Fos家族成员通过激活细胞周期蛋白D1诱导细胞周期进入

摘要

细胞精确复制其DNA并分裂为两个细胞的复杂机制长期以来一直备受关注。最近的研究揭示了一个复杂的控制机制分层，确保周期中的DNA合成和有丝分裂阶段只在适当的时间发生。这种精细的调控是由一个被称为细胞周期依赖激酶（cdk’s）的丝氨酸-三氢嘌呤激酶家族成员的顺序激活介导的(26,39,40). 随着细胞周期的进展，特定的cdk通过与适当的细胞周期蛋白结合而被激活。G的一个关键步骤₁进展似乎是生长因子刺激的细胞周期再进入过程中cyclin D1表达的诱导(19,27,32,33,44). 添加生长因子后4至6小时，细胞周期蛋白D1 mRNA表达显著增强，细胞周期素D1蛋白的最低水平似乎是通过G₁(19,24,27,44). 在生长因子刺激的细胞周期再进入过程中，细胞周期蛋白D1 mRNA表达的诱导需要激活Ras依赖的有丝分裂原激活的蛋白激酶途径(1,2,42)并且在时间上先于一类被称为即时早期基因（IEG）的基因的激活(16). 一些IEG编码转录因子，可调节细胞周期蛋白D1基因等基因的转录。

最具特色的IEG包括-福斯原癌基因家族。的表达式福斯家族基因，包括c-福斯,fosB公司,弗拉（fra）-1，和弗拉（fra）-2，在向静止细胞添加生长因子后几分钟内诱导(16). Fos家族蛋白与Jun或ATF家族成员形成异二聚体，这些复合物分别与序列元件TGA（G/C）TCA（AP-1位点）或TGACGTCA（ATF位点）结合(5,13,14). 通过与靶基因调控区内的特定位点结合，这些Fos复合物可以调节晚期反应基因的转录，这些基因的表达可能对细胞周期的重新进入至关重要。

虽然间接证据表明细胞周期蛋白D1基因可能是Fos家族的靶点，但能够控制细胞周期进展的Fos家族特定靶点以及这些靶点与细胞周期机制耦合的机制尚不清楚(15,25,44). 成纤维细胞中c-Fos的过度表达可提高细胞周期蛋白D1 mRNA的水平(25)以及导致c水平降低的细胞衰老等条件-福斯转录也导致细胞周期蛋白D1表达水平降低(44). Cyclin D1启动子分析也表明，c-Jun可能通过位于−52的环腺苷酸反应元件（CRE）位点激活Cyclin D1的表达，但没有报道c-Fos的作用(15).

尽管有这些提示性数据福斯用于细胞周期重入和进入S期的家族基因诱导一直很难建立。早期的抗体微量注射和反义RNA实验表明，阻断c-福斯功能抑制成纤维细胞增殖(17,28,34). 然而，在c组中没有发现生长异常-福斯^−/−胚胎干细胞(10)或初级或3T3 c-福斯^−/−成纤维细胞(4,18). 此外磷硼^−/−成纤维细胞未受损(12). 证据表明福斯抗体微注射研究提供了家族基因协同诱导S期进展的证据，表明c-福斯或fosB公司或弗拉（fra）-仅1个功能部分阻断了细胞周期的重新进入，同时同时抑制所有三个基因有效地阻止了细胞周期进展(22). 这些结果提出了以下可能性：福斯家族成员在生长因子刺激的细胞周期重入中起着关键作用。因此，开始了实验，以确定福斯家庭成员，c-福斯和fosB公司，将揭示福斯家族在细胞增殖和促进识别细胞周期中Fos蛋白的靶点。

材料和方法

结果

生成携带c基因突变的小鼠-福斯和fosB公司基因，每一个单一突变的小鼠杂合子被杂交(三,20).fosB公司^−/−c-福斯^−/−小鼠以正常孟德尔频率出生，并发现与之前在c区检测到的缺陷相同-福斯^−/−小鼠，即骨质疏松症，体积小，牙齿萌出失败（数据未显示）。c的生存-福斯^−/−小鼠不受其fosB公司基因型，当c-福斯^−/−和fosB公司^−/−c-福斯^−/−对小鼠进行比较（数据未显示）。然而，c的体重测量-福斯^−/−和fosB公司^−/−c-福斯^−/−老鼠透露fosB公司^−/−c-福斯^−/−小鼠明显小于c-福斯^−/−老鼠。平均而言fosB公司^−/−c-福斯^−/−老鼠比c小30%-福斯^−/−大约3周龄的小鼠（图。​（图1）。1). 一种可能性是fosB公司^−/−c-福斯^−/−小鼠是由于细胞增殖障碍所致。尽管我们还没有确定发育过程中的增殖受损是否是细胞大小减少的原因fosB公司^−/−c-福斯^−/−下面对这些小鼠的成纤维细胞进行的分析显示，它们在生长停滞后重新进入细胞周期的能力有缺陷。

