50μl）的流感A/WSN病毒（～1.4×10三然后将PFU/ml）添加到剩余的50μl稀释血清中并混合。将含有病毒和血清的96-well板在37°C下培养30至45分钟。将病毒-血清溶液从96-well板转移到6孔板中MDBK细胞的融合单层。用150μl DMEM清洗96孔板的每个孔，然后转移到6孔板中的相应孔中。在室温下摇晃六孔板30至60分钟，抽吸培养基，并向每个孔中添加3 ml覆盖层。平板在37°C下与5%CO孵育2持续2天。在每次试验中，血清被稀释并分析两次，每次试验至少重复一次。中和滴度是指与对照组相比，斑块减少至少50%的稀释液。中和滴度报告为所有分析的平均值。
还进行了中和试验，以获得对载体病毒的血清抗体滴度。如前所述进行测定，但血清在VSVrwt存在下孵育，中和滴度通过对BHK细胞的病毒细胞病变效应（CPE）的完全抑制来确定。
尸检和组织准备。
小鼠因一氧化碳窒息2用10%中性缓冲福尔马林通过21号针头的气管给肺部充气。在中性缓冲福尔马林中过夜固定后，将组织包埋在石蜡中，切片并用苏木精和伊红染色。使用奥林巴斯显微镜和Techpan薄膜进行光学显微镜检查，原始放大倍数为×400。
结果
初步实验证明了VSV-HA能够诱导对HA的抗体反应，包括对流感A/WSN病毒（和VSVrwt[载体病毒]）的中和抗体，并保护其免受致命的流感A/WSN病毒攻击（数据未显示）。在这些初步研究中，小鼠通过腹腔途径接种活的或紫外线激活的VSV-HA或VSVrwt，在初次接种后3周腹腔内给予增强剂量，并在增强2周后鼻内注入50μl流感A/WSN病毒。接种VSV-HA活疫苗的小鼠对A/WSN流感病毒的中和抗体滴度>1:2000，并可免受致命攻击。接受紫外线激活的VSV-HA（在有佐剂的情况下）的小鼠也能免受致命攻击。接受活的或紫外线激活的VSVrwt的对照小鼠没有产生流感A/WSN病毒抗体的中和滴度（尽管它们确实产生了VSV抗体的中和效度），也没有受到流感A/WSN病毒攻击的保护。
这些初步数据表明，VSV-HA可能是检测重组VSV作为潜在重组载体疫苗的有用工具。虽然通过腹腔途径接种小鼠和使用佐剂与紫外线活化病毒一起使用是研究潜在免疫原效力的常用程序，但这并不是一种理想的疫苗接种方法。这些缺陷，以及以下三个观察结果，促成了本研究所采用的策略：（i）VSV自然感染粘膜表面；（ii）流感病毒通过呼吸道自然传播；（iii）存在一个小鼠模型系统，用于小鼠鼻腔接种这两种病毒。因此，我们检测了VSV-HA在保护小鼠免受致命的a/WSN流感病毒攻击方面的效力，当接种和攻击都通过鼻内递送时。
小鼠50%致死剂量（LD）的测定50)用于活重组载体VSVrwt。
当通过鼻内途径将野生型VSV（印第安纳血清型）注射给年轻小鼠（5至6周龄）时，这些小鼠通常会出现后肢麻痹，并在接种后7至12天内死于致命性脑炎，其滴度低至104证明致命的PFU/老鼠（我们的数据和参考9). 因此，在检测重组VSV疫苗的效力之前，我们首先研究了疫苗载体的致病性。
为了确定来自质粒DNA的重组VSV是否在小鼠中致病，印第安纳野生型VSV（VSV我)或VSVrwt（重组VSV）进行斑块纯化。采集每种病毒的四个斑块，培养病毒库存，并测定滴度。6周龄雌性BALB/c小鼠经鼻接种VSV我或总体积为25μl的VSVrwt。每天称量小鼠体重，观察其是否出现体重减轻、瘫痪或死亡等疾病症状。接种VSV小鼠平均日体重的图示我图中仅显示了VSVrwt或介质。，其中数字位于x个axis表示当天死亡的老鼠数量。
