应激反应使细胞和有机体能够快速应对极端条件，如高渗压、氧化剂和热休克；寄生虫、病毒和细菌的感染和入侵；以及暴露在X射线和紫外线下(4,45). 太阳紫外线对人类的主要环境影响之一。它刺激黑色素生成，导致皮肤变红和发炎，诱导促炎细胞因子，并促进皮肤过早老化和皮肤癌。然而，紫外线不仅导致细胞破坏，而且还诱导许多基因的转录，包括编码转录因子、生长因子、病毒蛋白和蛋白酶的基因。这种诱导反应被称为“哺乳动物的紫外线反应”(25,81). 最近的证据表明，紫外线反应可以起到DNA修复以外的保护作用(26). 紫外线的主要目标被认为是染色体DNA损伤，而染色体DNA损伤又会提供触发反应的主要信号(76,83). 然而，Ras、Src和位于质膜或其附近的其他分子的快速紫外线活化，反对将DNA损伤作为主要信号，这表明紫外线反应并不总是需要核信号(26,27). 事实上，在紫外线照射细胞中检测到的第一个细胞反应是酪氨酸残基处不同细胞膜生长因子受体的磷酸化(77). 通过生长因子预刺激、苏拉明（一种相当特异的生长因子受体作用抑制剂）或显性负性表皮生长因子受体突变体的表达预先下调生长因子受体信号，可以抑制紫外线反应(77). 此外，最近有研究表明，紫外线照射抑制酪氨酸磷酸酶，这种紫外线诱导的抑制导致生长因子受体磷酸化水平升高，从而导致紫外线应答基因的信号传递和转录(44). 总之，紫外线诱导的信号级联似乎很复杂。无论何时产生，紫外线信号似乎都会到达细胞膜并激活三组丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），这三组蛋白激酶参与三种不同的信号通路，介导紫外线诱导的转录因子激活。首先检测到紫外线对细胞外调节激酶1和2（ERK1/2）或p42-44 MAPK信号通路的激活(68). 它涉及Ras和Raf激活后质膜酪氨酸激酶的激活。Raf激活MEK（MAP激酶-ERK激酶），进而激活ERK。ERK磷酸化各种转录因子，包括TCF/Elk-1、ATF2和c-Myc（参考文献综述19). 该途径是细胞生长和分化的关键调节元件，介导对酪氨酸激酶受体激动剂的反应。然而，应激更强烈地诱导MAP激酶JNK/SAPK（c-Jun N末端激酶-应激激活蛋白激酶）和p38，这两种激酶均与生长因子去除触发的凋亡诱导有关(89). JNK最初被描述为一种紫外线光激活激酶，通过Ser-63和Ser-73的磷酸化激活c-Jun(26,38). 与所有MAPK一样，JNK由名为JNKK1的MAPKK激活(55)（瑞典克朗[80]或MKK4[24])，但不是MEK；反过来，JNKK1被一个名为MEKK1的MAPKKK磷酸化并激活(55,80). 最近，JNK的一种细胞质抑制剂，JNK-interacting protein 1（JIP-1），被鉴定出来，确立了蛋白靶向作为一种替代机制，通过应激激活的MAP激酶调节信号传导(28). 第三个MAPK亚家族p38（也称为CSBP、RK、Mxi2和SAPK2a）是酵母MAPK-Hog-1（高渗压甘油反应1）激酶的同源物(35,51,75,90)并且被MEK家族成员MKK3磷酸化和活化(24). 除了p38的原始亚型（现在称为p38α）外，还发现了另外三个p38激酶家族成员，命名为p38β（SAPK2b）(41)，p38γ（SAPK3/ERK6）(49,54,59)和p38δ（SAPK4）(31,42,86); 它们都可以被一种新的MAP激酶MKK6磷酸化并激活(36,70). 除了磷酸化c-Jun蛋白外，JNK还可以磷酸化ATF2和TCF/Elk-1(11,33,56)而p38可以激活底物，如ATF2(41)，MAPKAP-K2/K3(13,58,75)，锰1/2(32,88)，CHOP公司(87)和Elk-1(67). 有人认为，紫外线诱导的JNK通过激活编码保护蛋白的基因触发保护性反应(23,26,48). p38似乎还参与刺激单核细胞产生细胞因子，并调节血小板对胶原蛋白的聚集反应(51,78).
尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）是第一种在着色性干皮病细胞中诱导的蛋白，其紫外线剂量远低于亲代杂合细胞(64)这表明DNA损伤可能是导致这种诱导的原因。此外，提出了一种紫外线诱导的分泌因子来介导低修复能力人胎儿成纤维细胞中uPA的诱导(72,74). 然而，这些报告与前面提到的发现形成对比，这些发现表明，紫外线通过生长因子使用的途径激活细胞质激酶，与紫外线诱导的DNA损伤无关(26,27,77). 因此，紫外线照射和uPA诱导是如何在分子水平上联系起来的还有待解决。
uPA是一种分泌型丝氨酸蛋白酶，可将酶原纤溶酶原转化为纤溶酶，纤溶酶是一种类胰蛋白酶，能够降解细胞外基质成分并激活其他蛋白酶(79). 虽然基因失活研究表明，uPA对胚胎发育并不重要，但越来越多的证据支持uPA在生理过程中的作用，如纤维蛋白溶解和血管生成，以及在病理事件中，如肌肉再生、伤口愈合、炎症和肿瘤侵袭(8–10,18,34,47,65,82). 除了这些蛋白水解酶功能外，最近的研究还证明了uPA通过与其细胞表面高亲和力受体的相互作用而具有促有丝分裂和趋化特性(7,71). uPA的表达受多种细胞外刺激的调节，这反映了uPA的广泛功能。uPA基因转录可由生长因子、佛波酯、细胞因子、细胞骨架重组和几种癌蛋白诱导(5,6,21,40,52,53,57,63,66,73). 这些诱导大多通过MAP激酶的ERK途径发生。相反，在本研究中，我们发现uPA基因也可以通过激活JNK信号通路而诱导。具体来说，我们已经研究了紫外线诱导uPA转录的机制。这种诱导需要两个激活蛋白1（AP1）增强子序列，位于距离转录起始位点−2.4 kb的位置，并由JNK途径介导。
材料和方法
细胞培养。
小鼠成纤维细胞NIH 3T3细胞系取自美国型培养物收集，并在含有10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基中生长。小鼠畸胎瘤F9细胞系在Dulbecco改良的Eagle培养基（1:1）、10%FBS和100μMβ-巯基乙醇中生长。为了进行紫外线刺激，将细胞保存在0.5%的FBS培养基中16 h。第二天，去除并保留培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）和UVC（254 nm）（辐照30 J/m）清洗细胞2). 将保留的培养基添加回细胞中，并按照图图例所示，在辐照后的不同时间段进行分析。或者，用佛波酯TPA（12-哦-十四烷酰基佛波醇-13-醋酸盐），最终浓度为100 ng/ml。
Northern印迹分析。
使用基于Chomczynski方法的商业Ultraspec RNA分离系统（Biotecx）从NIH 3T3细胞中提取总RNA(12). 聚乙烯（A）+用QuickPrep Micro mRNA纯化试剂盒（Pharmacia）从F9细胞中获得mRNA。RNA通过1%琼脂糖凝胶电泳进行大小分级，转移到尼龙膜上，并进行紫外线交联。如前所述进行膜预杂交、探针杂交、洗涤和放射自显影(65). 用于RNA杂交的cDNA探针标记有[α-32P] dCTP通过使用商业Megaprime DNA标记系统（Amersham）进行标准随机寡核苷酸引物反应。uPA和GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）(65)和c-六月和c-福斯(25)前面已经描述过探针。
逆转录酶（RT）PCR和Southern印迹。
为了分析紫外线辐射后早期时间点的uPA诱导，在6×105细胞/100-mm直径培养皿，在10%FBS中培养12h，转移到0.5%FBS中16h，然后用紫外线照射细胞。在辐射后的不同时间点提取总RNA，并使用2μg样品用第一链cDNA合成试剂盒（Pharmacia）合成最终体积为15μl的cDNA。然后，使用5μl进行多重PCR，将寡核苷酸5′-TAGAGCCTTTCTGGCCACACTG-3′和5′-GGCAGTGTACTGGAGCTCT-3′定位到小鼠uPA外显子3和7(22)分别和小鼠G3PDH引物（Clontech）用作最终体积为50μl（20 mM Tris-HCl，pH 8.4；50 mM KCl；1.5 mM MgCl）的内部对照2; 每个脱氧uclcoside三磷酸盐的0.2 mM浓度[dNTP]；每个底漆的0.5μM浓度；和2 U塔克聚合酶）。扩增参数为94℃1 min、55℃1 min和72℃3 min。在线性扩增范围内（15个周期），从分析中取出两份10μl等分样品，并在两份独立的1%琼脂糖凝胶中运行。将凝胶浸泡在变性溶液（0.4 N NaOH，1 M NaCl）中1 h，进一步中和（1 M Tris-HCl，pH 7.4；1.5 M NaCl）1 h，印迹，并与α-32P标记的uPA和G3PDH探针。剩下的PCR混合物再进行20个周期，在1%琼脂糖上运行，溴化乙锭染色以验证正确的扩增产物。
质粒。
p-6.6Luc小鼠uPA启动子荧光素酶报告质粒包含6.6 kb的小鼠uPA基因启动子区域，之前已进行过描述(6). p-2.0Luc（小鼠uPA启动子的−2 kb）和p-4.2Luc（鼠uPA启动程序的−4.2 kb）是从p-6.6Luc中提取的，用Sma公司我和其中一个Nhe公司我或Hin公司dII，并且用T4 DNA聚合酶填充主干并重新门控。p-4.2（ΔPEA3/AP1A类)Luc是通过结合来自p-6.6（ΔPEA3/AP1）的DNA片段获得的A类)吕克(6)和p-4.2Luc。胸腺嘧啶激酶驱动的荧光素酶报告载体ptk-Luc通过克隆生态RI公司-Bgl公司II片段对应于将胸苷激酶基因−80到52 bp的位置映射到pSP73并将a亚克隆囊我-Bgl公司II片段为pGL2-basic（Promega）。聚合链接剂Sma公司进一步利用ptk-Luc的I位点克隆双链寡核苷酸的单一或多重拷贝。p3xAP1基因B类-tk-Luc含有三个拷贝的鼠AP1B类寡核苷酸（5′-GGCGATGTGAATCGACAGCCTG-3′，图位：−2369和−2345）和p6xPEA3/AP1A类-tk-Luc包含六个寡核苷酸拷贝（5′-GAGGAAAATGAGGTCATCTTGCTG-3′，映射位置：−2454和−2429）。这两种寡核苷酸均用于PCR扩增包含整个PEA3/AP1的小鼠uPA AP1增强子A类、COM和AP1B类生成pPEA3/AP1的元素A类-通信-AP1B类-tk-卢克。p3xAP1（col）-tk-Luc包含三个人类胶原酶AP1结合位点拷贝，该位点插入胸苷激酶基因最小启动子上游。表达载体pcDNAIII-HA-JNK1、pcDNAIII-HA-ERK-2、pSRα-MEKK1（K432M）、pCEVZ9-MEKK1、pcDNAIII-MKK6b（A）、pcDNAIII-JIP-1、pRSV-cJun和pRSV-c Jun（Ala-63/73）均已在前面描述过(14,15,23,28,36,61).
