Moloney小鼠白血病病毒包膜蛋白亚基gp70和Pr15E形成稳定的二硫键复合物

摘要

小鼠白血病病毒（MLV）的包膜（Env）蛋白介导病毒颗粒与未感染细胞表面的特定受体结合，并负责病毒进入过程中病毒和细胞膜的融合(8). 在病毒粒子中，Env蛋白形成由膜锚定（TM）和表面（SU）分子组成的复合物。TM亚单位包含一个氨基末端疏水肽，被认为可以介导膜融合(10,19)而SU亚单位具有受体结合功能(2,17).

SU和TM来源于插入内质网（ER）膜的前体多肽。前体Env蛋白在运输到质膜（PM）的后期被一种细胞酶以蛋白质水解方式切割成SU和TM，病毒在质膜上组装(三,13,34). 在MLV中，SU和TM分别被指定为gp70和Pr15E，对应于它们各自的分子量。在病毒出芽期间或出芽后不久，病毒蛋白酶将Pr15E加工成p15E，该蛋白酶剪断所谓的R肽，该肽由分子的羧基末端16个氨基酸残基组成(15,38,46).

在早期的研究中，发现存在于MLV感染的细胞和病毒粒子中的gp70和Pr15E形成二硫键连接的复合物(27,40,44,45,51,56). 尽管这些研究均未涉及对Env蛋白复合物生物合成的定量分析，但以二硫键形式发现的gp70和Pr15E/p15E的比例似乎存在显著差异。这些差异可能是由于病毒株、实验变异、不准确的定量以及使用的不同标记方法所致。重要的是，所有研究中二硫键gp70-Pr15E/p15E复合物的检测严重依赖于用硫醇活性试剂（例如N个-2,2′-二硫代双乙基马来酰亚胺（NEM）(米-硝基吡啶）[DTNP]和碘代乙酰胺。

Pinter等人的发现(41)对gp70和Pr15E/p15E之间的二硫键在体内是否真的存在产生了怀疑。研究表明，在与p15E的二硫键复合物中，用十二烷基硫酸钠（SDS）破坏病毒颗粒仅产生10%的gp70。然而，当病毒与Nonide P-40（NP-40）孵育时，在添加SDS之前，发现高达39%的gp70与p15E共价连接。因此可以得出结论，在体内只有一小部分gp70和p15E通过二硫键偶联，二硫键gp70-p15E络合物在NP-40中溶解后大多自发形成(41). 用NEM或DTNP对病毒粒子进行预处理，可进一步提高二硫键合Env复合物的产量。这被解释为表明NEM和DTNP激活Env蛋白中的游离巯基，从而刺激gp70和p15E之间形成二硫键(41,45).

这种解释后来有所改变。Pinter等人(42)最近的研究表明，在增溶之前用NEM处理生态型、异向型和两性MLV颗粒，可以大大提高参与二硫键Env络合物的gp70的产率。为了解释这种效应，这些研究人员建议gp70和p15E通过一个不稳定的二硫键连接，该键可以通过阻断NEM中存在于完整病毒粒子中的游离巯基来稳定。这将阻止硫醇-二硫化物交换反应，从而抑制gp70和p15E之间共价键的破坏。

一个类似的理论假设gp70和Pr15E/p15E之间的二硫键在体内和细胞内的裂解产物中容易可逆地异构化，在Env蛋白中含有一个游离的半胱氨酸巯基(14). 因此，只有一部分gp70和Pr15E/p15E是二硫键连接的，参与共价连接络合物的gp70和Pr15E/p 15E的比例取决于环境的氧化还原条件。该模型基于Gliniak等人的主张(14)感染细胞与氧化剂二胺孵育会增加与Pr15E结合的二硫键gp70的量。gp70和Pr15E/p15E通过非共价相互作用结合在一起的可能性得到了研究的支持，这些研究表明，受感染细胞的培养基中存在游离的gp70，并且gp70可以通过冻融从病毒颗粒中释放(32,33,36).