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图1

的平均重量fosB公司^−/−c-福斯^−/−小鼠（双）和c-福斯^−/−小鼠（c-福斯)与相比fosB公司^−/−老鼠(fosB公司)和野生型小鼠（wt）。每只动物在五窝中的体重fosB公司^−/−c-福斯^−/−小鼠在19至23天龄时进行测定，并结合先前关于野生型和fosB公司^−/−年龄相同的老鼠。之间的重量差异fosB公司^−/−c-福斯^−/−小鼠和c-福斯^−/−小鼠具有统计学意义(P（P）< 0.03). 在野生型或fosB公司^−/−小鼠和fosB公司^−/−c-福斯^−/−鼠标或c-福斯^−/−所有老鼠P（P）值<0.0001。

如前所示，野生型，fosB公司^−/−c-福斯^+/+、和fosB公司^+/+c-福斯^−/−成纤维细胞在培养中呈指数级增殖，并能有效地从G细胞重新进入细胞周期₀血清刺激后（图。​（图2a）。2a） ●●●●。相反，fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞在连续培养中增殖非常差（图。​（图2a）2a） G后经血清刺激₀逮捕，穿越G₁无效且未能以显著的速率进入S期，如BrdU染色所示[^三H] 胸腺嘧啶掺入（图。​（图2b2b和c）。BrdU染色也观察到S期进入缺陷fosB公司^−/−c-福斯^−/−连续循环条件下的成纤维细胞（见图。​图3c三c和​和5b）。5b） ●●●●。尽管它们未能扩散，fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞仍然附着在组织培养皿上，没有显示出凋亡细胞死亡的证据，并且在长达2周的时间内看起来是健康的（数据未显示）。有趣的是，fosB公司^−/−c-福斯^+/−成纤维细胞在培养中正常增殖，而fosB公司^+/−c-福斯^−/−成纤维细胞的增殖能力与fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞（图。​（图2a2a和c）。单份c-福斯或fosB公司促进成纤维细胞增殖可能是由于c-福斯和fosB公司无论是在其特定功能上还是在其表达水平上。

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图2

（a） 成纤维细胞低密度生长。在电镀后的指定日期，采集并计数两个盘子。fosB公司^−/−c-福斯^−/−与fosB公司^+/−c-福斯^−/−，重复测量方差分析无显著差异（见材料和方法）。在生长良好的四种基因型和生长不良的两种基因型之间P（P）值<0.0001。（b） 刺激20小时后（上面板）和相同区域的Hoechst染色后（下面板）加入BrdU。放大倍数，约×33。（c） 成立[^三H] 在血清饥饿和刺激指定的小时数后，胸腺嘧啶进入DNA。fosB公司^+/+c-福斯^+/+与fosB公司^+/−c-福斯^−/−,P（P）= 0.001;fosB公司^+/+c-福斯^+/+与fosB公司^−/−c-福斯^−/−,P（P）= 0.0003;fosB公司^+/−c-福斯^−/−与fosB公司^−/−c-福斯^−/−，无显著性差异。（d） 成纤维细胞高密度生长。在细胞数量上没有发现显著差异。

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图3

（a和b）北方斑点。上部面板包括感兴趣的基因，下部面板包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。每条通道包含10μg总RNA，所有时间都是刺激小时数。显示了两个具有代表性的IEG，zif268型和6月B日（a） 和两个晚期基因cyclin D2和transin（b）。（c） 用c的表达式拯救S相进入-福斯在连续循环条件下。白条，载体转染成纤维细胞；黑色条，c-福斯-转染成纤维细胞。转染载体与c-福斯-转染的fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞，P（P）= 0.006.

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图5

（a） 细胞周期蛋白D1的生长曲线^−/−成纤维细胞以与图中相似的密度培养。​图2a。2a.在指定的日期确定细胞数量。细胞周期蛋白D1的每个点^−/−成纤维细胞代表至少重复进行的四个实验的平均值±标准误差。野生型成纤维细胞的每个点代表至少两个重复进行的实验的平均值±标准误差。细胞周期蛋白D1^+/+与细胞周期蛋白D1相比^−/−,P（P）< 0.03. （b） 通过表达细胞周期蛋白D1拯救S期进入fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞在连续循环条件下。纵坐标显示包含BrdU的转染细胞的百分比。CMV表示载体转染的成纤维细胞，CMV cyclin D1表示cyclin D转染的纤维细胞。P（P）载体转染和细胞周期蛋白D1转染之间的差异为0.008fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞，以及P（P）对于野生型成纤维细胞中的相同差异为0.0002。

