芽殖酵母的细胞壁酿酒酵母需要保持电池形状和完整性(4,20). 营养增殖需要细胞重塑细胞壁以适应生长。负责酵母细胞壁刚性的主要结构成分是1,3-β-连接的葡聚糖聚合物，其中一些支链通过1,6-β连接。催化1,3-β-葡聚糖链合成的酵母-酶复合物的生物化学已被广泛研究(15,29)以及编码该复合物成分的三个基因已被鉴定。一对密切相关的基因，FKS1型和FKS2型，编码1,3-β-葡聚糖合成酶（GS）的替代亚单位(8,15,28,36). 要么FKS1型或FKS2型该功能足以维持GS活性和细胞活力。此外，Rho1 GTPase是GS复合体的一个重要调节亚单位，以GTP依赖的方式刺激GS活性(9,35).
RHO1的第二个基本功能是通过结合和激活蛋白激酶C来调节细胞完整性信号通路(19,33)，由编码PKC1(25). 损失PKC1细胞壁结构缺陷导致细胞溶解缺陷(23,24,34). 的一个分支上的组件RHO1-PKC1-受调控的信号通路包括线性丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）激活级联。其中包括MEK激酶（MEKK）同源物(BCK1型[5,22])，一对多余的MEK同源物（MKK1和MKK2[16])，和MAPK同源物(MPK1型[21]，最初指定SLT2型[40]). 当细胞在温和的热应激条件下（即37至39°C）培养时，这些成分中的任何一种的缺失都会导致细胞裂解。生长温度升高被认为对细胞构建足够细胞壁的能力构成挑战，也会诱导MPK1持续激活(18). 细胞完整性信号通路的调控输出现在才刚刚开始探索。
这个FKS1（FKS1）和FKS2型基因的差异主要在于其表达的控制方式。在最佳生长条件下，FKS1（FKS1）是主要表达的基因，其mRNA水平在细胞周期中周期性波动(28,36). 的表达式FKS2型在最佳生长条件下表达量较低，但在交配信息素CaCl的作用下诱导表达2或在缺乏碳源或FKS1（FKS1）功能(28). 诱导FKS2型信息素或CaCl表达2或在中fks1型突变体需要钙2+/钙调素依赖性蛋白磷酸酶钙调神经磷酸酶（PP2B[6,39]). 然而，FKS2型不良碳源诱导是钙调神经磷酸酶独立的。
钙调神经磷酸酶的双突变体(CNB1公司)以及FKS1（FKS1）由于缺乏FKS2型表达式(11). 确定新的调节器FKS2型基因表达，我们分离了一些基因，这些基因的过度表达消除了钙调神经磷酸酶对细胞生存能力的需求福克斯1突变体。在本研究中，我们描述了MKK1型，细胞完整性信号通路的一个组成部分(16)，以及RLM1型，一种推测的转录因子，也与细胞完整性信号传导有关(7,42,43)，作为积极的监管机构FKS2型表达式。我们证明钙调神经磷酸酶和细胞完整性途径通过可分离的启动子元件平行发挥作用，诱导FKS2型在热应激条件下表达，从而为细胞完整性信号的直接靶点提供了第一个明确的证据。我们还证明了这一点FKS2型对葡萄糖消耗的诱导受SNF1调节的MIG1转录阻遏物的控制(31,32). 最后，我们证明FKS2型当细胞进入稳定期时，表达被强烈诱导，并且这种诱导不受任何已知的调节输入的介导FKS2型表达式。
材料和方法
应变、生长条件和转变。
这个酿酒酵母表中列出了本研究中使用的菌株酵母培养物在补充有2%葡萄糖的YEP（1%细菌酵母提取物，2%细菌蛋白胨）中生长。合成最小培养基（SD[37])选择合适的营养素进行质粒维持。酵母转化通过乙酸锂法进行(17).大肠杆菌DH5α用于所有质粒的增殖。大肠杆菌细胞在Luria肉汤培养基（1%细菌-色氨酸、0.5%细菌-酵母提取物、1%氯化钠）中培养并通过标准方法转化(26).