本文的目的是阐明上述关于gp70和Pr15E/p15E之间相互作用的争议。确定这些相互作用的性质和稳定性很重要，因为有人建议Env蛋白复合体的结构重组甚至解离在病毒进入期间Env蛋白融合功能的激活中起作用(42,43). 因此，我们表达了两向性和生态性Moloney MLV（Mo-MLV）环境价值使用重组Semliki Forest病毒（recSFV）载体在BHK-21细胞中的基因。recSFV表达系统已被证明对哺乳动物细胞中外源基因的高效表达特别有用(28,31,49). 我们实验室最近开发了一种方法，通过共表达环境价值和gag-pol公司来自不同SFV表达载体的基因和重组逆转录病毒基因组(29). 我们在这里表达了环境价值在没有其他Mo-MLV成分的基因中研究gp70-Pr15E相互作用的内在特性。

材料和方法

细胞的烷基化和增溶。

通常，将细胞放在冰上，用含有20 mM NEM的新鲜制备的冰镇PBS（Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Steinheim，德国）培养两次1分钟，然后溶解在添加20 mM NEM的NP-40裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl[pH7.5]，150 mM NaCl，2 mM EDTA，1 mM苯甲基磺酰基氟化物，1%NP-40）中。在Eppendorf 16F24-11离心机中，以6000 rpm和4°C的转速离心5分钟，清除裂解物，并将上清液储存在冰上。如有指示，通过向裂解液中添加1体积的含有40 mM NEM的NP-40裂解缓冲液，在细胞裂解后对样品进行烷基化。图中实验中使用的低H（pH 6.0）NP-40裂解缓冲液。​图5C5C用20mM 2缓冲-[N个-吗啉]乙磺酸（Sigma-Aldrich）和30 mM Tris-HCl。

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图5

细胞裂解后gp70和Pr15E之间二硫键的破坏取决于温度和pH值。代谢标记的双亲性Mo-MLV的裂解产物环境价值-在没有烷基化剂的情况下，在pH 7.5（A和B）或pH 6.0（C）条件下制备表达细胞。将裂解产物在冰（A和C）或37°C（B）上培养指定时间，然后将NEM添加到20 mM。然后用多克隆抗MLV血清免疫沉淀Env蛋白。在非还原性SDS–12%聚丙烯酰胺凝胶中分析免疫沉淀物。

结果

将两亲性Mo-MLV Env蛋白加工成稳定的二硫键gp70-Pr15E复合物。

两性Mo-MLV Env蛋白复合物的生物合成以前还没有研究过。因此，我们着手表征独立表达的两亲性Mo-MLV的合成和加工环境价值脉冲相位分析的基因产物。由于之前已经报道了一些关于嗜生态MLV Env蛋白的数据(27,42)，我们包括了嗜生性Mo-MLV的表达环境价值用于比较的基因。表达这些蛋白的recSFV感染的BHK-21细胞被标记10分钟我-[³⁵S] 半胱氨酸在接种后6h和追赶不同时期。细胞溶解前用膜透性烷基化剂NEM处理，并使用抗MLV的多克隆血清或gp70特异性单克隆抗体从细胞裂解液和培养基中免疫沉淀Env蛋白。在还原和非还原条件下用凝胶电泳分析免疫沉淀物。

两亲性Env蛋白的结果如图所示。​图1A1A到C。脉冲标记后可立即检测到的主要产物是前体Env蛋白，分子量为～85 kDa（gp85^安普霍，图。​图1A）。1A） ●●●●。此外，还观察到另外两种分子物种（在该凝胶中被视为一条带）在凝胶中迁移得更快。这些在追逐过程中迅速消失，表明它们已退化。因为这些产品实际上缺乏N-连接的低聚糖以及分子间或分子内二硫键（数据未显示），所以它们很可能代表非转运的细胞质Env多肽。以前在MLV感染的细胞中也观察到类似的产物，这可能是由于mRNA的内部AUG位点开始翻译所致(三).

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图1

脉冲相位分析环境价值-表达细胞。感染recSFV的BHK-21细胞表达两向性（A到C）或共向性（D和E）Mo-MLV环境价值基因标记15分钟我-[³⁵S] 半胱氨酸接种后6h，追赶指定时间。使用多克隆抗MLV血清（A、B、D和E）从细胞裂解液和培养基中免疫沉淀Env蛋白。免疫沉淀在SDS–12%聚丙烯酰胺凝胶中在还原（A和D）和非还原（B和E）条件下运行。面板A中含有培养基样品的凝胶部分的暴露时间是含有细胞样品的凝胶的七倍。指出了假定的非转运Env分子（非转运）和二硫键聚集体（聚集）。两性溶胞产物的一部分环境价值-将追踪180分钟的表达细胞与抗gp70（C）的单克隆抗体一起用于免疫沉淀。在SDS–12%聚丙烯酰胺凝胶中，在还原（R）和非还原（NR）条件下分析产生的沉淀物。

