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《维罗尔杂志》。1998年1月；72(1): 273–278.
数字对象标识：10.1128/jvi.72.1.273-278.1998年
预防性维修识别码：项目编号：109373
PMID：9420224

狂犬病病毒的一种无毒突变株不能在体内外感染运动神经元

帕特里斯·库隆,1,2 Jean-Pierre Ternaux公司,2 安妮·弗朗德,1和克里斯汀·塔弗罗1,*
作者信息 文章注释 版权和许可证信息 PMC免责声明

摘要

狂犬病病毒的抗原双突变体（挑战病毒标准株[CVS]）是通过连续使用两种中和抗糖蛋白单克隆抗体来选择的，这两种抗体都对抗原位点III具有特异性。该突变体与原始病毒株的不同之处在于糖蛋白外结构域中的两个氨基酸替换。位置330的赖氨酸和位置333的精氨酸分别被天冬酰胺和蛋氨酸取代。这种双突变体对成年小鼠没有致病性。当将该病毒肌肉注射到成年小鼠的前肢时，无论是通过运动还是通过感觉途径，该病毒都无法穿透神经系统，而相应的单个突变体感染了脊髓中的运动神经元和背根神经节中的感觉神经元。体外实验表明，双突变体能够感染BHK细胞、神经母细胞瘤细胞和新制备的胚胎运动神经元，尽管其效率低于CVS菌株。在37°C下进一步培养后，运动神经元对突变体的感染具有抵抗力，同时对CVS感染保持宽容。这些结果表明狂犬病病毒使用不同类型的受体：一种在连续细胞系表面普遍表达的分子，被CVS和双突变体识别，以及一种不被双突变体所识别的神经元特异性分子。

病毒的组织嗜性首先由病毒表面蛋白与目标细胞表面表达的分子的相互作用决定。这种分子在有限的一组分化组织中的表达限制了病毒的向性。狂犬病病毒就是这种情况的一个明显例子。这种包膜病毒属于弹状病毒家族，其基因组为非片段负链RNA。五种蛋白质的基因组编码，其中一种是糖蛋白（G），暴露在病毒表面(29). 在体外，这种病毒能够感染各种类型的细胞(19). 在体内，它的向性主要局限于神经元。然而，肌肉接种后，狂犬病病毒可以同时感染神经元和肌肉细胞(15). 神经系统（NS）感染不需要肌肉细胞复制，尤其是街头狂犬病病毒(6). 在NS入侵过程中，只有神经元含有病毒抗原。神经元感染的这种特异性使我们假设在神经元表面存在狂犬病病毒的特异性受体。

通过使用抗原突变体，发现了G和神经元分子之间特定相互作用的间接证据。通过从敏感人群中分离抗单克隆抗体中和的突变株，可以选择G基因突变的病毒。根据它们对MAb集合的反应性，MAb耐药（MAR）突变体被分为不同的组，这些组定义了抗原位点(4). 用MAR突变体系统接种小鼠表明，它们中很少有表现出致病性的剧烈改变。所有这些突变体在G的333位都有精氨酸的替代物(21). 这种突变影响了抗原位点III，并产生了对所有受试的免疫活性成年动物无毒的病毒。唯一的例外是臭鼬，据报道，臭鼬易受这种突变型的感染(25)，但这些结果尚未得到证实。为了了解这种缺乏致病性的原因，从挑战性病毒标准株（CVS）中选择了一种无毒突变株（AvO1）进行了详细研究。从小鼠身上获得的所有结果都支持这样的观点，即AvO1能够穿透NS，但只能感染一部分神经元(7). 肌肉注射后，作为CVS的AvO1感染运动和感觉神经元的效率相同。然而，与CVS不同的是，该突变体在感染后期不会感染脊髓或大脑中的其他神经元(6). 鼻腔接种后，AvO1和CVS感染嗅上皮的第一个神经元。从那里，AvO1被传递给与嗅觉受体细胞相连的几类神经元（即嗅球中的肾小球周围神经元和大脑中水平对角带的神经元），CVS侵犯嗅觉系统的大多数神经元（二尖瓣细胞、嗅球和前嗅核内丛状层神经元、肾小球周细胞和水平斜带神经元）(12). 就AvO1而言，限制病毒传播给免疫系统留出时间，使其产生特异性反应，从而将病毒从中枢神经系统（CNS）中清除。这些结果表明，AvO1从嗅觉受体细胞中成熟，并表明这种突变阻止了一部分连接神经元的穿透(12).