病毒接种对平均体重和存活率的影响。（A） 12只6周龄雌性BALB/c小鼠被分为四组，每组三只。四株噬菌体纯化的VSV病毒我以6×10的剂量经鼻给药（一只白斑纯化小鼠/三只小鼠组）6PFU/鼠标。对照小鼠（DMEM-0）仅接受25μl培养基。在第0天接种小鼠，然后每天称重。基准点表示每日平均重量。上面的数字x个轴表示当天发现死亡的老鼠数量。误差棒，±0.5×标准偏差。（B） 与A组相同，只是小鼠在10时接种了四种纯化的VSVrwt菌株中的一种7PFU/鼠标。
接种VSV的小鼠我与接种VSVrwt的小鼠相比，小鼠经历了更大的发病率，如初始体重减轻、体重减轻恢复时间（如果有的话）、后肢麻痹发作和致死率。接受VSV的小鼠我75%的患者在4至7天内出现虚弱和瘫痪，随后在10天内死亡。VSV的25%我-所有存活下来的接种小鼠都从同一个斑点纯化的库存中获得病毒，这可能表明该库存的发病率略有下降。与接种了VSVrwt的小鼠相比，这三只存活小鼠中的两只显示出发病率增加的迹象。这两只小鼠分别减掉了20.7%和35.4%的初始体重，并在接种后9天和10天开始恢复体重。另一只小鼠的初始体重减轻了15.4%，并在交配后5天开始恢复体重（类似于接受VSVrwt的小鼠）。在接受VSVrwt的小鼠中未观察到麻痹或死亡。接受VSVrwt的小鼠初始体重的平均下降百分比为20.7%±3.1%，大多数小鼠在接种后4至6天内开始恢复初始体重下降。作为每日平均体重的对照，四只小鼠只接种了DMEM。
根据我们自己的数据和VSV的致命性数据我Forger等人报告(9)，一只老鼠LD50约106测定PFU/小鼠对BALB/c小鼠（5-6周龄）进行鼻内接种。VSV的致命性我根据病毒制剂和病毒接种物的总体积，变化不大。无LD50在相同条件下接种VSVrwt的小鼠即使滴度高出10倍（107PFU/鼠标）比LD50用于VSV我VSVrwt的衰减是明显的，尽管进一步衰减（小鼠缺乏与发病相关的体重减轻）是理想的。与VSV相比，VSVrwt的衰减我然而，这表明基于VSVrwt的载体可能被用作重组疫苗载体。
重组VSV-HA的免疫原性和疫苗效力。
确定以滴度≤10的VSVrwt载体进行鼻内接种7PFU/小鼠不是致命的，我们检测了重组VSV-HA的免疫原性。以三种滴度（104，105、和106PFU/鼠标）。对每种滴度进行检测，以确定其是否能够提高针对流感A/WSN病毒的中和抗体，并进一步评估其在保护小鼠免受致命流感A/WSN病毒攻击方面的功效。小鼠同样接种具有匹配滴度的VSVrwt或DMEM作为对照组。
将6周龄的雌性BALB/c小鼠用美托芬轻度麻醉，并用总体积为25μl的活VSV-HA或VSVrwt鼻内接种。每天观察小鼠是否有瘫痪和/或死亡迹象，但均未发生。然而，在初次接种后的头几天，小鼠确实表现得不太活跃，也不太整洁。在接种后第18天，每组两只小鼠失血。将每组出血的血清汇集在一起，进行热灭活。接受VSV-HA病毒的小鼠产生了VSV和流感A/WSN病毒的抗体，这两种抗体分别由VSV感染的BHK细胞和流感A/WSN病毒感染的MDBK细胞的间接免疫荧光检测（IFA）测定。接种VSVrwt的小鼠只产生VSV抗体。通过对MDBK细胞进行50%的斑块减少试验，还对血清中和流感A/WSN病毒的能力进行了分析（表). 接种VSV-HA的小鼠血清中含有1:512滴度的流感A/WSN病毒中和抗体，表明通过粘膜途径接种重组VSV-HA后，鼻腔内接种可提高对异源流感A/WSN病毒的系统免疫反应。通过IFA或中和试验，接种前从小鼠收集的血清未显示出对VSV或A/WSN流感的抗体。
表1
| 初始接种和增强（PFU/小鼠） | 抗体一 | NT公司b条流感A/WSN病毒感染：
| %生存c（c）挑战后 |
|---|
| 初始放气 | 第二次放气 |
|---|
| VSVrwt（106) | −WSN-HA，+VSV | <1:8 | <1:8 | 0 |