蛋白质印迹。
细胞在0.5%的FBS中培养，在照射后的指定时间点，通过在20 mM HEPES（pH 7.5）、10 mM EGTA、40 mMβ-甘油磷酸、1%Nonide P-40、2.5 mM MgCl中溶解细胞来制备全细胞提取物（WCE）2、2 mM原钒酸盐、1 mM二硫苏糖醇（DTT）、1 mM-苯甲基磺酰氟（PMSF）、抑肽酶和亮氨酸蛋白酶（每毫升1μg）。用圣克鲁斯生物技术公司的特异性抗体sc-474免疫印迹法在WCE中检测到JNK1蛋白。使用ECL检测系统（Amersham）进行并开发免疫印迹。
蛋白激酶分析。
用抗JNK1抗体sc-474从WCE中免疫沉淀JNK，用蛋白A-Sepharose回收免疫复合物。依次用1%Nonide P-40和2 mM原钒酸钠在PBS中洗涤珠子三次，一次用100 mM Tris-HCl（pH 7.5）–0.5 M LiCl，一次使用激酶缓冲液（20 mM HEPES-NaOH，pH 7.6；2 mM DTT，20 mMβ-甘油磷酸，20 mM-MgCl2; 100μM原钒酸钠）。磷酸化反应在含有30μl体积的激酶缓冲液中进行，该缓冲液补充有20μM ATP，0.5μCi的[γ-32P] ATP和1μg谷胱甘肽-S公司-转移酶（GST）–c-Jun底物在30°c下放置30分钟，通过添加4×Laemmli样品缓冲液停止，并通过十二烷基硫酸钠–10%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行解析。
转染分析。
用脂质体介导的转染试剂DOTAP（Boehringer Mannheim）转染报告质粒。第一，2.5×104细胞接种在24孔培养皿上过夜。第二天，用300 ng uPA-luciferase质粒和5 ng肾素荧光素酶质粒pRL-SV40共同转染细胞作为内部对照。转染后，在UVC刺激（254nm，30J/m2)16或24小时后分析报告者活性。如有指示，用150 ng报告质粒和150 ng表达质粒或单独用空载体和5 ng内部对照共同转染细胞。在紫外线照射前，分别用50μM PD98059和10μM SB203580（钙生物化学）预处理转染细胞30分钟，以抑制MEK和p38激酶。萤火虫荧光素酶活性标准化为肾小球荧光素酶活性，用作内部对照。所有转染至少重复三次，变异性小于25%。学生的t吨测试用于验证结果。
电泳迁移率变化分析（EMSA）。
紫外线照射后，从NIH 3T3细胞中获得核提取物。按照De Cesare等人的描述提取核蛋白(20). 简单地说，将细胞在冷PBS中清洗两次，然后刮除，将细胞颗粒重新悬浮在10 mM HEPES（pH 7.9）–10 mM KCl–1.5 mM MgCl中2–0.1 mM EGTA–0.5 mM DTT在冰上。将细胞通过26号针头五次，离心收集细胞核，随后将其重悬于等体积的10 mM HEPES（pH 7.9）–0.4 M NaCl–1.5 mM MgCl中2–0.1 mM EGTA–0.5 mM DTT–5%甘油，通过在4°C下轻轻摇晃30分钟来洗脱核蛋白。在14000 rpm和4°C条件下，将核粒造粒5分钟，然后将上清液等分，在液氮中快速冷冻，并在−80°C下保存，直至使用。所有溶液均含有蛋白酶抑制剂亮氨酸蛋白酶抑制剂和抑肽酶（1μg/ml）、PMSF（0.5 mM）和苯甲脒（1 mM）。采用生物-Rad蛋白质测定法测定蛋白质浓度。对于带移分析，将5μg部分核提取物培养在50 mM Tris-HCl（pH 7.9）–12.5 mM MgCl中2-1 mM EDTA–1 mM DTT–20%甘油–0.5 mM PMSF–2μg聚（dI-dC），室温下10分钟，在添加15000至20000 cpm标记的寡核苷酸之前滴定出非特异性结合；然后将反应混合物进一步孵育20分钟。当添加未标记的竞争性寡核苷酸或抗体时，在添加标记探针之前，在室温下将核提取物预孵育30分钟或在冰上分别孵育16小时。将样品加载到预先运行的5%聚丙烯酰胺凝胶上（0.25×TBE中29:1），并在200 V下电泳。凝胶干燥，并在−80°C下进行自动射线照相。抗c-Jun、c-Fos、ATF2和肌生成素的抗体来自Santa Cruz Biotechnologies。
EMSA中使用的寡核苷酸的感觉链序列如下：PEA3/AP1A类，5′-GAGGAAAATGAGGTCATCTTGCTCTG-3′；mut AG，5′-GAGGAAAATGAGGAGACTTGCTCTG-3′；ΔG，5′-GAGGAAAATGAGTCATCTTGCTCTG-3′；mut PEA3，5′-GAccAAATGAGGTCATCTTGCTCTG-3′；AP1（AP1）B类，5′-GGCAATGTGAATCACGACAGCCTG-3′；TRE列，5′-CGCTTGAGTCAGCCGGAA-3′；cjun2 TRE，5′-AGCATTACTCATCCC-3′；和IgkB，5′-CAGAGGGGACTTTCCGAG-3′。
结果
紫外线诱导小鼠uPA mRNA表达。