经过30分钟的追踪，另外两种分子量分别为70和20kDa的蛋白质开始出现。追逐过程中它们强度的增加对应于gp85数量的减少^安波，表明它们分别代表Env蛋白裂解产物gp70和Pr15E。gp70和Pr15E的强度差异反映了它们半胱氨酸含量的差异；这些分子分别含有18和4个半胱氨酸(39). 大约一半的Env分子在合成后2小时内被裂解。Env蛋白的裂解表明它被转运到高尔基复合体并通过其反式-高尔基网络(三).

在非还原条件下分析免疫沉淀物时，gp70和Pr15E未被分解（图。​（图1B）。1B） ●●●●。相反，这两种产物都以二硫键络合物的形式迁移，其表观分子质量约为100kDa，我们称之为gp70-S-S-Pr15E。用抗gp70单克隆抗体免疫沉淀法证实了100-kDa蛋白由gp70和Pr15E组成。除前体Env蛋白gp85外，该抗体还可沉淀100-kDa物种^安普霍（图。​（图1C，1C、 车道NR）。在电泳前（第二道）用DTT还原免疫沉淀物时，也观察到后者。相反，100-kDa物种在这些条件下不存在。相反，凝胶中可以看到gp70和Pr15E，这表明gp70在还原之前是与Pr15E相连的二硫键。在非还原条件下对免疫沉淀物的分析也表明存在停留在流动凝胶顶部的聚集物（图。​（图1B）。1B） ●●●●。这些聚集体是二硫键合的，因为它们在用DTT还原后消失（对比图。​图1A1A和B）。这种物质的消失与gp85信号的增加有关^安普霍表明二硫键聚集体主要包含前体Env分子。

为了确定Env蛋白是否从细胞中释放出来，我们用多克隆抗MLV血清对追踪培养基进行免疫沉淀。在长时间暴露自射线照片后，在1至3小时的培养基样品中检测到一些gp70（图。​（图1A）。1A） ●●●●。定量比较细胞相关和释放的gp70的数量表明，在2小时和3小时追逐期后，培养基中仅存在总gp70的2%至3%。由于两个gp85都没有^安普霍也不能在培养基中检测到Pr15E，这一部分很可能代表从细胞中脱落或分泌的游离gp70。从所有这些结果中，我们得出结论，大多数经蛋白质水解处理的两性Env分子形成稳定的二硫键gp70-Pr15E复合物。

生态环境蛋白的分析如图所示。​图1D1D和E。该蛋白质的前体形式的分子量为～80 kDa（gp80^生态的)并且在gp70中的处理效率稍低（gp70迁移得非常接近gp80^生态的)和Pr15E，而不是两性环境前体（图。​（图1D）。1D） ●●●●。在非还原条件下进行分析时（图。​（图1E），1E） ，生态型gp70和Pr15E也形成了共价连接的络合物。与双亲性gp70一样，几乎所有与细胞相关的生态型gp70都参与与Pr15E的二硫键复合物。经过2小时和3小时的追逐期后，培养基中检测到大约10%至15%的总生态型gp70（图。​（图11D） ●●●●。

gp70和Pr15E在细胞表面表达。

通过细胞表面生物素化检测Env蛋白到达PM。为了做到这一点，放射性标记的两亲性Mo-MLV环境价值-表达细胞在冰上用不透膜生物素处理。然后将非结合生物素灭活并冲洗掉，然后对细胞进行裂解。用链霉亲和素琼脂糖从裂解液中收集生物素化蛋白。剩余的细胞内蛋白池用抗MLV的多克隆抗体进行免疫沉淀。

gp70和Pr15E是生物素化检测到的主要产物，表明它们存在于PM中（图。​（图2，2，车道表面）。因为前体蛋白gp85^安普霍，没有生物素化，我们得出结论，gp70和Pr15E的生物素化是特异性的。大量gp70和Pr15E也与MLV特异性抗体沉淀，表明并非所有gp70和Pr15E分子都被生物素化。通过比较生物素化和非生物素化gp70和Pr15E的数量，我们估计至少30%的蛋白水解处理的Env分子存在于细胞表面。生态环境蛋白也获得了类似的结果（数据未显示）。