| VSVrwt（105) | −WSN-HA，+VSV | ND（无损检测） | ND（无损检测） | 0 |
| VSVrwt（104) | −WSN-HA，+VSV | ND（无损检测） | ND（无损检测） | 0 |
| VSV-HA（106) | +WSN-HA，+VSV | ≥1:512 | ≥1:1,024 | 100 |
| VSV-HA（105) | +WSN-HA，+VSV | ≥1:512 | ≥1:1,024 | 100 |
| VSV-HA（104) | +WSN-HA，+VSV | ≥1:512 | ≥1:1,024 | 100 |
在初次接种后21天给小鼠注射增强剂量，并再观察14天。与之前一样，在所有小鼠中均未观察到瘫痪和/或死亡，所有小鼠均显示健康。第32天，对小鼠进行放血，并通过IFA和中和试验对血清进行抗体测试。结果（表)与18天时获得的结果相似。第35天，用致死剂量的流感a/WSN病毒（10LD）对小鼠进行鼻内攻击100在50μl中）。在流感A/WSN病毒攻击后，再观察小鼠14天。在A/WSN流感病毒攻击后的5天内，所有接种了VSVrwt的小鼠均已死亡。接种了VSV-HA的小鼠没有死亡或出现任何疾病迹象。这些数据表明，当重组VSV表达与攻击病毒对应的外来抗原时，经鼻输送的重组VSV不仅可以有效提高系统免疫，而且可以完全保护小鼠免受致命攻击相关的发病和死亡。这些数据还表明，VSV-HA滴度低至104PFU/小鼠足以保护小鼠免受致命流感a/WSN病毒的攻击。
重组VSV-HA的致病性、免疫原性和疫苗效力。
一些观察结果导致了进一步的实验，以检验重组VSV作为疫苗载体的潜力。综上所述，与VSV相比，低滴度的VSV-HA保护致命流感A/WSN病毒攻击的能力以及VSV载体的致病性降低我建议在较低滴度下检测重组VSV-HA和VSVrwt的致病性。因此，在接种了5×10滴度的VSV-HA或VSVrwt的小鼠中，检测了其致病性（如体重减轻所示）、免疫原性（如抗体产生所示）和疫苗效力（如保护小鼠免受致命流感A/WSN病毒攻击的能力所示）4PFU/鼠标。
小鼠仅在第0天经鼻接种VSV-HA、VSVrwt或DMEM，并每天称重。首次接种后18天，每组两只小鼠放血，收集血清并进行热灭活。通过对MDBK细胞进行50%斑块减少试验，对这些汇集的血清进行中和流感A/WSN病毒滴度的检测。接种了VSV-HA的小鼠具有1:640的流感A/WSN病毒抗体中和血清滴度（表). 在第21天用重组VSV（或DMEM）增强小鼠，随后收集、汇集血清，并在第32天测定针对流感A/WSN病毒的抗体的中和滴度。接种VSV-HA的小鼠的中和血清抗体滴度为1:2560，为A/WSN流感病毒抗体。在接种前的小鼠或接种了VSVrwt或DMEM的小鼠中未检测到针对流感A/WSN病毒的中和抗体（表). 接种重组VSV的小鼠在第35天受到致命剂量的流感a/WSN病毒（50μl）的攻击。接种DMEM并增强的小鼠在第35天增强50μl DMEM，并保持为体重控制组。
表2
| 接种物一 | 接种次数 | NT公司b条流感A/WSN病毒感染：
| %生存c（c）挑战后 |
|---|
| 初始放气 | 第二次放气 |
|---|
| VSV加权 | 2 | <1:8 | <1:8 | 60d日 |
| VSV-HA型 | 2 | 1:640 | 1:2,560 | 100 |
| VSV-HA型 | 1 | 1:640 | 注e（电子） | 100 |