如图所示。A、 NIH 3T3成纤维细胞表达2.7 kb转录物，该转录物与小鼠uPA mRNA相对应，在UVC照射后表达量增加。uPA基因诱导的增加自辐照后3小时首次观察到以来呈时间依赖性，在7小时进一步增加，并在紫外线处理后约20至24小时达到最大值。相比之下，紫外线在照射后7小时左右对F9小鼠畸胎瘤细胞的uPA mRNA诱导最大（图。B） ，表明紫外线诱导小鼠uPA基因遵循不同的诱导动力学，这取决于细胞类型。这种诱导并不是由于RNA合成的非特异性上调，因为紫外线照射并没有显著改变两种细胞系中GAPDH mRNA的水平。佛波酯TPA，已知可在不同细胞类型中诱导uPA基因(21,52,66)，包括在这些实验中进行比较。TPA治疗导致NIH 3T3细胞在6小时时uPA mRNA的最大诱导，这一发现与之前的结果一致(6)然而，它不能诱导F9细胞中uPA的表达（图。). 这些结果表明，紫外线和其他细胞外刺激（如TPA）诱导内源性uPA基因存在不同的作用机制。
紫外线照射诱导uPA。（A） 紫外线刺激NIH 3T3成纤维细胞uPA mRNA表达分析。NIH 3T3细胞在0.5%FBS中培养16 h，然后用紫外线照射或TPA处理。在UVC和TPA刺激后的指定时间点提取总RNA，并用小鼠uPA和GAPDH cDNA探针通过Northern印迹进行分析。（B） 紫外线刺激F9畸胎癌细胞uPA mRNA表达分析。F9细胞在0.5%FBS中培养16 h，然后暴露于UVC或TPA。聚乙烯（A）+在指定的时间点提取mRNA，并通过Northern blotting对A组进行分析。
紫外线诱导小鼠uPA基因在NIH 3T3细胞中的转录分析。
接下来，我们研究了紫外线照射对小鼠uPA基因启动子活性的影响。为此，将一个小鼠uPA基因组片段（−6.6 kb至−398 bp）连接到萤火虫荧光素酶报告基因p-6.6Luc的上游(6)对NIH 3T3细胞中的荧光素酶活性进行了评估。对未刺激细胞和紫外线刺激细胞之间p-6.6Luc产生的荧光素酶活性的比较表明，紫外线处理后uPA启动子活性平均增加9.5倍（图。)，表明小鼠uPA启动子包含紫外线响应序列，可能至少部分解释了这些细胞中紫外线介导的uPA诱导。为了确定uPA对紫外线转录反应的主要区域，从p-6.6Luc中生成不同的小鼠uPA启动子缺失荧光素酶结构体，并在NIH 3T3细胞中瞬时转染后分析其紫外线诱导荧光素酶活性。如图所示。A、 从−6.6-kb WPA启动子中删除1.8和2.4 kb（分别产生质粒p-4.8Luc和p-4.2Luc）不会改变全长−6.6 kb启动子质粒的荧光素酶诱导(P（P）>0.05），表明这些上游启动子区域与紫外线在这些细胞中诱导uPA转录无关。然而，尽管p-4.2Luc保留了全部紫外线诱导的荧光素酶活性，但含有2 kb小鼠uPA启动子的质粒p-2.0Luc的荧光素酶活性降低了80%(P（P）<0.01）（图。B） ，清楚地表明了顺式-与紫外线诱导uPA转录相关的作用元件。
小鼠uPA启动子缺失结构对紫外线的反应的转录活性。AP1增强器元件的要求。（A） 紫外线照射构建uPA启动子缺失的转录诱导。用不同长度的uPA启动子荧光素酶构建物瞬时转染NIH 3T3细胞，然后在0.5%FBS中生长约16h，然后进行UVC刺激。在照射后24小时分析荧光素酶活性，相对于在未诱导细胞中使用−2-kb uPA启动子结构（p-2.0Luc）发现的活性进行表达，并对肾小球荧光素酸酶活性进行标准化。所有数值均表示五个实验的平均值。uPA 5′-缺失构建体的长度在每个条的下方指示。（B） PEA3/AP1的要求A类和AP1B类紫外线诱导uPA启动子的位点。用缺乏PEA3/AP1的不同uPA启动子荧光素酶构建物瞬时转染NIH 3T3细胞A类仅现场[p-4.2（ΔPEA3/AP1A类)Luc]或同时使用PEA3/AP1A类和AP1B类位点（p-2.0Luc），并按照A组所述进行照射。荧光素酶活性表示为uPA启动子质粒（p-4.2Luc）在UVC照射细胞中包含两个AP1位点的活性百分比，该值为100%。（C） 异源启动子上多聚uPA-AP1位点的紫外线诱导性。用含有完整uPA-AP1增强子（pPEA3/AP1）的不同报告体瞬时转染NIH 3T3细胞A类-COM-AP1公司B类)，uPA 5′-TRE的六个串联重复序列（p6xPEA3/AP1A类)或uPA 3′-TRE（p3xAP1）的三个串联副本B类)以及三个胶原酶AP1元件[p3xAP1（col）-tk-Luc]的拷贝，连接到胸苷激酶驱动的荧光素酶报告质粒。肾素活性的荧光素酶值是标准化的，并相对于无反应结构ptk-Luc的活性进行表达，其值为1.0。所有标准化活动代表至少五个实验，显示不到25%的可变性。
AP1增强子元件参与紫外线诱导小鼠uPA启动子。
小鼠uPA启动子区中存在一个AP1增强子元件，位于−2.4 kb，已知对多种细胞外刺激有反应，这表明该元件也可能对紫外线刺激有反应。uPA AP1增强子由两种佛波酯反应元件（TRE）组成：结合的PEA3/AP1A类现场（5′-TRE）和下游AP1B类位置（3′-TRE），由夹层元件（COM）隔开（见图。). 在这些元素中，PEA3/AP1A类元素已被证明对大多数诱导反应至关重要（在参考文献中进行了回顾7). 图B显示删除PEA3/AP1A类4.2中的增强子元素（ΔPEA3/AP1A类)Luc构建物减少了65%的紫外线诱导，而PEA3/AP1的缺失A类和AP1B类2.0Luc结构中的位点进一步降低了紫外线诱导的荧光素酶活性，表明这两个位点对紫外线诱导uPA的作用。因此，我们评估了uPA增强子的每个AP1位点赋予异源启动子紫外线诱导能力的能力。包含完整PEA3/AP1的109-bp片段（从−2345到−2454 bp）A类-通信-AP1B类将胸腺嘧啶激酶驱动的荧光素酶基因（ptk-Luc）上游的小鼠增强子连接到质粒pPEA3/AP1A类-通信-AP1B类-tk-Luc并测试紫外线诱导性。同样，我们评估了质粒p6xPEA3/AP1的紫外线诱导转录活性A类-tk-Luc和p3xAP1B类-tk-Luc，包含六份和三份PEA3/AP1副本A类和AP1B类元素。含有全增强子的质粒产生的荧光素酶活性约为对照质粒ptk-Luc的四倍（图。B） 而多重聚合PEA3/AP1使tk-Luc活性提高了4.2倍和3.5倍A类和AP1B类位置（图。C） ●●●●。这表明AP1增强子的两个TRE都有助于紫外线诱导的uPA启动子活性。与这些结果一致，在NIH 3T3细胞中，紫外线也诱导了含有胶原酶基因AP1结合位点三个拷贝的tk-Luc报告质粒，即质粒p3xAP1（col）-tk-Luc。