与…对比fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞以低至中等密度镀膜，fosB公司^−/−c-福斯^−/−高密度镀膜的成纤维细胞在培养中正常增殖（图。​（图2d）。2d） ●●●●。这一观察结果表明，在较低的电镀密度下-福斯-和fosB公司-依赖性途径对G至关重要₁发展并进入S相，但在高电镀密度下，其他途径可以替代c相-福斯-和fosB公司-依赖性通路可能被激活。

的失败fosB公司^−/−c-福斯^−/−以较低密度生长以有效进入S期的成纤维细胞并不是由于这些细胞对血清反应的普遍损害。Northern分析表明，表征血清增殖反应的基因表达模式在fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞低密度生长。诱导IEG的时间和范围c-myc公司,努尔77,zif268型、和6月B日在中类似磷硼^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞和野生型成纤维细胞中，尽管IEG在突变成纤维细胞内的表达在较长时间内保持升高（图。​（图3a三a和数据未显示）。IEG水平持续升高磷硼^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞与瞬时转染研究结果一致，研究表明c-Fos和FosB调节IEG转录的关闭(11,29). 持续诱发IEG不太可能与我们发现的S相进入受损有关，因为IEG水平升高通常与S相进入改善相关(25,37,45).

除了IEG导入外，G中的几个后续事件₁通常发生在fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞。编码细胞周期蛋白D2和蛋白酶转运蛋白的延迟反应基因在静止状态下正常诱导fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞接触血清（图。​（图3b）。三b） ●●●●。生长因子对transin的刺激以前已经证明是由transin基因调控区内的AP-1位点介导的(8,21). transin对血小板衍生生长因子和表皮生长因子的反应，但不是12-O（运行）-发现十四酰基佛波醇-13-乙酸酯（TPA）在-福斯^−/−建立3T3细胞系(18). 我们的发现是血清能正常诱导转氨酶fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞很可能与这些观察结果一致，因为fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞可能会模拟TPA等因子的作用，这些因子能够在已建立的细胞中诱导正常的转氨酶表达-福斯^−/−Hu等人使用的细胞系(18). transin和其他延迟反应基因在fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞可能反映了弗拉（fra）-1,弗拉（fra）-或其他基因来补偿c的损失-福斯和fosB公司综上所述，这些实验表明，在血清刺激野生型成纤维细胞期间诱导的基因表达程序在fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞和突变成纤维细胞中的生长异常可能是由于一种特定的而非整体的缺陷。

如果如预期fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞是c丢失的直接结果-福斯和磷硼c的表达不是继发于发育缺陷或随机突变-福斯或fosB公司在里面fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞应该恢复这些双突变成纤维细胞进入S期的能力。为了探索这种可能性，c-福斯被重新引入fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞。c-福斯之所以被选中是因为存在一个c等位基因-福斯，但不是fosB公司在上述细胞周期研究中，对正常细胞增殖来说是足够的。用CMV–c转染成纤维细胞-福斯表达载体或空CMV表达载体，以及CMV-lacZ公司标记转染细胞。在两个实验范式中评估DNA合成，其中一个范式中，转染后成纤维细胞持续循环约42小时（图。​（图3c）三c） 另一种方法是将成纤维细胞的血清饥饿12小时，然后加入20%的FBS进行刺激（数据未显示）。两种范式的结果是相同的。转基因fosB公司^−/−c-福斯^−/−巨细胞病毒c型成纤维细胞-福斯导致fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞合并BrdU，而对野生型成纤维细胞中BrdU的合并几乎没有影响。这个fosB公司^−/−c-福斯^−/−转染CMV–c的成纤维细胞-福斯以与野生型成纤维细胞相似的速度进入S期（图。​（图3c）。三c） ●●●●。这些发现表明-福斯通过转染表达可以作用于G₁挽救……的生长缺陷fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞。因此，细胞周期进展中的缺陷fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞严格来说是由于缺乏c-福斯和fosB公司并不是仅次于这些细胞的其他扰动。

为了确定c-Fos和FosB的关键靶点，我们研究了在磷硼^−/−c-福斯^−/−G期成纤维细胞₁细胞周期的阶段。我们发现，尽管在血清刺激的几个小时内，野生型成纤维细胞中诱导了细胞周期蛋白D1 mRNA和蛋白的水平（图。​（图4a），4a） ，暴露fosB公司^−/−c-福斯^−/−血清成纤维细胞未能诱导细胞周期蛋白D1 mRNA或蛋白（图。​（图4a4a和c），即使在突变细胞中诱导了细胞周期蛋白D2（图。​（图3b）。三b） ●●●●。因此，我们以截短的视网膜母细胞瘤蛋白为底物评估了细胞周期蛋白D1相关激酶的活性水平。在野生型成纤维细胞中，通过8到12小时的血清刺激，激酶活性被诱导大约四倍，而在fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞（图。​（图4d）。4d） ●●●●。尽管野生型成纤维细胞中的细胞周期蛋白D1相关激酶活性在18小时下降，然后在24至28小时再次上升（图。​（图4d4d和数据未显示），细胞周期蛋白D1 mRNA水平在此期间保持升高。细胞周期蛋白D1 mRNA的长时间升高可能反映了对mRNA稳定性的影响或血清刺激细胞群的同步性丧失。