首次接种重组VSV的小鼠表现出体重减轻的发病迹象。如图所示。A和B的日均体重下降（0至5天）。VSVrwt-和VSV-HA-感染小鼠的初始体重减轻情况相似。接种VSVrwt和VSV-HA的小鼠的初始体重减轻百分比分别为19.3±4.5和18.1±3.4。相反，接种DMEM的小鼠的初始体重减轻百分比仅为4.4±2.0。在加强治疗后，任何小鼠（第21-23天）都没有出现显著的体重减轻，这表明对载体具有免疫力。第35天，用致死剂量的流感a/WSN病毒对小鼠进行攻击。接种了VSV-HA的小鼠完全避免了致命的攻击，因为没有明显的体重减轻（图。B） 和100%存活率（表). 相反，接种了VSVrwt的对照小鼠没有受到流感A/WSN病毒攻击的保护。这五只对照小鼠中有两只在流感A/WSN病毒攻击后5天内死亡（表). 尽管有三只小鼠在这一特定实验中存活下来，但这些小鼠的体重大幅下降（26.1±9.4%），皮毛皱巴巴，缺乏活动，病情严重，直到第44天（挑战后9天）体重才开始恢复。
接种疫苗和挑战对平均体重和存活率的影响。（A） 小鼠经鼻接种5×10的VSVrwt4第0天的PFU/老鼠。在第21天给小鼠注射等量的接种物。在第35天，小鼠受到致命剂量的流感a/WSN病毒的攻击。星号表示当天在感染A/WSN流感病毒的小鼠中发现一只小鼠死亡。（B） 与A组相同，只是小鼠接种了5×10的VSV-HA并进行了增强4PFU/鼠标。（C） 小鼠接种5×10的VSV-HA4第0天的PFU/老鼠。在第21天，用致命剂量的流感a/WSN病毒攻击小鼠。误差棒，±0.5×标准偏差。
在与上述平行的实验中，我们在第0天接受单次鼻内接种并在第21天用致命剂量的a/WSN流感病毒攻击的小鼠中检测了VSV-HA的致病性、免疫原性和疗效。这些小鼠在接种载体后最初体重减轻了17.6±2.3%（图。C） ●●●●。收集、汇总血清，并在第18天检测流感A/WSN病毒抗体的中和滴度（表). 然后在第21天用致命剂量的流感a/WSN病毒攻击小鼠。这些结果表明，即使在单次接种后，VSV-HA-免疫小鼠也能完全免受致命流感a/WSN病毒的攻击。重量损失可以忽略不计（图。C、 第21至23天），出现流感A/WSN病毒抗体的中和滴度和100%存活率（表).
VSV-HA感染可预防流感病毒诱导的支气管肺炎。
为了进一步评估对VSVrwt和VSV-HA的免疫反应，我们分别用5×10接种了上述两只小鼠4PFU/单独使用VSVrwt、VSV-HA或DMEM的小鼠，并在初次感染7天后检查小鼠的脾脏是否存在反应性生发中心。VSVrwt和VSV-HA感染小鼠的脾脏显示活跃的生发中心，表明免疫反应活跃，而DMEM感染小鼠的脾没有活跃的生发中心。来自同一小鼠的肺切片显示，VSVrwt和VSV-HA受体的支气管中有淋巴细胞浸润，表明可能存在病毒感染；接种DMEM小鼠的肺切片显示无浸润。在所有肺部切片中均未发现肺炎迹象（即肺泡间隙清晰）（数据未显示）。
上述生存分析表明，接种VSV-HA的小鼠能够完全抵抗A/WSN流感病毒的攻击，包括保护小鼠免受A/WSN病毒诱导的肺炎。为了直接评估这一点，我们检查了接种了VSV-HA的小鼠的肺部，这些小鼠受到了A/WSN流感病毒的攻击。在第0天用PBS、VSV-HA或VSVrwt分别接种两只小鼠，在第21天用相同的试剂加强，然后在第35天用流感A/WSN病毒攻击。激发后3天，处死小鼠，并对其肺部进行组织病理学检查。接种VSVrwt小鼠的肺切片（图。D） 或PBS（图。B） 和流感A/WSN病毒攻击显示出急性病毒性支气管肺炎的证据，表现为支气管上皮的细胞病变和支气管管腔和肺泡间隙的细胞碎片。感染和反应的其他迹象包括支气管周围淋巴细胞明显浸润，肺血管内血管壁及其内皮衬里明显增厚（图。B和D）。相反，接种了VSV-HA并受到流感A/WSN病毒攻击的小鼠的肺切片显示，支气管上皮完整，血管没有增厚，肺泡腔清晰（图。C） ●●●●。接种了DMEM的小鼠的肺部也没有出现病理学迹象（图。A） ●●●●。