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图2

Env分子的细胞表面表达。两性Mo MLV环境价值-表达细胞被脉冲标记并追踪，如图图例所示。​图1。1追逐后，将细胞放在冰上，用NHS-S-生物素孵育30分钟。然后生物素被灭活并冲走。将细胞溶解在裂解缓冲液中，用链霉亲和素琼脂糖收集生物素化蛋白（表面）。剩余材料（细胞内）用多克隆抗MLV血清进行免疫沉淀。沉淀在SDS–12%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳之前，用50 mM DTT还原。

gp70和Pr15E之间的共价键对体内还原剂具有抵抗力。

为了测试gp70和Pr15E之间的分子间二硫键相互作用是否取决于环境的氧化还原状态，我们分析了gp70-S-S-Pr15E在体内还原条件下的稳定性。双性或生态性Mo-MLV的平行培养环境价值-因此，对表达细胞进行标记并追踪105分钟。然后，用含有指定量DTT的新鲜培养基替换追踪培养基，并在37°C下继续培养15分钟，然后对细胞进行烷基化和裂解。

如图所示。​图3A三A和B，即使使用了非常高浓度的还原剂，DTT处理也不会导致两性或生态型gp70-S-S-Pr15E的数量减少。当用高达160 mM的2-巯基乙醇处理细胞时，也得到了相同的结果（数据未显示）。这表明gp70和Pr15E之间的分子间二硫键对体内氧化还原状态不敏感。然而，DTT对前体Env分子有影响。例如，在没有DTT的情况下追逐后留下的前体两性Env蛋白以涂片的形式迁移（称为gp85^公牛)在非还原条件下（图。​（图3C，三C、 左车道）。此外，凝胶顶部的二硫键聚集体中存在一部分Env。当细胞与DTT孵育时，这些聚集体的量减少，而单体前体Env分子（称为gp85）的强度^红色)增加（左起第二条车道）。此外，gp85^公牛当细胞接受DTT处理时，迁移速度较慢，大多数前体Env现在与体外还原蛋白（右侧两条通道）结合，表明大多数前体Env分子已被还原。DTT在活细胞中的这种作用以前曾在其他病毒膜蛋白中观察到(4,37)并在这里作为治疗效果的内部控制。生态环境蛋白也获得了类似的数据（数据未显示）。

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图3

二硫键合gp70-Pr15E复合物对体内还原剂的治疗具有抵抗力。两栖（A）和生态（B）Mo-MLV环境价值-表达细胞被标记为我-[³⁵S] 半胱氨酸15分钟，追逐120分钟。追逐105分钟后，用含有指定量DTT的新鲜培养基替换培养基。追逐持续15分钟，然后将细胞烷基化并溶解。用多克隆抗MLV血清从裂解液中免疫沉淀Env蛋白。在SDS–12%聚丙烯酰胺凝胶中，在还原和非还原条件下分析免疫沉淀物。（C） 来自用0或5 mM DTT处理过的细胞的两性Env蛋白免疫沉淀样品在SDS–8%聚丙烯酰胺凝胶中运行，以更好地分离蛋白带。名称gp85的含义^红色和gp85^公牛结果中进行了解释。样品在还原（R）和非还原（NR）条件下运行。

在溶解过程中保持gp70和Pr15E之间的二硫键需要烷基化。

到目前为止，我们已经分析了从破坏前已烷基化的细胞中提取的Env蛋白。为了测试烷基化的效果，我们从没有NEM的细胞中提取了两亲性gp70-Pr15E复合物。作为对照，我们溶解了环境价值-在洗涤和/或裂解步骤中包括NEM的程序中表达细胞。

图​图44结果表明，如果样品没有烷基化，在二硫键络合物中仅回收了一部分（<50%）gp70和Pr15E。与对照组的结果表明，如果样品制备过程中包含NEM，则gp70和Pr15E定量参与了二硫键络合物。有趣的是，结果表明，即使细胞在裂解前仅短暂接触NEM，gp70和Pr15E之间的二硫键相互作用仍得以保留。使用生态环境蛋白时也发现了这一点（数据未显示）。这些数据表明，需要烷基化才能在二硫键络合物中定量收集两性和生态型gp70和Pr15E。