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图4

（a） 血清饥饿和刺激指定小时数后，用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）控制细胞周期蛋白D1 mRNA的Northern印迹。图中的值是在荧光成像仪上量化的四个Northern印迹的细胞周期蛋白D1值归一化为GAPDH值的平均值±标准误差。fosB公司^+/+c-福斯^+/+与fosB公司^−/−c-福斯^−/−,P（P）< 0.04. （b） 血清饥饿和刺激后用GAPDH控制细胞周期蛋白A mRNA的诱导。（c） 血清饥饿和刺激指定小时数后，细胞周期蛋白D1（顶部）和A（底部）的蛋白质印迹。（d） 细胞周期蛋白D1与谷胱甘肽相关的cdk活性S公司-转移酶–RB作为底物。对来自野生型和fosB公司^−/−c-福斯^−/−血清饥饿和刺激后的成纤维细胞达到指定的小时数。图中的数值代表了实验数据的定量，如图所示，这是三个实验数据的代表；在本例中，野生类型实际上是fosB公司^+/−c-福斯^+/+.横轴，刺激小时数。

血清诱导细胞周期蛋白D1 mRNA、蛋白和相关cdk活性的失败磷硼^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞可能解释了在这些突变细胞中观察到的细胞周期进展缺陷。支持这种可能性的是，血清诱导细胞周期重入的失败与血清诱导周期蛋白D1 mRNA表达的失败相关。单个突变体的血清刺激磷硼^−/−或c-福斯^−/−成纤维细胞有效诱导细胞周期蛋白D1 mRNA表达和细胞周期重入（数据未显示）。相比之下，fosB公司^+/−c-福斯^−/−成纤维细胞未能诱导细胞周期蛋白D1 mRNA表达或对血清的反应导致细胞周期重入（数据未显示）。

为了确定细胞周期蛋白D1在fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞具有特异性，在野生型和fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞。cyclin D2和cyclin E蛋白在野生型和磷硼^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞（数据未显示）。然而，细胞周期蛋白A蛋白的诱导在fosB公司^−/−c-福斯^−/−与野生型细胞中检测到的水平相比，其峰值水平显著降低（图。​（图4c）。4c） ●●●●。由于细胞周期蛋白A的诱导作用在fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞、野生型成纤维细胞cyclin A mRNA水平和fosB公司^−/−c-福斯^−/−比较成纤维细胞。细胞周期蛋白A mRNA水平没有差异（图。​（图4b）4b） 突变体和野生型细胞之间，表明c-福斯和fosB公司不影响细胞周期蛋白A的转录。因此，c的影响-福斯和fosB公司细胞周期蛋白A蛋白表达的突变可能是细胞周期蛋白D1 mRNA和蛋白表达改变的次要结果，这种改变在G₁.

野生型和非野生型细胞周期蛋白表达分析fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞提示c的关键功能-福斯和fosB公司在野生型成纤维细胞中，通过直接或间接刺激细胞周期蛋白D1 mRNA和蛋白的表达来促进细胞周期进展。如果在细胞周期重入过程中诱导细胞周期蛋白D1 mRNA的失败是fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞，cyclin D1的表达应该能够挽救成纤维细胞在细胞周期进程中的缺陷。为了解决这个问题，用CMV细胞周期蛋白D1或空的CMV表达载体瞬时转染成纤维细胞，并在它们连续循环和血清饥饿和刺激后进行研究。转染细胞周期蛋白D1表达载体（而非空载体）有效地挽救了S期进入fosB公司^−/−c-福斯^−/−血清刺激后成纤维细胞（数据未显示）或持续生长时成纤维细胞。​（图5b）。5b） ●●●●。细胞周期蛋白D1的表达不足以在两种基因型的血清饥饿成纤维细胞中启动S期进入（数据未显示），这表明细胞周期蛋白D2与其他血清诱导因子共同作用调节S期进入。细胞周期蛋白D1的异位表达也显著增加了野生型成纤维细胞进入S期的百分比（图。​（图5b）。5b） ●●●●。由于增加野生型成纤维细胞中cyclin D1的水平也会刺激细胞周期的重新进入，异位cyclin D2表达对fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞可能反映了细胞周期蛋白D1的功能，而不是细胞周期蛋白D_1修复细胞缺陷的能力磷硼^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞。然而，细胞周期蛋白D1增强S期进入的能力fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞与我们的假设一致，即细胞周期蛋白D1诱导的缺失fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞是导致其增殖缺陷的重要因素。