表1
| 应变 | 基因型 | 来源或参考 |
|---|
| 1783 | 材料一一 | I.赫斯科维茨 |
| 1788 | 材料一/材料α一 | I.赫斯科维茨 |
| DL1009型 | 材料一/材料αmpk1Δ::TRP1/mpk1Δ::TRP1号机组（是351[英里/千卡1T190A，Y192F:：HA]）一 | 本研究 |
| DL251型 | 材料一/材料αbck1Δ::URA3/bck1Δ：URA3公司一 | 22 |
| GMY63-5D型 | 材料一rlm1型Δ::LEU2级一 | K.艾琳 |
| PGY440型 | 材料αmpk1Δ::TRP1 fks1Δ::嘶嘶声一 | 本研究 |
| PGY482型 | 材料一rlm1型Δ::LEU2功能1Δ：嘶嘶声一 | 本研究 |
| YPH499型 | 材料一b条 | P.Hieter公司 |
| MCY3-1D公司 | 材料一中国广播公司1Δ::LEU2级b条 | 11 |
| PGY5系列 | 材料一福克斯1Δ::URA3公司b条 | 11 |
| PGY220型 | 材料一福克斯1Δ::TRP1号机组b条 | 本研究 |
| PGY318型 | 材料一福克斯1Δ::HIS3 cnb1型Δ::ADE2型（pGAL[CNB1公司])b条 | 本研究 |
| 1093万立方厘米 | 材料一c（c） | 卡尔森先生 |
| 1846万加元 | 材料一snf1Δ10c（c） | 卡尔森先生 |
| YM4797型 | 材料一trp1-901 tyr1-501符合要求？可以吗？d日 | M.约翰斯顿 |
| YM4807型 | 材料一mig1Δ：：ura3:：LYS2满足−可以1第页d日 | M.约翰斯顿 |
高拷贝数抑制剂的分离cnb1Δfks1Δ突变。
用高拷贝数构建的两个酵母基因组文库之一转化PGY318LEU2级-携带质粒，YEp351(13)或YEp13（ATCC），并在25°C下在缺乏亮氨酸和含有葡萄糖的固体合成培养基上生长。每个转化的一部分生长在缺乏亮氨酸和含有半乳糖的固体合成培养基上，以评估转化效率。使用尿嘧啶生物合成拮抗剂5-氟有机酸（5-FOA）进行质粒丢失的选择(1). 通过将细胞点在含有2 mg FK506/ml的培养基上进行FK506敏感性试验。
质粒构建。
质粒pLGΔ-178和pLG△-312，包含CYC1-lacZ公司融合基因如前所述(12). 质粒FKS2型（−928到−1）-lacZ公司由两个步骤构成。首先，pCZ-FKS2型通过插入一个955 bp的PCR扩增FKS2型碎片进入Xba公司我/巴姆pCZ4的HI位点(2). 用引物对5′-GGCCCGC进行PCRTCTAGA公司ATCTTCCGATCATCATCGGCGTTC-3′（意义）和5′-TCGGATCC公司GGTCATAACTATGACAGTTAAAT-3′（反义）。（Xba公司我和巴姆用于克隆的HI站点带有下划线。）第二，a萨尔我/巴姆pCZ的HI片段-FKS2型被删除并克隆到Xho公司我/巴姆pLGΔ-178的HI位点。生成质粒FKS2型（−706到−1）-lacZ公司，713 bp PCR扩增FKS2型碎片被放置在框架中Xho公司我/巴姆pLGΔ-178的HI位点，用Klenow片段使其变钝。用引物对5′-TGTGATGGTGTAGG-3′（有义）和5′-CGACATACTATGACAG-3′（反义）进行PCR。质粒FKS2型（−706至−361）-CYC1-lacZ公司通过更换134-bpSma公司我/Xho公司I片段CYC1（日历年1）pLGΔ-312启动子345-bpPCR扩增FKS2型碎片，导致CYC1（日历年1）启动子区上游激活序列位点与融合FKS2型上游序列从−706到−361到CYC1（日历年1）最小启动子。用引物对5′-TGGTGATGGGTGAGG-3′（sense）和5′-AATA进行PCRCTCGAG公司AAGCTTTTATTTTA-3′（反义）。（Xho公司用于克隆的I站点带有下划线。）所有数字都是关于翻译起始密码子的。