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图4

需要烷基化以在溶解时保存Env蛋白复合物。两栖型Mo-MLV环境价值-表达细胞用标记物标记15分钟我-[³⁵S] 半胱氨酸和追赶120分钟。溶解前，将细胞放在冰上，用PBS洗涤[NEM（洗涤）]两次，每次1分钟。如有指示，PBS含有20 mM NEM。此后，在存在或不存在20 mM NEM的情况下对细胞进行裂解[NEM（裂解）]。在SDS–12%聚丙烯酰胺凝胶中，在还原（R）和非还原（NR）条件下分析免疫沉淀物。

gp70-Pr15E亚单位间二硫键的破坏不涉及可溶性细胞因子，而是由Env复合物内的巯基二硫交换反应介导的。

由于gp70和Pr15E之间的二硫键断裂似乎是由细胞溶解引起的，因此我们研究了这一过程是否由细胞溶解时释放的细胞因子介导的可能性。例如，众所周知，细胞质维持着相对还原的环境(21); 因此，我们推断，亚单位间的二硫键可能只是被细胞溶质成分（如谷胱甘肽和硫氧还蛋白）降低，而这些溶质成分是通过破坏PM释放出来的。或者，亚单位间二硫键的断裂可能由Env复合物本身发生的硫醇-二硫键重排介导。

为了研究这些可能性，我们分析了在有无NEM的情况下制备的细胞裂解液混合物（1:1）中二硫键合gp70-Pr15E络合物的破坏。该方法的基本原理是，如果非烷基化样品含有假定的还原因子，则衍生自烷基化样品的gp70-Pr15E复合物中的（通常稳定的）亚单位间二硫键将被还原。然而，如果破坏是由Env蛋白自身内的硫醇-二硫键交换反应介导的，那么复合物在这些条件下应该是稳定的。为了监测单个裂解物的Env蛋白复合物，我们制备并混合了标记和非标记的双亲性Mo-MLV提取物环境价值-表达细胞。

如图所示。​图66（通道1和2），当烷基化细胞的裂解液单独培养或与非烷基化细胞裂解液一起培养时，观察到等量的gp70-S-S-Pr15E。凝胶中未检测到gp70和Pr15E，表明放射性标记的Env复合物在两种条件下都是稳定的。这表明非烷基化细胞的裂解液中不含可降低gp70和Pr15E之间二硫键的因子。值得注意的是，细胞的烷基化只需要短暂接触NEM，然后进行大量清洗，以尽量减少游离NEM最终进入裂解液的可能性。然而，为了排除残留NEM阻止混合样品中gp70-S-S-Pr15E破坏的可能性，例如，通过阻断非烷基化样品中的假定还原因子，我们监测了来自非烷基化细胞的Env复合物的破坏。观察到，当单独培养非烷基化细胞的裂解液时，约一半的Env复合物分解成游离gp70和Pr15E（通道3）。当这种裂解物与烷基化细胞的裂解物混合并孵育时，发现了相同量的gp70-S-S-Pr15E以及游离的gp70和Pr15E（泳道4）。这证明后一种裂解物不含可能干扰二硫键络合物破坏的游离NEM。在本试验中使用生态型Env蛋白时也获得了类似的结果（数据未显示）。

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图6

gp70和Pr15E之间的二硫键破坏通过Env络合物中的硫醇-二硫交换反应发生。用表达两性Mo MLV的recSFV感染BHK-21细胞的四个平行培养物环境价值基因。其中两个被标记了15分钟我-[³⁵S] 半胱氨酸和追赶120min，而其他未标记。追逐结束时，所有的文化都被冰封了。用PBS–20 mM NEM将一个标记细胞培养物和一个非标记细胞培养液培养两次，每次培养1分钟，然后在缺乏NEM的PBS中洗涤四次。剩余的细胞培养物用缺乏NEM的PBS清洗。此后，在没有NEM的情况下对所有培养物进行裂解。然后将细胞裂解液在以下（1:1）混合物中于4°C下培养15小时：标记的烷基化细胞裂解液加上缺乏NEM的裂解缓冲液（通道1）；标记的烷基化细胞的裂解液加上非标记的非烷基化细胞（车道2）的裂解液；标记的非烷基细胞的裂解液加上缺乏NEM的裂解缓冲液（3号通道）；以及标记的非烷基化细胞的裂解液加上非标记的烷基化细胞（车道4）的裂解液。作为检查混合时gp70-S-S-Pr15E含量的对照，我们用含有NEM的裂解缓冲液稀释标记的烷基化细胞（第5道）和标记的非烷基化细胞的裂解液（第6道），以阻止培养过程中复合物的进一步破坏。Env蛋白随后用多克隆抗MLV血清进行免疫沉淀，并在非还原条件下在SDS–12%聚丙烯酰胺凝胶中进行分析。