WSN病毒攻击3天后小鼠肺部的组织病理学。小鼠接种DMEM（A）、PBS（B）、VSV-HA（C）或VSVrwt（D）并增强，然后用流感A/WSN病毒（B、C和D）或DMEM。缩写：BE，支气管上皮；五、 小动脉；A、 牙槽间隙。原始放大倍数，×400。
重组VSV-CT1和VSV-CT9的致病性和免疫原性。
这些实验证明了表达流感a/WSN/33 HA蛋白的重组VSV疫苗在保护小鼠免受致命流感a/WSN病毒攻击方面的免疫原性和完全有效性。然而，与免疫载体相关的致病性仍然令人担忧。尽管这种初始致病性是有限的（小鼠在免疫后6天内开始恢复初始体重减轻），但VSV疫苗载体的进一步衰减已得到解决。为此，我们检测了重组VSV，与VSVrwt相比，重组VSV先前在体外显示衰减（斑块大小减小，病毒滴度降低）。具体而言，两种重组VSV构建物，VSV-CT1和VSV-CT9(21)在小鼠模型系统中，对糖蛋白胞质尾部从29个氨基酸分别截断为1个和9个氨基酸的缺失进行了致病性和免疫原性检测。
6周龄雌性BALB/c小鼠用美托芬轻度麻醉，并经鼻接种总体积为25μl的VSVrwt、VSV-CT1、VSV-CT 9或DMEM。每天观察小鼠并称重（图。). 接种后14天，每组两只小鼠放血，并在每组内收集血清。同样，在接种后28天，每组两只小鼠放血，并在每组内收集血清。将这些汇集的血清进行热灭活，并通过完全抑制BHK细胞中的CPE来检测VSVrwt抗体的中和滴度（表). 中和滴度报告为在多次化验中获得的范围。
接种减毒病毒载体对平均日体重的影响。（A） 6周龄雌性BALB/c小鼠于10时经鼻接种VSV-CT15PFU/小鼠，总体积为25-μl。对照小鼠（DMEM-0）仅接受25μl培养基。在第0天接种小鼠，然后每天称重。在第14天和第28天给小鼠放血。基准点表示每组五只小鼠的平均日体重。误差棒，±0.5×标准偏差。（B） 与A组相同，但小鼠接种了VSV-CT9（105PFU/鼠标）。（C） 与A组相同，但小鼠接种了VSVrwt（105PFU/鼠标）。
表3
| 病毒接种物 | 血清滴定导致CPE完全抑制：
|
|---|
| 第14天一 | 第28天b条 |
|---|
| VSV加权 | 1:320–1:1,280 | 1:640–1:2,560 |
| VSV-CT1型 | 1:320–1:640 | 1:320–1:1,280 |
| VSV-CT9型 | 1:160–1:640 | 1:640–1:1,280 |
| 预出血c（c） | <1:8 |
接种VSVrwt（105PFU/小鼠）表现出最初发病的迹象，如之前观察到的体重减轻所示。然而，与此形成鲜明对比的是，接种了VSV-CT1（105PFU/小鼠）的体重减轻可以忽略不计，这一发现与DMEM对照小鼠的观察结果相当（图。A） ●●●●。此外，接种了VSV-CT1或DMEM的小鼠在接种后的几天内保持活跃和整洁。服用VSVrwt的小鼠在第1天到第5天的活动减少，并且梳理不良，这与体重减轻的天数相对应（图。C） ●●●●。
接种VSV-CT9（105与接种VSVrwt的小鼠相比，PFU/小鼠）表现出延迟和降低的发病率。接种VSV-CT9的小鼠的体重减轻量和体重减轻率不如接种VSVrwt的小鼠，但与接种DMEM的小鼠相比仍然显著（图。B） ●●●●。尽管VSV-CT1接种小鼠的发病机制已被消除，而VSV-CT9接种小鼠的致病机制已被降低，但在接种后14天和28天从两组收集的血清中均含有VSVrwt的中和抗体。这些中和抗体滴度与在接种VSVrwt的小鼠中获得的抗体滴度相似（表). 接种DMEM小鼠的血清和接种前3天从小鼠收集的血清在1:8的稀释度下不含VSVrwt抗体的中和滴度（测定的最低稀释度）。