如果细胞周期蛋白D1表达水平低fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞是阻止这些成纤维细胞进入S期的决定因素，然后是细胞周期蛋白D1缺乏小鼠的成纤维细胞(9,41)体外培养时应显示类似的增殖缺陷。虽然之前的研究没有发现这种缺陷(9)，我们的分析表明，当cyclin D1^−/−成纤维细胞密度较低，增殖不良，重新进入细胞周期的效率低下，如图所示fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞（图。​（图5a）。5a） ●●●●。我们的初步结果表明，镀cyclin D1^−/−高密度的成纤维细胞提高了其生长能力（数据未显示），与我们的研究结果类似fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞。这些观察结果表明，至少在一定的培养条件下，细胞周期蛋白D1的表达对有效的细胞周期再进入至关重要。综上所述，这些结果表明fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞至少部分是由于突变的成纤维细胞穿过G区时未能诱导细胞周期蛋白D1的表达₁.

由于c-Fos和FosB蛋白的血清诱导发生在1至2小时内，并持续至少几个小时（数据未显示），Fos家族蛋白和细胞周期蛋白D1诱导的时间过程是这样的，即Fos家族成员在细胞周期蛋白D1诱导之前有相当长的一段时间是活跃的。因此，我们进行了实验，以确定由cyclin D1启动子驱动的报告基因在转染到野生型和fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞。将含有1745 bp与萤火虫荧光素酶基因（−1745CD1LUC）相连的细胞周期蛋白D1上游调控区的报告质粒转染到野生型和磷硼^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞和适当的Fos表达构建或空载体控制。在野生型成纤维细胞中，6小时内血清可重复诱导细胞周期蛋白D1启动子（图。​（图6a）。6a） ●●●●。虽然荧光素酶活性的诱导只有大约两倍，但这种效应与Northern blotting观察到的cyclin D1的诱导在数量上相似（图。​（图4a）4a） 并且具有很高的重现性。在fosB公司^−/−c-福斯^−/−与野生型成纤维细胞相比，cyclin D1启动子驱动的荧光素酶基因的基础表达降低了30%，血清未能诱导启动子（图。​（图6a）。6a） ●●●●。然而，−1745CD1LUC的表达可以在fosB公司^−/−c-福斯^−/−c共转染成纤维细胞-福斯，表明细胞周期蛋白D1启动子诱导可以通过-福斯功能（图。​（图6a）。6a） ●●●●。c中荧光素酶活性的绝对水平-福斯-转染和血清刺激fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞的荧光素酶活性通常与受刺激的野生型成纤维细胞中的荧光素酶活性的绝对水平相当。这些结果与c-Fos和FosB通过直接或间接激活其他转录调控因子诱导细胞周期蛋白D1启动子的假设一致。然而，这些发现并不排除存在其他细胞周期蛋白D1诱导机制，也不排除其他Fos家族靶点参与细胞周期进展的可能性。

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图6

（a） 细胞周期蛋白D1启动子的诱导。野生型和fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞与细胞周期蛋白D1-核糖核酸酶报告子结构（-1745CD1LUC）和空载体对照（CMV或pBBB）或-福斯-包含表达载体（CMV c-福斯或pF4）。折叠诱导是将血清刺激样品中荧光素酶活性的平均±标准误差归一化为血清缺乏样品中荧光素酶活性平均±标准差，重复两次实验，共三次。（b） （左）−66CD1LUC的诱导。野生型（wt）和fosB公司^−/−c-福斯^−/−（mt）成纤维细胞与细胞周期蛋白D1-核糖核酸酶报告子结构（−66CD1LUC）和空载体对照（CMV或pBBB）或-福斯-包含表达式向量（pF4）。“stim”表示血清刺激样本的荧光素酶活性除以血清缺乏样本的荧光素酶活性，所有样本均与CMV或pBBB共转染；P（P）野生型和fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞。pF4表示与pF4共转染的血清刺激样品的萤光素酶活性除以血清饥饿样品的萤光素酶活性；野生型与突变体之间没有显著差异。（右）−66CD1LUC的CRE/ATF位点突变对血清饥饿型（非静止型）和血清刺激型（刺激型）野生型和fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞。wt66是−66CD1LUC，具有野生型CRE/ATF位点，mut66是−66CD1LUC，具有CRE/ATF位点的三点突变。纵坐标表示荧光素酶活性的绝对值。P（P）wt66和mut66结构之间的差异小于0.0001；P（P）野生型和fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞。（c） 用细胞周期蛋白D1启动子的CRE/ATF元件和来自成纤维细胞血清的裂解物进行凝胶迁移率变化分析，饥饿和刺激指定时间。将裂解液与非免疫血清或c-Jun、c-Fos或CREB/CREM抗体孵育。F、 c-Fos复合物；C、 CREB/CREM复合物；SS，超移络合物。1、野生型；2,磷硼^−/−c-福斯^−/−（d）利用体外转录和翻译的c-Fos和c-Jun.F和SS进行凝胶迁移率变化分析。