小鼠uPA AP1增强子的示意图。PEA3/AP1A类和AP1B类显示了反式激活位点和位于−2.4 kb位置（相对于mRNA起始位点）的干预COM（合作介质）序列。
PEA3/AP1A类-和AP1B类-紫外线处理的NIH 3T3细胞中的结合活性。
uPA AP1增强子的5′-TRE和3′-TRE序列分别与主要核蛋白复合物结合，经EMSA评估，NIH 3T3细胞经紫外线处理后，其强度增加（图。A） ●●●●。这两个复合物与胶原酶基因典型七肽AP1位点形成的复合物结合(列TRE)，用作参考。如图所示。B和C，当每个寡核苷酸被用作未标记竞争物时，其相应的蛋白结合复合物被完全竞争。相反，过量的无关竞争物（Igκ增强子的κB位点，Igκ的B）序列并不影响这两种复合物的形成。
紫外线照射诱导AP1与uPA增强子元件的结合活性。（A） 紫外线照射诱导uPA 5′-TRE-和3′-TRE结合活性：与胶原酶TRE的比较。NIH 3T3细胞在0.5%FBS中生长16 h，并暴露于（+）或不暴露于（-）UVC。核提取物在辐照后4小时制备，并用20000 cpm的32P标记探针，对应于5′-TRE（PEA3/AP1A类)和3′-TRE（AP1B类)uPA启动子的元件和胶原酶启动子（COL TRE）的典型TRE。如前所述进行EMSA(20). 箭头表示特定的TRE-binding复合物。（B） 诱导uPA PEA3/AP1的特异性A类结合活性。诱导4 h的NIH 3T3核提取物与标记的PEA3/AP1孵育A类在无或存在150倍摩尔过量未标记竞争对手的情况下的寡核苷酸（如材料和方法中所述）：PEA3/AP1A类、mut AG、mut PEA3和ΔG（对应uPA PEA3/AP1的变体A类位点），col TRE（人类胶原酶启动子的AP1结合位点），AP1B类（uPA AP1B类位点），cjun2 TRE（人类c的远端AP1结合位点-六月启动子）和IgκB（免疫球蛋白κ增强子的κB位点）。（C） 诱导的uPA AP1的特异性B类结合活性。诱导4 h的NIH 3T3核提取物与标记的AP1孵育B类如B组所述，寡核苷酸位点存在150倍摩尔过剩的指定竞争对手。（D）uPA PEA3/AP1A类元素在紫外线刺激下结合AP1转录因子家族成员。带有含有uPA PEA3/AP1的标记寡核苷酸的EMSAA类如图所示，在没有或存在不同抗体的情况下进行位点和4-h诱导的NIH 3T3核提取物。将提取物与针对小鼠c-Jun（αcJun）、小鼠ATF2蛋白（αATF2）、大鼠肌生成素蛋白（unsec）、小鼠c-Fos蛋白（αcFos）或无抗体（−）的特异性抗体预先孵育。（E） 紫外线诱导AP1转录因子与uPA AP1的结合B类现场。含有uPA AP1的标记寡核苷酸的EMSAB类按照面板D所述执行元件。
uPA 5′-TRE由两个基序组成，即PEA3位点和八聚体AP1A类现场。为了评估每个基序在5′-TRE结合活性中的相关性，我们合成了一个寡核苷酸，其中PEA3（GGAA）序列在两个位置发生突变。如图所示。B、 含有AP1的寡核苷酸A类位于突变PEA3（mut PEA3）两侧的位点完全竞争与放射性标记野生型PEA3/AP1的结合A类现场。此外，放射性标记野生型PEA3/AP1形成的紫外线诱导复合物的电泳迁移率A类寡核苷酸和含有突变PEA3的寡核苷酸分别是相同的（数据未显示）。相反，AP1内含有2-bp突变的寡核苷酸A类破坏一致TRE（mut AG）的元素无法竞争紫外线诱导的核因子的结合，这表明关联的特异性。总之，我们得出结论，形成紫外线诱导复合物的能力位于uPA 5′-TRE的中心八核苷酸内，PEA3侧翼元素不影响结合。此外，与uPA 3′-TRE（AP1）相对应的七聚核苷酸可以抑制复合物的形成B类)和胶原酶TRE（col TRE），但不通过c的八聚体远端TRE-六月启动子（cjun2 TRE）。与这些结果一致，我们观察到AP1内有1 bp的缺失A类位点（ΔG）是将八聚体（TGAGGTCA）序列转化为七聚体（TGAGTCA）序列的突变，与胶原酶TRE一致，与野生型5′-TRE完全竞争结合。
uPA 3′-TRE由七元AP1形成B类现场。如图所示。A、 该位点结合了一个紫外线诱导的核复合体，该复合体与uPA PEA3/AP1形成的复合体结合A类和列TRE。当AP1B类寡核苷酸被用作未标记的竞争序列，紫外线诱导的复合物被完全竞争，而多余的无关竞争序列（IgκB）不影响AP1B类-复杂地层（图。C） ●●●●。此外，这种复合物在存在col-TRE竞争序列时消失，但在存在cjun2-TRE竞争序列时不消失。这些结果表明，uPA增强子的AP1位点与紫外线诱导的复合物具有相似的性质。