抗原位点III被描述为包含330到338个氨基酸(21). 假设位于333位附近的其他氨基酸也与病毒感染神经元的能力有关，我们选择了在III位有两个突变的MAR突变体，并研究了它们的残余神经侵袭性。本文描述了从狂犬病病毒CVS株中筛选出的一个抗原双突变体的选择和分子特性。这表明该突变体感染大鼠胚胎运动神经元原代培养物的能力降低，并且在肌肉接种后无法侵入小鼠NS。

材料和方法

细胞和病毒。

BSR细胞来源于幼仓鼠肾脏（BHK）细胞，在格拉斯哥改良的最小必需培养基中生长，该培养基补充有37°C、5%CO的10%小牛血清2孵化器。NG108-15（小鼠神经母细胞瘤N18×大鼠胶质瘤C6）细胞在Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM；GIBCO-BRL）和10%胎牛血清中培养(17).

以每细胞0.1 PFU的感染倍数（MOI）感染BSR细胞，从而繁殖狂犬病和抗原突变体的CVS菌株。感染在37°C、添加2%小牛血清的最低必需培养基中持续72小时。收集上清液，低速离心以丢弃细胞碎片，并在−70°C的条件下将其冷冻成等分。效价测定如前所述(18). 根据Gaudin等人(9).

抗体和抗原突变体。

将骨髓瘤细胞与用β-丙内酯激活CVS免疫的BALB/c小鼠的脾细胞融合后，分离出抗糖蛋白MAbs 50AC1和50AD1。它们的特征已在前面描述过(28).

根据先前描述的程序，选择抗原突变体以抵抗MAbs的中和(21). 它们是从AvO10突变体的回复克隆或RK4中分离出来的(21,28).

排序。

根据Raux等人描述的程序建立了选定突变体的核苷酸序列(18).

动物实验。

所有实验都是用6周龄的雌性瑞士小鼠（法国勒格内斯特岛Janvier的Elevage et de Recherche中心）进行的。

为了进行致病性试验，将5只小鼠大脑内注射含有10三每种病毒的PFU。对动物进行21天的观察。存活的动物在第28天用50μl含有10三50%致死剂量（LD50).

渗透实验是根据已经描述的程序进行的(6). 简单地说，10μl（108前肢注射病毒PFU）。30小时后处死动物。将脊髓的胸段和接种成员同侧相应的背根神经节作为一块进行解剖，并直接冷冻在干冰中。用低温切片机（英国亨廷顿仪器有限公司）对组织进行连续切片，并在凝胶处理的载玻片上进行回收。用丙酮固定，并用异硫氰酸荧光素结合抗核衣壳抗体处理（法国巴黎巴斯德诊断公司）。

胚胎大鼠运动神经元的原代培养。

根据Ternaux和Portalier描述的技术制备脊髓运动神经元(24)，略有修改。简单地说，它们是从15至17天龄的Wistar大鼠胚胎中分离出来的（Centre d’Elevage et de Recherche Janvier）。一名孕妇被处死，其胎儿在无菌条件下被取出。将脊髓解剖并保存在无钙无镁磷酸盐缓冲液（PBS）中−；GIBCO-BRL）。小心地切除脑膜，将组织转移到新鲜PBS中−.将组织切片成小块后，在PBS中孵育−含有胰蛋白酶（0.025%；Sigma）和DNase I（0.005%；Boehringer），在37°C下保持30分钟。300×离心后克在7分钟内，细胞在硅化巴斯德吸管中大致分离并在PBS中培养−37°C下，含DNase I（0.005%）15分钟。离心后，将颗粒重新悬浮在Hanks的平衡盐溶液（HBSS；GIBCO-BRL）中，并使用内径逐渐减小的火焰抛光硅化巴斯德移液管机械分离细胞。将细胞悬液放置在Nycoprep 1.15（Nycomed，Oslo，Norway）的两个缓冲垫顶部的HBSS中（60%以上20%），然后在2000×克在4°C下保持20分钟。收集浓缩在HBSS–Nycoprep 20%界面处的细胞，在HBSS中稀释并离心后，将其重新悬浮在补充有胰岛素（5μg/ml）、人转铁蛋白（100μg/ml）、腐胺（0.1 mM）、孕酮（40 nM）和雌二醇（1 pM）（均由Sigma提供）的DMEM-F12培养基（GIBCO-BRL）中，d日-葡萄糖（33 mM）和碳酸氢钠（24 mM）（从Prolabo获得），以及我-谷氨酰胺（2mM）和庆大霉素（100μg/ml）（购自GIBCO-BRL）；将pH值调整为7.4。该介质称为定义介质。细胞密度从3×10调整5细胞/ml，短期培养至3×106细胞/ml用于长期培养。然后，将100μl这种悬浮液镀到用聚乙烯连续处理的玻璃盖玻片上-我-赖氨酸（西格玛；5μg/ml）和层粘连蛋白（西格马；2μg/ml）。将盖玻片单独放入培养皿中，并在37°C和5%CO中培养2孵化器。1小时后添加定义的培养基，并每天更换。对这些制剂进行的形态计量学、免疫学和化学分析表明，90%至95%的细胞具有运动神经元的特性(2a个).