细胞周期蛋白D1启动子包含两个位点，可能介导Fos家族蛋白对血清的直接诱导；一个典型的AP-1站点约为-950，一个CRE/ATF站点约为-60。为了鉴定这些原代成纤维细胞中的血清反应元件，将一系列细胞周期蛋白D1启动子缺失构建物转染到野生型和突变型成纤维细胞(2,42). 尽管随着启动子的缩短，表达的绝对水平逐渐降低，但对于每个测试的构建物，包括构建物（−66CD1LUC），细胞周期蛋白D1启动子构建物在野生型成纤维细胞中的血清诱导性可重复保持仅包含周期蛋白D1 mRNA合成起始位点的66个5′核苷酸（图。​（图6b）。6b） ●●●●。与野生型成纤维细胞的结果相反，转染后，−66CD1LUC结构的诱导程度最低fosB公司^−/−c-福斯^−/−用血清刺激成纤维细胞（图。​（图6b）。6b） ●●●●。血清未能诱导细胞中的−66CD1LUC结构fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞是由于c-福斯，自联合转染fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞与c-福斯表达质粒pF4恢复了−66CD1LUC结构的诱导性（图。​（图66b） ●●●●。

cyclin D1启动子的近端66个核苷酸包括CRE/ATF-like序列5′TAACGTCA 3′，该序列能够在电泳迁移率变化分析中结合CREB/CREM蛋白(42). 已知Fos-Jun复合物与类似序列5′TGA（C/G）TCA 3′结合(5). 细胞周期蛋白D1启动子的CRE/ATF元件仅与结合Fos家族成员异二聚体和CREB相关转录因子ATF4的序列中的一个核苷酸不同(14). 为了检测CRE/ATF元件在血清诱导中的重要性，将聚集点突变引入结合CREB蛋白的−66CD1LUC结构区(42). 该−66CD1LUC-ATF突变报告子结构的基础活性降低了90%，其诱导性降低，但仍有一些诱导作用（图。​（图6b）。6b） ●●●●。这些结果表明，−60的CRE/ATF元件有助于基础表达，并可能有助于血清诱导细胞周期蛋白D1。尽管这些实验表明Fos家族可能通过细胞周期蛋白D1启动子的近端66个核苷酸直接调节细胞周期蛋白D1，但应谨慎看待这一发现。考虑到cyclin D1启动子的复杂性，随着cyclin D2启动子被截断，绝对启动子诱导的增量减少，以及c-Fos表达对−66CD1LUC的影响很小，除了Fos外，转录因子也可能调节cyclin D1转录。此外，尽管细胞周期蛋白D1启动子截断实验没有提供证据证明AP-1位点在-950参与血清诱导细胞周期蛋白D2转录（数据未显示），但AP-1位点和/或其他启动子位点仍可能在诱导内源性细胞周期蛋白D_1表达中发挥作用。

为了确定Fos家族成员是否能够通过与CRE/ATF元件直接相互作用来调节细胞周期蛋白D1的转录，我们对与该细胞周期蛋白D_1启动子元件结合的成纤维细胞核提取物中存在的复合物的性质进行了表征，并评估了这些复合物是否包含c-Fos。用包含CRE/ATF位点的23bp双链寡核苷酸进行电泳迁移率转移测定。发现了两种蛋白复合物，它们在缺乏血清的野生型成纤维细胞的提取物中含量很低，但在血清刺激后表达较高，并与CRE/ATF位点特异结合（图。​（图6c，6c、 配合物c和F）。相反，血清提取物刺激fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞表达这些蛋白复合物的水平很低（图。​（图6c）。6c） ●●●●。在野生型成纤维细胞提取物中添加抗c-Fos特异性抗体显著减少了复合物c和复合物F的形成（图。​（图6c），6c） 表明这两种复合物都含有c-Fos。其中一种复合物还含有Jun家族蛋白，因为抗-Jun抗体能够引起超位移。复合物C含有CREB相关蛋白，因为抗CREM/CREB抗体既降低了复合物C的丰度，又导致复合物C部分超位移。由于多个蛋白复合物明显与5′TAACGTCA 3′元素相互作用，体外检测到的含Fos家族复合物的重要性需要进一步分析。然而，我们观察到，在与CRE/ATF元件结合的蛋白质复合物中，有一些是血清诱导的，并被抗c-Fos抗体识别，这表明Fos家族成员c-Fos和FosB可以直接与细胞周期蛋白D1启动子结合。含有Fos的复合物在体外结合该启动子位点的能力通过对体外转录和翻译的c-Fos和c-Jun的迁移率变化分析得到了证明。虽然c-Fos、c-Jun既不是单独的，也不是c-Fos与ATF4结合到CRE/ATF元件的混合物，但c-Fos及c-Jun共同特异性地结合到该序列（图。​（图6d）。6d） ●●●●。综上所述，这些DNA迁移率变化分析表明，Fos家族成员能够在体外与细胞周期蛋白D1 CRE/ATF元件结合，尽管比AP-1位点结合更弱。鉴于细胞周期蛋白D1启动子的复杂性，多种因素同时与细胞周期蛋白D2启动子结合的可能性，以及Fos家族蛋白与CRE/ATF位点结合相对较弱，还需要进一步的实验来确定Fos家族是否在细胞周期蛋白D1基因的调控中发挥直接作用。