接下来，我们分别使用AP1组分c-Jun和c-Fos以及相关ATF2蛋白的抗体来研究uPA 5′-和3′-TRE核复合物的组成。如图所示。D和E，5′-和3′-TRE结合活性均被抗c-Jun（αcJun）和抗c-Fos（αcFos）抗体抑制，而抗ATF2（αATF2）抗体无影响。作为对照，添加不相关的抗体（抗肌生成素）不会抑制结合（未用）。这些数据表明，Jun和Fos蛋白，而不是ATF2，分别参与了与uPA 5′-TRE和3′-TRE结合的紫外线诱导型AP1复合物的形成。
JNK通路参与紫外线诱导uPA基因。
紫外线照射诱导合成（图。A） 以及转录因子如c-Jun和c-Fos的激活(25,68,81). 如上所示，紫外线诱导uPA启动子需要AP1增强子元件（图。和). 因此，我们假设导致uPA诱导的信号通路可能涉及三种类型的紫外线诱导MAPK（ERK、JNK和p38）中的任何一种的激活，其中两种可以激活AP1转录因子。因此，我们检测了这些途径的特定抑制剂阻止紫外线诱导uPA启动子活性的能力。MEKK1已被证明能特别激活JNK(61). MEKK1（K432M）(61)在NIH 3T3细胞中与p-6.6Luc的共转染实验中，无论有无紫外线照射，MEKK1的显性阴性形式均过度表达。如图所示。B、 紫外线诱导的uPA启动子活性被MEKK1的无催化活性突变体强烈抑制。此外，JIP-1（一种导致JNK在细胞质中滞留并随后抑制JNK通路的细胞质蛋白）的过度表达(28)，也下调这些细胞中紫外线诱导的uPA启动子活性（图。B） ●●●●。相反，PD98059是MAPK激酶-ERK激酶（MEK）途径的特异性抑制剂(29)，对紫外线诱导uPA启动子没有显著影响（图。B） ●●●●。此外，野生型JNK而非ERK-2的过度表达增强了NIH 3T3细胞中紫外线对uPA启动子的诱导，而组成活性形式的MEKK1的过度表达在没有紫外线处理的情况下强烈诱导了uPA启动程序的活性（图。C） 表明紫外线对uPA基因的诱导至少部分由MEKK1-JNK途径介导。因为p38 MAP激酶也被证明可以调节应激反应，包括紫外线(69)，我们评估了该途径在UV介导uPA基因启动子诱导中的潜在参与。SB203580，两种p38亚型（p38α和p38β）的特异性抑制剂(17,31)，无法阻止uPA启动子的紫外线诱导激活（图。A） 在NIH 3T3细胞中（有趣的是，SB203580进一步增强了紫外线对uPA启动子的诱导）。然而，由于两种新发现的p38亚型（p38γ和p38δ）(42,49,54,59,86)已被证明被紫外线激活，但对SB203580不敏感(16,31)，必须评估这些后一种激酶对紫外线诱导uPA的潜在参与。因此，MKK6b（A）是MKK6的一种主要的阴性形式，已被证明可以减少所有p38亚型的激活(36,70)与p-6.6Luc共同转染NIH 3T3细胞。如图所示。B、 紫外线诱导的uPA启动子活性未被MKK6b的催化失活突变形式所抑制。与此一致的是，只有JNK抑制剂MEKK1（K432M）和JIP-1，而不是MEK抑制剂PD98059，也不是p38抑制剂SB203580和MKK6b（A）下调了多聚PEA3/AP1的紫外线诱导性A类和AP1B类tk-Luc质粒中的元素（图。D） ●●●●。综上所述，这些结果表明，JNK通路通过其AP1增强子元件直接参与小鼠uPA基因在NIH 3T3细胞中的UV转录激活。与此一致的是，胶原酶TRE报告质粒p3xAP1（col）-tk-Luc在MEKK1（K432M）或JIP-1存在下不被UV诱导，而在不相关表达质粒存在下是高度诱导的（数据未显示）。根据标准测定证明了PD98059和SB203580在NIH 3T3细胞中分别下调ERK和p38激酶依赖性报告活性的有效性（数据未显示）。
紫外线诱导小鼠uPA对MEKK1-JNK途径的需求。（A） 紫外线诱导c-Fos和c-Jun表达。NIH 3T3细胞在0.5%FBS中培养16 h，然后用紫外线照射。在照射后45分钟提取总RNA，并使用c-Jun、c-Fos和GAPDH cDNA探针进行序列杂交。（B） JNK、ERK和p38 MAPK通路的特异性抑制剂对紫外线激活小鼠uPA启动子的影响。将p-6.6Luc报告质粒与显性阴性MEKK1[MEKK1（K432M）]、JIP-1、显性阴性MKK6b[MKK6（A）]表达载体或单独载体瞬时转染NIH 3T3细胞。或者，在紫外线照射前30分钟，将MEK和p38抑制剂PD98059（50μM）和SB203580（10μM）分别添加到培养基中。荧光素酶活性在未刺激NIH 3T3细胞中相对于p-6.6Luc活性表达；该活动的任意值为1。所得结果代表至少三个独立实验的平均值。（C） MAPK信号成分对紫外线诱导启动子活性的影响。将p-6.6Luc报告质粒与野生型JNK和ERK2表达载体、组成活性MEKK1或单独载体瞬时转染NIH 3T3细胞。在UVC照射后测定荧光素酶活性，如B组。（D）MEKK1（K432M）和JIP-1抑制uPA AP1位点的紫外线诱导转录活性。用多重聚体PEA3/AP1瞬时转染NIH 3T3细胞A类或AP1B类如材料和方法中所述，uPA增强子元件与tk-Luc报告子连接的位点，以及显性阴性MEKK1[MEKK1（K432M）]、JIP-1、显性阴性MKK6b[MKK6（A）]或单独载体的表达载体。分别在最终浓度为50μM和10μM的UVC照射前30 min，将PD98059和SB203580添加到培养基中。荧光素酶活性在未刺激NIH 3T3细胞中相对于ptk-Luc活性表达；该活动的任意值为1。所有归一化活动代表至少三个实验，并且显示不到25%的可变性。