运动神经元感染。

经过多次培养，运动神经元被CVS细胞培养上清和抗原突变体感染。将病毒接种物调整为2×106在规定介质中稀释后的PFU/盖玻片。在室温下吸附30分钟后，取出接种物，用规定的培养基覆盖运动神经元，并在37°C下培养24小时。

免疫荧光。

感染后24小时，运动神经元在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中3.7%甲醛中固定10分钟，然后在PBS中3.7%福尔马林-0.1%Triton X-100中固定5分钟。在PBS内清洗三次后，用单克隆小鼠抗MAP2抗体（Sigma；PBS中1/100）在4°C下培养细胞过夜。为了消除未结合的一级抗体，用PBS洗涤细胞三次，然后在与异硫氰酸荧光素结合的兔抗狂犬病核衣壳（诊断巴斯德；PBS中的1/20）和与异硫氰四甲基罗丹明结合的驴抗鼠免疫球蛋白G（Jackson Immunoresearch；PBS的1/100）的混合物中培养细胞在37°C下持续3小时。盖玻片在PBS中清洗三次，并用Immu-mount（Shandon）倒置安装在玻璃载玻片上。大约10三用罗丹明滤光片在40倍放大镜下计数活运动神经元。用荧光素滤光片鉴定感染细胞。

结果

抗原无毒双突变体的选择。

从不同狂犬病病毒株分离出的所有无毒突变体在糖蛋白中都有一个单一的取代，精氨酸333在CVS中被半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、亮氨酸、蛋氨酸或丝氨酸取代(21,28)，由Evelyn-Rokitnicki-Abelseth（ERA）中的异亮氨酸(8)以及亚拉巴马州达夫林街上的谷氨酸或丝氨酸（SAD）(11). 从SAD中选择了一个在333位携带赖氨酸的抗原突变体伯尔尼应变。肌肉接种后，该突变对小鼠无毒，但通过脑内途径保留了残余致病性(11)就像从CVS菌株中分离出来的突变株(28). 这些结果表明333位的正电荷可能在致病过程中起重要作用。另一种碱性氨基酸，位于330位的赖氨酸，存在于抗原位点III中（图。​（图1）。1). 用合适的单克隆抗体F69选择了两个在该位置具有替换的MAR突变体：F69，其含有苏氨酸(28)和RK4，其含有天冬酰胺（表​（表1）。1). 这两个突变体对成年小鼠具有完全致病性。它们被单克隆抗体28AD2和50AD1部分中和，而在333位有替换的MAR突变体不能被这些抗体中和。

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狂犬病病毒和莫科拉病毒的实验室和野生型毒株中抗原位点III的保存(26)狂犬病相关病毒。显示了固定菌株CVS的序列(32)，电子逆向拍卖(1)，伤心(5)和巴斯德病毒（PV）(27)和野生型菌株CGX89-1(2)、COSRV(14)，T5-A1(16)和阿尔及尔(4). 本研究确定了K4-5序列。带正电的氨基酸用粗体表示，并带有下划线。糖基化位点和脯氨酸被装箱。

表1

CVS和在抗原位点III中具有一个或两个取代的突变体的特征

病毒选择MAb位置氨基酸：
劳埃德50国际商会。一（PFU/ml）
330333
并行版本系统赖氨酸精氨酸10
RK4型50交流1天门冬氨酸精氨酸10
RL1型248-8赖氨酸蛋氨酸>106
K4-5型公元501年天门冬氨酸蛋氨酸>106
一劳埃德50脑内注射50%致死剂量。 

我们使用MAb 50AD1从突变体RK4的333位点选择了一个额外的突变。由此产生的突变体K4-5携带两个氨基酸替换：赖氨酸到天冬酰胺，精氨酸到蛋氨酸，分别位于330和333位置（表​（表1）。1). 脑内接种K4-5表明该突变对成年小鼠无致病性。对具有一个或另一个替代物的突变体RK4和RL1进行的对照实验表明，RK4（K330N）是致病的，RL1是无毒的（R333M）(28)（表​（表11).