讨论

在本研究中，我们描述了fosB公司^−/−c-福斯^−/−在表型上与c相似的小鼠-福斯^−/−但体积明显较小。它们较小的尺寸似乎并不反映骨质疏松症或其他器官功能障碍的恶化。需要进一步研究以确定fosB公司^−/−c-福斯^−/−小鼠反映出对细胞生长或增殖的细胞自主效应或非特异性效应。然而fosB公司^−/−c-福斯^−/−小鼠体内可能表现为细胞增殖轻度受损。我们观察到fosB公司^−/−c-fos公司^−/−成纤维细胞在培养中正常生长，而低密度的生长fosB公司^−/−c-福斯^−/−和fosB公司^+/−c-福斯^−/−成纤维细胞严重受损。这一增长障碍fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞是由于S期进入缺陷引起的，与血清刺激后细胞周期蛋白D1诱导的特异性丢失相关。

正常细胞周期蛋白D1表达和D1相关激酶活性的丧失fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞可以解释这些细胞的生长障碍。我们观察到细胞周期蛋白D1^−/−成纤维细胞有增殖缺陷，细胞周期蛋白D1在fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞恢复增殖与细胞周期蛋白D1在细胞生长缺陷中的重要作用一致磷硼^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞。对细胞周期蛋白D1启动子活性的检测表明，在原代成纤维细胞中，细胞周期蛋白D2启动子的血清诱导依赖于完整的细胞周期蛋白-福斯和fosB公司基因。这些发现确立了c-Fos和FosB在细胞周期中的功能作用，并表明这两种IEG促进S期进入的一种机制是通过细胞周期蛋白D1。

目前尚不清楚细胞周期蛋白D1诱导是否失败于fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞足以解释这些细胞中检测到的严重生长缺陷。福斯家族基因可能具有as-yet-unidentified靶点，这些靶点对S期进入也至关重要。此外，其他途径可能会集中于细胞周期蛋白D1的激活。尽管如此，许多证据支持我们的假设，即细胞周期蛋白D1诱导的失败是fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞。首先，我们在fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞是细胞周期蛋白A水平的降低。由于细胞周期蛋白D1的减少先于细胞周期蛋白A的减少，因此细胞周期蛋白A的变化可能仅次于细胞周期蛋白D2的变化。其次，我们发现细胞周期蛋白D1在fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞足以恢复其在细胞周期中的进展，这与c-Fos和FosB通过细胞周期蛋白D1激活细胞周期进展的假设一致。第三，我们发现缺乏细胞周期蛋白D1的成纤维细胞在细胞周期进展中表现出类似的密度依赖性缺陷。已知细胞周期蛋白D1的阈值丰度对G至关重要₁进展(30,32,33)基础和血清诱导的细胞周期蛋白D1表达减少fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞可能是其未能进入S期的原因。细胞周期蛋白D1水平的降低是由于c-Fos和FosB的丢失，这与以前的研究一致，这些研究表明Fos过度表达诱导细胞周期蛋白D_1(25). 此外，启动子分析表明Fos和/或Jun家族蛋白在细胞周期蛋白D1的激活中起作用(30,44).

迄今为止，在磷硼^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞是血清刺激后IEG水平的长期升高。IEG的下调被认为对有效的细胞周期控制很重要，因为过度表达导致的IEG水平升高与S期进入增强有关。在fosB公司^−/−c-福斯^−/−细胞周期蛋白D1的诱导受到损害的成纤维细胞，这种持续的IEG升高不足以导致细胞增殖增强。然而，IEG转录在fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞提供了证据，证明c-Fos和FosB在多个IEG的转录关闭中起着关键作用，正如转染实验所表明的那样，其中c-Fos与FosB均被显示抑制细胞的活性-福斯和fosB公司发起人(11,23).