采用不同的方法证实JNK是介导紫外线诱导uPA基因的MAP激酶。众所周知，JNK被包括紫外线在内的应激条件激活，但不被其他类型的刺激物激活，如TPA(62). 活化的JNK随后磷酸化c-Jun N-末端Ser-63和Ser-73，诱导c-Jun反式激活(23,38). 因此，如果JNK对c-Jun的磷酸化在紫外线诱导uPA基因中起任何作用，那么降低c-Jun磷酸化的突变应减弱uPA启动子的诱导。因此，在F9细胞中进行了与uPA全启动子质粒p-6.6Luc以及携带c-Jun激活域的质粒pRSV-cJun的共转染实验，已知F9细胞能转导JNK-而非ERK-依赖性诱导(三,84). 如图所示。紫外线处理诱导F9细胞中uPA转录活性。此外，c-Jun的过度表达进一步增加了uPA启动子的紫外线介导诱导。相反，c-Jun蛋白突变版本的过度表达，携带双重突变Ala-63和Ala-73，几乎消除了uPA启动子的诱导，强烈表明观察到的uPA基因的UV激活依赖于JNK的c-Jun N末端磷酸化。另一方面，TPA不能诱导F9细胞中的uPA启动子活性，这一发现与TPA不能在这些细胞中诱导uPA mRNA有关（图。B） 与佛波酯在F9细胞中不诱导AP1活性的事实相一致(三). 此外，TPA不能增强F9细胞中c-Jun过度表达诱导的uPA启动子活性（图。)，这与之前的报告一致，该报告表明TPA诱导不是由JNK途径介导，而是优先通过ERK途径(62). 当与胸苷激酶驱动的报告子连接的uPA增强子的多聚AP1位点用于与c-Jun表达质粒的共转染测定时，获得了类似的结果（数据未显示）。作为实验对照，在未照射和紫外线照射的F9细胞中检测了Gal4-c-Jun嵌合表达载体激活Gal4依赖性报告基因5xGal4-Luc的能力。尽管野生型c-Jun导致Gal4报告者的基础和紫外线反应性增加，但氨基酸63和73的突变导致这些效应消失（数据未显示）。
c-Jun反式激活域参与紫外线诱导uPA启动子。p-6.6Luc与野生型c-Jun或突变的c-Jun（Ala-63/73）表达质粒或F9小鼠畸胎瘤细胞中的空载体瞬时共转染。细胞未经处理或暴露于UVC或TPA，然后在刺激后16小时测量报告活性。荧光素酶活性的表达与未诱导的空载体共转染细胞中发现的活性相关，并标准化肾小球荧光素酶活性；结果代表了三个实验的平均值。
紫外线诱导JNK、AP1和uPA的动力学。
总之，我们的结果表明JNK通路的激活和AP1转录活性可能与外部紫外线照射和uPA表达有关。最初的Northern分析表明，紫外线照射后3小时，uPA RNA水平被诱导（见图。A） ●●●●。因此，在照射后的最初几个小时内对该诱导进行了更详细的时间过程分析。图A表明，紫外线照射NIH 3T3细胞后15至30分钟内，JNK活性强烈诱导，随后降低，如JNK活化和Western blot分析所示。该结果与uPA增强子的3′-TRE的AP1结合增加相关，在平行细胞培养物照射后1 h检测到（图。B） ●●●●。接下来，通过RT-PCR和Southern印迹分析紫外线照射后早期uPA mRNA表达的动力学，这是一种比图中使用的Northern印迹方法更敏感的转录检测技术。如图所示。C、 紫外线照射后1小时即检测到紫外线诱导的uPA表达，而作为RT-PCR对照的G3PDH RNA水平保持不变。总之，这三个事件（紫外线诱导的JNK激活、AP1结合和uPA表达）的时间安排强化了uPA基因是JNK途径介导紫外线诱导的直接靶点的观点。
紫外线照射后NIH 3T3细胞c-Jun磷酸化、AP1结合活性和uPA mRNA表达的诱导动力学。NIH 3T3细胞在0.5%FBS中培养16 h，然后用紫外线照射。在辐照后的指定时间点，从平行培养物中获得WCE、核提取物和总RNA。（A） 紫外线刺激NIH 3T3细胞JNK激活的时间进程。在紫外线刺激后的指定时间点，按照材料和方法中的详细说明制备WCE。（顶面板）JNK活性通过WCE中JNK的免疫沉淀和底物GST–c-Jun（1–223）的激酶分析测定。（底部面板）Western blot显示每个细胞提取物中存在的JNK总量（50μg/车道）。（B） 紫外线诱导AP1与uPA 3′-TRE结合的时间进程。在照射后的指定时间点，使用NIH 3T3细胞制备的核提取物（5μg/车道）进行EMSA。（C） uPA RNA水平对紫外线反应的时间进程。在NIH 3T3细胞照射后的指定时间点纯化总RNA，并通过RT-PCR和Southern blotting结合特异性uPA和G3PDH小鼠引物进行分析。
讨论
短波紫外线照射细胞可诱导许多基因的转录。在本研究中，我们证明了紫外线可以通过MAP激酶的JNK途径在基因转录水平诱导小鼠内源性uPA基因产物。特别是，我们发现，小鼠、猪和人类uPA启动子中保守的AP1增强子元件是紫外线诱导所必需的，因为该元件的缺失会使诱导失效。
我们已经证明，在紫外线照射F9和NIH 3T3细胞后的第一个小时内，可以诱导内源性小鼠uPA基因产物，尽管在后者的细胞类型中诱导持续的时间更长。此外，紫外线诱导的uPA启动子可以被细胞质信号级联的抑制剂完全阻断，细胞质信号级联是在质膜或质膜附近启动的(26)（图。和)表明uPA基因可以被细胞质转导信号激活，至少部分激活。这些结果必须与研究结果相一致，研究表明，紫外线在诱导来自DNA损伤的信号后，导致人类uPA在正常和着色性干皮病细胞中的表达延迟（发生在照射后几天）诱导(64,74). 目前，我们只能推测这些明显不同的紫外线诱导起源。uPA基因被紫外线激活可能受质膜和细胞核的途径控制。