从上述实验中，我们得出结论，gp70和Pr15E之间的二硫键在被可溶性细胞因子溶解后并没有减少。相反，Env蛋白本身含有一个游离硫醇，它可以引发硫醇-二硫键重排，从而在溶解时消除gp70和Pr15E之间的二硫键。

讨论

本文的主要结论是，两性和生态型Mo-MLV Env蛋白复合体的gp70和Pr15E亚基通过稳定的二硫键结合在一起。基本上，所有gp70分子都与细胞内和细胞表面的Pr15E二硫键复合物相结合。此外，gp70和Pr15E之间的共价相互作用已被证明在体内还原条件下是高度稳定的。只有在用于分析的条件下，即在Env蛋白溶解后，如果二硫键交换反应没有被烷基化或酸化阻止，则发现亚基间gp70-Pr15E二硫键被破坏。

与以前的报告相比(41)我们发现，在非离子洗涤剂中，gp70和Pr15E之间的二硫键不是自发形成的。相反，图。​图5A5A明确显示，（非烷基化）gp70-S-S-Pr15E复合物在NP-40裂解物中失去其亚单位间二硫键。此外，研究发现，在没有烷基化剂的情况下，大部分gp70和Pr15E仍然与二硫键相连（图。​（图4）4)而gp70-S-S-Pr15E的破坏可以通过降低pH值来阻断，从而排除NEM诱导亚单位间二硫键形成的可能性。总之，这些数据解决了gp70和Pr15E之间的二硫键是人为形成的怀疑。以前的数据表明，在添加SDS之前，NP-40中的病毒离子溶解会增加二硫键Env蛋白复合物的产量(41)因此，应该从一个新的角度来看。尽管这些发现很难解释，但我们只能猜测溶解在NP-40中的Env络合物具有部分抗SDS的构象。

gp70和Pr15E之间的二硫键似乎不受细胞环境氧化还原电位的影响，因为Env复合物在正常和还原条件下都是稳定的。这一发现与Gliniak等人的结果相矛盾(14)他声称，将细胞与氧化剂二胺孵育会增加与Pr15E结合的二硫键gp70的比例。在他们的研究中没有研究还原剂的作用。我们无法证实二胺的作用，因为在我们的病例中，所有与细胞相关的gp70都是与Pr15E相连的二硫键，即使在正常条件下也是如此。然而，我们观察到，在用20 mM二胺而不是NEM短暂处理过的细胞溶解后，Env复合物是稳定的（数据未显示）。换句话说，二酰胺可以取代烷基化剂，以防止细胞裂解时亚单位间二硫键的断裂。这可以解释为，当高浓度添加到细胞中时，二胺不仅氧化谷胱甘肽，还氧化蛋白质中的硫醇(26). 因此，二酰胺可能使增溶后攻击gp70和Pr15E之间二硫键的硫醇失活。

gp70和Pr15E之间二硫键的存在和稳定性不依赖于氧化还原状态的发现，使Gliniak等人的模型的论点无效(14)假设亚单位间二硫键在体内容易可逆异构化。根据这个模型，只有一部分gp70和Pr15E是二硫键连接的。相反，我们对放射性标记的Env产物的定量显示，几乎所有gp70和Pr15E分子都形成稳定的二硫键络合物。介质中只能检测到少量的游离gp70，这一事实支持了这一点。因此，我们得出结论，gp70和Pr15E之间的二硫键应被视为稳定的。

在这项工作中，我们分析了含有未加工Pr15E的Env复合物。然而，在病毒粒子中，大部分Pr15E被裂解成p15E，这一过程被认为是融合所必需的(22,53). Pinter等人(42)已经证明，在生态和两性MLV颗粒中也存在二硫键Env络合物。然而，他们的数据也表明，即使病毒粒子在溶解之前用烷基化剂处理过，gp70的很大一部分也不是与Pr15E/p15E相连的二硫键（参考文献图142). 这个结果与我们的观察结果明显不同，几乎所有细胞相关的gp70都与Pr15E的稳定二硫键配合物有关。因此，可能是Pr15E的裂解破坏了亚单位间二硫键的稳定性。我们目前正在通过定量生化分析病毒颗粒中的Env蛋白复合物来研究这种可能性。