外周接种后小鼠NS感染。

为了测试糖蛋白基因中的这两个突变是否对动物感染的早期事件有影响，将双突变体和各自的单突变体肌肉注射到成年小鼠的前肢。通过这种接种途径，已经证明AvO1（无毒突变体的原型）能够像CVS一样有效感染脊髓运动神经元和背根神经节的感觉神经元(6). 这两种病毒都直接穿透神经末梢，而事先没有在接种部位的肌肉中繁殖。接种高剂量病毒后30小时（表​（表2），2)从感染动物身上解剖脊髓的胸段和相应的背根神经节。此时，只能检测到原发感染的神经元(6). 对两种组织的连续切片进行处理，以检测狂犬病病毒抗原。与致病性病毒CVS和RK4一样，无毒突变RL1在小鼠NS的第一个感染周期中感染了运动神经元和感觉神经元（表​（表2）。2). 所有受感染的神经元均位于接种部位的同侧（数据未显示）。另一方面，双突变体没有感染四只注射小鼠的任何神经元，无论是脊髓还是神经节。第五只老鼠只感染了一个背根神经节的三个神经元（表​（表2）。2). 值得注意的是，这些小鼠接受的病毒接种量比注射CVS毒株的小鼠高10倍。

表2

周围接种CVS和抗原突变体后小鼠背根神经节（DRG）和脊髓（SC）的感染一

鼠标接种（PFU）后30小时受感染神经元的数量：
CVS（4×108)
RK4（4×108)
RL1（4×108)
K4-5（4×109)
DRG公司联合国安全理事会DRG公司联合国安全理事会DRG公司联合国安全理事会DRG公司联合国安全理事会
148801819503700
241871658363900
三1891966303500
41513444400
52553三0
一将10微升浓缩病毒接种到成年小鼠的右前肢。每组从同一只动物身上获得两个数值。 

无毒突变体对神经母细胞瘤细胞的感染。

为了测试双突变体在连续细胞系中增殖的能力，BSR和NG108-15细胞被CVS或抗原突变体感染，MOI为5或6 PFU/细胞。在BSR细胞上滴定病毒上清液（图。​（图2）。2). 吸附后18h用免疫荧光法检测狂犬病病毒感染细胞。在这次MOI中，100%的BSR细胞都感染了这两种病毒。K4-5只感染了50%的NG108-15细胞，而CVS感染了100%的这些细胞，表明突变体的渗透性受到轻微影响。在所有病例中，感染后18小时的荧光强度具有可比性，这表明一旦发生穿透，蛋白质合成的速度相同。对于这两种病毒，神经母细胞瘤细胞中的病毒生成量低于BSR细胞。在这两种细胞上，变异病毒的产生也低于CVS。例如，在感染后48小时，K4-5和CVS产生的病毒分别等于NG108-15细胞上的10和65 PFU/细胞，以及BSR细胞上的120和900 PFU/电池。

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BSR（--）和NG108-15（––）细胞上CVS（⧫）和K4-5（•）的一步生长曲线。MOI为5（CVS）和6（K4-5）。在室温下吸附1小时后，去除接种物，并在添加培养基之前清洗细胞层。4小时后更换上清液，以清除脱附病毒。培养温度为37°C。感染后感染。