一个特征良好的小鼠uPA启动子质粒和三种MAPK通路抑制剂的可用性将细胞外刺激（如紫外线）转化为细胞内反应，这有助于分析紫外线诱导uPA基因的机制。启动子缺失分析表明，紫外线诱导uPA启动子需要位于−2.4 kb的小鼠AP1增强子元件，因为其缺失会取消诱导。uPA增强子包含两个TRE：合并的PEA3/AP1A类现场（5′-TRE）和下游AP1B类位点（3′-TRE），这两个位点都能赋予异源启动子紫外线诱导能力，这一发现与它们在NIH 3T3细胞紫外线照射后诱导的AP1结合活性相关。此外，由两个uPA TRE形成的紫外线诱导复合物由c-Jun和c-Fos形成，而不是由ATF2形成。
与不同MAPK信号通路相关蛋白的特异性抑制剂共表达的瞬时转染试验表明，JNK而非ERK或p38参与紫外线依赖性uPA基因诱导。MEKK1的表达导致JNK的有效激活，而ERK1/2或p38活性没有显著增加(55,61). 我们目前的工作表明，MEKK1（K432M）的过度表达（一种催化性不活跃的MEKK1的形式）能够消除紫外线诱导的小鼠uPA启动子在NIH 3T3细胞中的上调。JNK在紫外线诱导的uPA转录中的作用进一步被JNK的细胞质抑制剂JIP-1的过度表达所引起的抑制作用所证实，JIP-1被证明可以抑制JNK调节的基因表达(28). 此外，组成活性MEKK1能够在没有紫外线刺激的情况下激活uPA基因转录，这表明uPA基因是MAPK通路的靶点。然而，我们不知道在uPA基因诱导中，MEKK1是否同时激活与MEKK1-JNK通路合作的其他信号通路。这种可能性值得考虑，因为MEKK1最近被证明通过在体内和体外激活IκBα激酶复合物来激活NFκB(50,60). 有趣的是，在人类uPA启动子中发现了NFκB样元件，该启动子通过TPA介导HepG2和HT1080细胞中的诱导(37)，尽管该位点在小鼠uPA启动子中不保守。
我们接下来证明c-Jun是JNK途径介导uPA紫外线诱导的后续底物。c-Jun的JNK磷酸化发生在N末端Ser-63和Ser-73位点(23,38). 虽然完整c-Jun的联合转染增强了F9细胞中紫外线诱导的uPA启动子，但携带双Ala-63–Ala-73突变的c-Jun蛋白突变版本不能介导这种效应。相反，TPA不能上调F9细胞中基础或c-Jun激活的uPA启动子，这一发现与之前的结果一致，表明TPA介导的uPA基因的诱导是通过ERK途径实现的(6)TPA不能在该细胞系中诱导uPA mRNA（图。B） ●●●●。总之，这些结果表明，紫外线诱导uPA转录依赖于JNK的c-Jun磷酸化。此外，JNK对紫外线的激活动力学与AP1与uPA 3′-TRE结合的早期诱导以及uPA转录水平的早期上调有关，这强化了uPA基因是介导紫外线刺激的JNK途径的直接靶点的观点。因此，提出的一条UV-dependent uPA激活途径可能如下：MEKK1→JNKK1→JNK→c-Jun→AP1→uPA（TREs）。有趣的是，研究表明，除了c-Jun外，JNK还磷酸化并激活ATF2和TCF/Elk-1，后者是调节c-Fos启动子活性的转录因子之一(11). 虽然在与uPA AP1增强子结合的紫外线诱导复合物中未发现ATF2，但c-fos和c-Jun是参与该复合物的蛋白质之一（图。). 因此，可以推测，通过Elk-1激活c-Fos的潜在紫外线诱导JNK途径可能间接促进紫外线刺激后诱导的c-Fos与uPA增强子结合，尽管这一问题在本研究中尚未解决。最近的证据也表明，紫外线诱导的DNA损伤可以导致JNK激活(1)与之前公认的细胞膜通过紫外线激活JNK的想法相反，在去核细胞中已经证明了这一点(27). 这种DNA诱导JNK活化的新机制是否可能参与紫外线诱导人类DNA修复缺陷细胞中的uPA，有待于进一步研究确定。
无论DNA损伤是否为哺乳动物的紫外线反应提供了主要信号，这种反应似乎可能以与细菌SOS反应相似的方式增强受照射细胞的DNA修复能力(85). 然而，在哺乳动物细胞中发现的紫外线诱导基因似乎都不参与DNA修复(39,43). 最近，一些报道表明哺乳动物的紫外线反应与DNA修复以外的保护功能有关(26,30). 事实上，酪氨酸激酶抑制剂对紫外线反应的抑制已经证实了其保护作用(26). 此外，c-fos−/−细胞与c-jun−/−细胞对紫外线照射过敏(81)表明紫外线诱导的c-Jun和c-Fos是细胞防御机制对抗紫外线辐射细胞毒性作用的重要组成部分。紫外线诱导uPA的生理意义是什么？紫外线会造成严重损害，例如诱发和促进癌症、皮肤炎症和免疫抑制(46). 细胞暴露于紫外线和大多数其他DNA损伤剂会直接或通过产生氧化应激导致生物膜、蛋白质和核酸的损伤(2). 一种简单的防止此类组件损坏的保护机制包括用新合成的组件替换它们。因此，uPA基因和其他AP1调节基因，如胶原酶I和基质溶素I和II，编码紫外线照射诱导的蛋白水解酶(81). 这些蛋白酶在细胞外基质的降解中具有互补功能，细胞外基质在诸如伤口愈合、癌症和炎症等需要细胞迁移的情况下发挥作用（参考文献综述7和18). 特别是，假设uPA提供蛋白水解酶活性，使炎症细胞在招募过程中穿越组织，并被认为是细胞因子调节剂。uPA最近的工作−/−事实上，小鼠已经证明uPA是肺炎症反应所必需的新生隐球菌由于缺乏uPA导致细胞招募不足、感染失控和死亡(34). 此外，内源性产生的uPA可以通过单核吞噬细胞放大肿瘤坏死因子α的新合成，这代表了吞噬细胞衍生蛋白酶有助于产生促炎信号的新机制(82). 因此，很容易推测uPA可能在紫外线引起的炎症中发挥类似的作用。目前，可以获得uPA缺乏小鼠。uPA的灵敏度−/−细胞对紫外线照射将大大阐明这种蛋白酶在哺乳动物紫外线反应中的作用。