细胞裂解后gp70和Pr15E之间二硫键相互作用的中断似乎是Env复合体的固有特性，因为这个过程似乎不涉及细胞因子。因此，我们认为gp70和Pr15E之间的二硫键在溶解后与Env蛋白自身内的游离硫醇重新排列。亚单位间二硫键的重排以前已经提出过，尽管在不同的背景下(14,42). 该反应原则上是可能的，因为Env多肽在其外结构域中含有奇数个半胱氨酸，这意味着gp70-Pr15E复合物中至少有一个巯基未被氧化。为什么这种二硫键重排会在Env蛋白溶解后被诱导，尚不清楚。也许环境蛋白复合物在洗涤剂存在下发生构象变化，从而使这种反应有利。

基于Friend MLV Env蛋白的胰蛋白酶片段分析，Pinter等人(42)最近提出，gp70羧基末端的CWLC序列的半胱氨酸与p15E的二硫键有关。有趣的是，这种肽在MLV和其他C型和D型逆转录病毒的Env蛋白中高度保守(23,47)，类似于参与硫代二硫化物交换反应的细胞酶的活性位点(7). 我们的结果与CWLC肽参与gp70和Pr15E溶解后二硫键重排的模型一致。还假设CWLC序列促进了Env蛋白在体内折叠和活性所必需的功能性二硫键异构化反应(42).

Env蛋白中二硫键的形成在其三维功能结构的建立中起着重要作用(11,12,16,32,33,52). Env分子中的大多数（如果不是全部）二硫键在ER中以共翻译和翻译后方式固定(14). 很可能，在前体多肽运输到细胞表面并裂解之前，gp70和Pr15E之间的二硫键已经在该多肽中形成。这种策略确保了Env蛋白在切割时保持结构和功能的完整性，尽管切割可能会改变蛋白质结构。因此，大多数经蛋白质水解处理的Env分子形成稳定的二硫键复合物。然而，少量gp70与Pr15E无关，而是从细胞中释放出来的。一部分二硫键连接的Env复合物可能在体内被破坏，例如通过二硫键重排，这将导致gp70的脱落。然而，也有可能自由gp70是由错误氧化的Env前体分子裂解形成的，这些前体分子尚未在gp70和Pr15E结构域之间建立二硫键。在这种情况下，gp70和Pr15E可能不会形成复合物，因此，gp70作为普通分泌蛋白从细胞中释放出来。内质网质量控制系统可能会识别并保留氧化不正确的Env分子，因此可能折叠不完全(20). 然而，也有一些错误折叠或部分组装的膜蛋白可以从内质网中逃逸出来，并可以在细胞表面发现(1). 事实上，已经表明MLV Env蛋白的异常折叠的糖基化突变体被转运到质膜(23,30). 有趣的是，这些突变的Env蛋白中有几个产生了较高水平的gp70，而gp70可以从细胞中自由释放出来(30).

值得注意的是，在病毒产生细胞的长期培养过程中，游离gp70可能在中到高浓度中积累。这可能是以前认为gp70和Pr15E非共价连接的原因(36). 比较病毒相关环境复合物中存在的游离gp70和gp70的数量可以很容易地提出二硫键合gp70-Pr15E/p15E复合物不稳定的建议，但这并不一定是真的。可溶性gp70分子可能与病毒颗粒竞争与受体的结合(24,35)因此，可能会对大规模生产高滴度库存造成潜在问题，例如用于基因治疗的重组逆转录病毒载体。

最近，研究表明，与逆转录病毒TM分子外结构域核心相对应的片段(6,11,54)形成类似于流感病毒血凝素蛋白低氢诱导构象的结构(5). 目前尚不清楚逆转录病毒TM分子在其整个生命周期中是否表现出这样的构象，或者在病毒进入期间发生膜融合之前是否呈现出另一种构象。膜融合肽可能埋藏在SU-TM复合物中，从而避免过早的相互作用，并且只有在受体结合引起构象变化后才暴露出来(18,43,48). 因此，进一步表征逆转录病毒Env蛋白的融合机制需要确定Env在预融合状态下的结构。许多逆转录病毒Env蛋白由非共价连接的SU-TM复合物组成，其完整性在纯化过程中很难保持。然而，正如我们在这里所显示的，细胞相关的MLV-Env复合物在体内是稳定的，可以在不中断的情况下提取；因此，它代表了X射线晶体学分析的一个有趣的候选者。

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参考文献