脊髓运动神经元对双突变体感染的渐进性抵抗。

我们决定监测脊髓运动神经元原代培养中的感染过程。这些运动神经元是从15至17天龄大鼠胚胎的脊髓中分离出来的，并按照材料和方法中的描述通过差速离心进行纯化。在我们的条件下，每天更换规定的培养基，运动神经元可以在培养基中维持2周（图。​（图3a）。三a） ●●●●。用抗乙酰胆碱抗体对这些细胞进行的免疫细胞化学分析表明，该细胞群合成乙酰胆碱（图。​（图3b）。三b） 。盖玻片播种3×104至3×105聚乙烯上的运动神经元-我-赖氨酸和层粘连蛋白处理的表面。这些运动神经元在电镀后2、6和10天感染CVS或双突变体。在那个阶段，大约10%的运动神经元还活着。接种量标准化为4×106PFU/盖玻片，但无法计算真实的MOI，因为病毒也附着在层粘连蛋白底物上。24小时后停止感染，用双标记免疫荧光法计数感染神经元数。这些细胞通过免疫细胞化学鉴定为神经元（图。​（图4A4A和C）。在感染的任何阶段，68%到77%的细胞感染了CVS（图。​（图4B4B和​和5）。5). 相反，在培养2天后，双突变体只能感染30%的运动神经元（图。​（图5）。5). 然后，随着时间的推移，对感染的抵抗力增加，在培养10天后，不到3%的运动神经元感染了双突变体（图。​（图4D4D和​和5）。5). 在从13天大的胚胎中纯化的小鼠脊髓运动神经元上进行了类似的实验。培养6天后，用CVS或双突变体感染小鼠运动神经元24小时。免疫细胞化学处理后，在CVS感染的培养物中，502个MAP2中有444个（88.4%）+运动神经元含有狂犬病病毒抗原，而在双重突变感染的培养基中，505个MAP2中只有7个（1.4%）+运动神经元狂犬病病毒抗原阳性。

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纯化培养的大鼠胚胎脊髓运动神经元。（a） 分离的运动神经元培养物生长在涂有聚乙烯的玻璃盖玻片上-我-在含有添加剂的DMEM-F12培养基中，赖氨酸（0.005%）和层粘连蛋白（0.001%）。电镀后6天，用相差显微镜观察活细胞。（b） 多聚甲醛固定后运动神经元同一培养物中乙酰胆碱的免疫过氧化物酶检测。棒材，15μm。

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CVS或抗原双突变体K4-5培养10天后大鼠胚胎脊髓运动神经元感染。细胞被镀在经聚乙烯处理的玻璃盖玻片上-我-赖氨酸和层粘连蛋白，保存10天，然后用CVS（A和B）或K4-5（C和D）感染24小时。在用双标记免疫荧光法同时检测神经元（A和C）和病毒抗原（B和D）之前，将培养物固定并渗透。棒材，30μm。

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大鼠胚胎脊髓运动神经元在体外获得了对突变型K4-5感染的渐进抗性。运动神经元接种在聚乙烯上-我-密度为3×10的赖氨酸和层粘连蛋白处理玻璃盖玻片4至3×105每个盖玻片的细胞数取决于培养时间。在第2天、第6天或第10天用CVS或K4-5在37°C下感染24小时。在固定和透化后，用抗MAP2小鼠MAb鉴定神经元，并用兔抗狂犬病病毒核衣壳抗体检测受感染的细胞。受感染运动神经元的百分比估计为双标记细胞数量与MAP2标记细胞数量的比率（从10三地图2+计数的细胞）。实验一式四份。

讨论

有充分的证据表明，狂犬病病毒在体外感染大多数连续细胞系，而其向性主要局限于动物的神经元。此外，致病菌株感染CNS中的大多数神经元。先前的研究表明狂犬病病毒存在两种受体，用于附着于靶细胞：普遍分布的细胞表面分子和存在于少数细胞系和一些分化组织上的特异分子(31). 无所不在的受体可能是脂类和神经节苷脂(22,23,31)一种特殊的受体可能是烟碱乙酰胆碱受体(13). 然而，由于这种复合物不存在于狂犬病病毒所允许的许多类别的神经元上，因此它不可能是介导病毒进入神经元的唯一受体。

先前对固定毒株CVS的研究表明，糖蛋白基因的点突变导致精氨酸在333位的替换，从而产生在中枢神经系统中繁殖能力受限的无毒病毒(10,12). 肌肉注射后，这些病毒能够像最初的CVS株一样有效地穿透运动神经元和感觉神经元，但未发生变异病毒的跨神经元转移(6). 相反，这里描述的双突变体K4-5（K330N-R333M）通过这种接种途径既没有感染感觉神经元也没有感染运动神经元。由于病毒糖蛋白的突变可能会影响病毒进入或卵巢蛋白，但不会影响病毒复制，这些数据表明，阻断发生在病毒生命周期的早期阶段，如结合、内吞或融合，反映出突变糖蛋白和神经元组分之间缺乏相互作用。