讨论
用表达流感A/WSN病毒HA的重组VSV对小鼠进行鼻内接种，可保护小鼠免受同源的致命流感A/WSN病毒的攻击。通过体重减轻不足和接种小鼠的正常健康外观来衡量，这种保护在预防发病方面是完全的。保护作用与A/WSN流感病毒血清抗体中和滴度的存在以及肺部不存在病毒诱导的病理有关。重组VSV（VSVrwt和VSV-HA）在小鼠模型中的发病机制减弱，这表明高滴度病毒无法引起印第安纳野生型VSV引起的瘫痪和致命性脑炎。综上所述，这些数据表明重组VSV具有研制减毒活疫苗的潜力。此外，重组VSV-CT9和VSV-CT1载体从VSVrwt中进一步减弱，这表明小鼠的体重分别减少和可以忽略不计，但它们仍然能够引发体液免疫反应。这些数据表明，可以开发出表达外源病毒糖蛋白且无致病性、免疫原性和有效性的VSV载体疫苗。另一个好处是，这些VSV载体疫苗可以通过粘膜途径给药，产生系统免疫并免受粘膜挑战。
VSVrwt和VSV-HA的衰减基础尚未确定，但这可能是由于我们的回收试验中产生的所有VSV的重组性质所致。这些病毒来自两种VSV亚型的混合感染性克隆。在全长VSV抗原载体构建物中，L基因（编码病毒RNA依赖性RNA聚合酶）和N基因的N端49个氨基酸源自VSV的Mudd-Summers亚型（印第安纳血清组）。这与其他基因和非编码序列不同，它们来源于VSV的圣胡安亚型（印第安纳血型）。恢复的野生型VSV在组织培养中不会减弱(18)但在小鼠模型系统中，其发病机制有一定的减弱。
当考虑活重组病毒作为疫苗载体的潜力时，只要保持免疫原性，减毒载体本身的能力显然是有利的。目前的研究表明，重组VSV-CT1和VSV-CT9载体在发病机制上进一步减弱，但在单次鼻内接种后仍能引起强烈的体液反应。初步数据表明，表达HA的全减毒载体也可以保护流感病毒的攻击。
我们观察到在这些免疫研究中用作载体的VSV抗体（1:8192）具有较高的中和滴度。这些针对VSV的中和抗体仅针对VSV-G(14)并可能限制将VSV重组体用于多种疫苗应用的能力。流感病毒会经历抗原漂移和抗原转移，因此，流感病毒疫苗包含环境中存在的不同HA蛋白，预计在特定流感季节将成为主要的亚型。如果在需要每年重新接种流感疫苗的流感病毒疫苗系统中使用VSV载体，则可能需要消除对该载体的中和反应。尽管存在这种潜在障碍，但我们相信，目前的研究表明了VSV载体疫苗对外来病毒和其他外来抗原的潜在作用。
我们目前正在构建缺乏整个VSV G基因（VSVΔGs）并表达流感A/WSN病毒HA的病毒，试图制造一种高度减毒的病毒。由于缺乏VSV-G，这种病毒的出芽效率和从受感染细胞中释放应受到限制(23)流感病毒神经氨酸酶的缺乏会促进病毒从细胞中释放。此外，中和抗体应仅针对表达的HA蛋白而非VSVΔG载体。通过改变表达的附着蛋白的抗原性，同一载体传递系统（VSVΔG）很可能在单个个体中多次使用，并将提供强大的重组疫苗载体。
我们没有检测VSV-HA诱导细胞毒性T细胞反应的能力。然而，与野生型VSV一样，重组VSV有望引发强烈的细胞介导反应。在表达人类免疫缺陷病毒（HIV）包膜的VSV重组体的初步实验中，观察到了对HIV包膜蛋白的强烈细胞毒性T淋巴细胞反应(第23页). 因此，重组VSV疫苗可能有助于诱导体液和/或细胞介导的免疫。细胞介导免疫的作用也需要在多用途载体中加以解决，如拟议的VSVΔG。
减毒活重组VSV具有作为疫苗载体的潜力，可用于免疫人类对抗各种病毒性疾病，也可用于家畜对VSV本身的免疫。我们对使用重组VSV作为疫苗载体的潜力感到兴奋，并预计其将有广泛的应用，因为重组VSV中的蛋白表达不必局限于外来病毒蛋白。