我们的观察结果是磷硼^+/−c-福斯^−/−成纤维细胞受损程度与fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞提示fosB公司不足以激活细胞周期蛋白D1或其他靶基因，使其达到足以恢复细胞周期进程的水平。基因剂量的观察fosB公司非常重要是有趣的，但不是前所未有的。在MyoD和我的朋友-5，尽管MyoD^−/− 我的朋友-5^+/+小鼠正常，MyoD^−/− 我的朋友-5^+/负极小鼠肌肉形成部分受损，严重到足以导致围产期死亡(36). c的单个等位基因效力的明显差异-福斯和fosB公司这意味着这两个基因座必须有一些功能差异。一种可能性是交替拼接短fosB公司信使核糖核酸编码一种以显性负性方式发挥作用的蛋白质，从而降低全长FosB的净活性。或者，可能需要一定的c-Fos和FosB的最低总量，并且c-Fos的表达水平高于FosB。

我们观察到fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞可以通过在非常高的密度下进行电镀来克服，这引发了有趣的问题。首先，值得注意的是，我们实验中使用的最低电镀密度与之前描述的许多细胞周期进展研究中使用的电镀密度相当或更高(4,18)在标准实验条件下，我们对生长受损的观察非常明显和引人注目。为什么这种增殖缺陷会在高细胞密度下被克服尚不清楚：细胞可能分泌更多的生长因子来调节培养基，或者它们可能受到细胞间接触的刺激。初步实验表明，来自高密度细胞的条件培养基不足以挽救低密度细胞的生长(第27页). 此外，在BrdU掺入实验中，我们注意到细胞密度有时会产生显著的局部效应，其中细胞团中的单个细胞进入S期的速度高于分布良好的细胞。这些观察结果表明，细胞间的相互作用可能对fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞有效进入S期。无论是何种机制，S相进入都发生在福斯-在密集的文化中保持独立的态度。有趣的是，我们观察到细胞周期蛋白D1的生长^−/−成纤维细胞也通过高密度电镀而得到改善（数据未显示）。这一结果表明，高密度下S相进入的机制不仅是福斯独立，但也不依赖于细胞周期蛋白D1，并可能涉及其他细胞周期蛋白的激活。

由于细胞周期蛋白D1的生长缺陷^−/−和fosB公司^−/−c-福斯^−/−成纤维细胞可能具有一些共同的特性，令人感兴趣的是这两种细胞周期蛋白D1^−/−和fosB公司^−/−c-福斯^−/−小鼠生长发育严重受损。大约3周龄时，两个细胞周期蛋白D1^−/−和fosB公司^−/−c-福斯^−/−小鼠大约比野生型小鼠小50-60%(9,41). 虽然这一结果的解释因骨结石而变得复杂fosB公司^−/−c-福斯^−/−这一发现令人震惊，表明Fos家族介导的细胞周期蛋白D1激活可能在体内具有重要意义。然而，细胞周期蛋白D1的视网膜和乳腺缺陷证明，激活细胞周期蛋白D_1有明显的替代途径^−/−尚未在fosB公司^−/−c-福斯^−/−老鼠(27亿). 两种不同突变小鼠的视网膜缺陷缺乏一致性，可能是由于其他Fos家族成员在视网膜中的持续表达导致的fosB公司^−/−c-福斯^−/−小鼠或通过替代Fos家族独立机制上调视网膜细胞中的cyclin D1。如果细胞周期基因的激活机制是细胞类型特异性的，或者如果特定Fos家族蛋白的细胞类型特异性丰度决定了在缺乏一个或两个家族成员的动物中观察到的表型，这就不足为奇了。为了支持这一假设，不同的蛋白质复合物结合到不同细胞类型中cyclin D1启动子的血清反应区(第31页).

鉴于其对成纤维细胞增殖的显著影响磷硼^−/−c-福斯^−/−鼠标是相对微妙的。尽管c之间的大小差异-福斯^−/−和fosB公司^−/−c-福斯^−/−小鼠对体内细胞增殖有显著影响，任何相关的生存能力损失似乎都很小。可能是通过以下方式获得补偿福斯-体内存在独立的通路，就像在体外高细胞密度时一样。如果是这样，额外的实验可能会在体内发现这种增殖缺陷的其他表现。例如，伤口愈合可能是低生长密度的体内等效物，因此可能在fosB公司^−/−c-福斯^−/−老鼠。此外，fosB公司^−/−c-福斯^−/−可能发现小鼠对肿瘤发生具有异常的抗性，或者在其他细胞类型如淋巴细胞中表现出受损的增殖。需要进一步的实验来确定细胞增殖缺陷的所有表现fosB公司^−/−c-福斯^−/−老鼠。

致谢

参考文献