通过运动神经元的原代培养，我们能够扩展在动物实验中获得的数据。这些神经元是从大鼠胚胎脊髓中分离出来的，根据几个标准被认为是运动神经元（见结果）。在这些培养物中，我们发现运动神经元对K4-5的敏感性在10天后下降到3%以下。因此，运动神经元在培养物中存活的越多，它们对K4-5的抗性就越强。这种情况让人想起在小鼠身上观察到的在糖蛋白333位有替代物的突变体。这种突变体对幼鼠仍有致病性，并像野生型一样在其大脑中繁殖(28). 它们在出生后的前3周内失去入侵NS的能力（未公布的数据）。

对已建立的细胞系（BSR或神经母细胞瘤）进行的实验并未显示CVS和K4-5之间的显著差异，尽管突变体穿透NG108-15细胞的能力受到轻微影响（MOI为6时，只有50%的细胞受到感染）。尽管受感染细胞的荧光强度相似，但突变株的病毒产生量低于CVS，可能是因为成熟度和/或病毒稳定性受到突变的影响。对于这两种病毒，神经母细胞瘤细胞中的病毒生成量较低。然而，K4-5和CVS在体外细胞培养中的增殖没有显著差异。这一观察再次说明了使用任何一种已建立的细胞系来识别特定的神经元狂犬病病毒受体的困难，因为这些细胞表达普遍存在的受体。最近，通过使用与Sf21昆虫细胞（在其表面表达狂犬病病毒糖蛋白）和几个已建立的细胞系的结合试验，部分解决了这个问题。我们证明只有神经元细胞系（包括这些研究中使用的细胞系）表达狂犬病病毒糖蛋白的特异结合位点，K4-5中的两个突变消除了这种结合(第28页). 这些结合位点可能是狂犬病的“高亲和力”神经元特异性受体，突变的糖蛋白无法与之结合（或与之结合的亲和力较低，不足以介导鳞翅目细胞与神经母细胞瘤细胞的粘附）。

K4-5与CVS的区别在于糖蛋白外结构域中的两个氨基酸替换。这些变化位于位置330和333，之前被确定为属于抗原位点III(21). 几个实验室和野生型菌株的部分氨基酸序列比较显示，抗原位点III几乎完全保持不变（图。​（图1）。1). 抗原位点III被定义为一个连续的构象位点(4). 该结构域可由（i）319位的潜在糖基化位点来描述（图。​（图1），1)，存在于所有菌株中(1–三,5,27,32)并已证明可用于CVS(30)和（ii）位置340处的脯氨酸（已知该氨基酸会导致蛋白质二级结构的弯曲）。支持这种脯氨酸结构重要性的另一个论点是次要位点a的存在。该位点的抗原突变位于342和343位，并且没有观察到次要位点a的MAR突变体和位点III的MAbs的敏感性变化，反之亦然(4). 此外，位点III的结构组织也在莫科拉病毒的糖蛋白中保守(26). 这一发现可能表明了该区域对溶血病毒生存能力的重要性。

位置320到340的区域包含两个带正电的氨基酸，但位置320处的赖氨酸除外，赖氨酸位于Asn-X-Ser/Thr基序中，可能被糖链掩盖（图。​（图1）。1). 用不带电的残基取代这两个残基会使病毒无法穿透感觉神经元和运动神经元。仅替换一个带正电荷的氨基酸（在RK4和AvO1突变体中）不会降低这些突变体感染这些类型神经元的能力，但在AvO1中，它会阻止向中间神经元的传播(6).

通过使用中和单克隆抗体选择感染神经元能力有限的抗原突变体，可以识别狂犬病病毒穿透神经元的两个关键氨基酸。病毒糖蛋白与细胞受体的相互作用可能还牵涉到其他关键氨基酸。负链RNA病毒特别是狂犬病病毒反向遗传学的研究进展(20)为研究与神经元受体相互作用相关的氨基酸提供了新的工具。另一方面，K4-5由于不能感染运动神经元和感觉神经元，将有助于鉴定狂犬病病毒的神经元受体。

致谢

这项工作得到了CNRS通过UPR 9053（对P.C.、A.F.和C.T.）和9041（对J.-P.T.）的支持。

我们感谢卡林·凯林仔细阅读手稿。我们感谢Jacqueline Bénéjean和Genevieve Payen提供的出色技术援助。

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文章来自病毒学杂志由以下人员提供美国微生物学会（ASM）