RNA分析。
菌株的生长密度为1.5×107至3×107细胞/ml（4.5×108至6×108细胞/ml（对于稳定期细胞），通过1500×离心收集克在4°C下保持5分钟，用1ml冰镇二乙基焦碳酸酯-H清洗一次2O、 在干冰上冷冻，并在−70°C下储存。将细胞颗粒重新悬浮在400μl TES溶液（10 mM Tris-HCl[pH7.5]，10 mM EDTA，0.5%十二烷基硫酸钠）中，添加400μl酸性苯酚，剧烈旋涡10 s，并在65°C下孵育1 h，偶尔短暂旋涡，从而制备总RNA。将混合物置于冰上5分钟，然后在13000×克在微型离心机中放置5min，去除水相。通过苯酚和氯仿萃取纯化RNA，并在−20°C下，在0.3 M醋酸钠（pH 5.3）存在下用100%乙醇沉淀。在1%甲醛-海藻糖凝胶（1%琼脂糖，20 mM MOPS[吗啉丙基磺酸]，1 mM EDTA，5 mM醋酸钠，2.2 M甲醛）上分离RNA，转移到Hybond-N膜（Amersham），如Maniatis等人(26)，并通过在80°C的真空培养箱中培养2.5 h交联。用放射性标记的限制性片段探测斑点(行动1和RHO1型)或PCR扩增片段(FKS1（FKS1）和FKS2型). 使用以下引物对进行合成FKS1（FKS1）和FKS2型片段，分别为：5′-ATGAACCTGACAC-3′（正义）和5′-AATTACCGTAAATTGG-3′（反义）以及5′-AGTCCTACAACGATCC-3′（正态）和5’-GAACCTTGAGCAG-3′（反意义）。的探针FKS1（FKS1）和FKS2型杂交到编码每个蛋白质产物不同N末端的区域。通过将膜暴露于富士磷光成像板，定量RNA水平，并使用MacBAS 2.0软件分析磷光成像数据。使用细胞膜的自显影作为图形。
β-半乳糖苷酶分析。
在3000×克持续5分钟，并再次悬浮在300μl破胶缓冲液（100 mM Tris-HCl[pH8.0]、1 mM二硫苏糖醇和20%甘油）中。这些细胞没有立即使用，而是在−70°C下快速冷冻并在−20°C下储存。将等体积的玻璃珠、2μl苯甲基磺酰氟（10 mg/ml）和1μl亮氨酸蛋白酶抑制剂（10 mg/ml）添加到该悬浮液中，并通过剧烈旋涡破碎细胞4分钟。通过13000×克在1分钟内，通过额外离心10分钟进一步澄清上清液。所有步骤均在4°C下进行。用Bradford方法（Bio-Rad）测量细胞提取物的蛋白质浓度。如前所述进行β-半乳糖苷酶分析(37). ONPG的特定活性以纳米为单位(o个-硝基苯基-β-d日-吡喃半乳糖苷）转化为每分钟每毫克蛋白质。给出的数据是两个或三个实验的平均值。
GS分析。
粗提取物的制备如前所述(18)并在−80°C下储存在添加33%甘油的裂解缓冲液中。如前所述测量GS活性(29)经以下修饰：二磷酸尿苷-[三H] 以葡萄糖为底物，向反应混合物中添加α-淀粉酶（1 U/40μl）以消除[三H] 葡萄糖并入糖原。
结果
隔离MKK1型和RLM1型作为的高拷贝数抑制器cnb1Δfks1Δ突变体。
确定新的调节器FKS2型表达，我们筛选了一个高拷贝数的基因组酵母文库，寻找可以抑制cnb1Δfks1Δ突变，可能通过恢复FKS2型表达式。我们使用了cnb1Δfks1携带质粒的Δ突变体CNB1公司在可诱导的控制下镀锌1-10启动子（PGY318）。该菌株在含半乳糖培养基上正常生长，但在含葡萄糖培养基上不可见。PGY318被转化为两个高拷贝数中的任何一个酿酒酵母对基因组文库和转化子进行筛选，以确定其在含葡萄糖培养基上生长的能力。为了消除半乳糖调节突变体CNB1公司-用5-FOA清除含有质粒(1). 共分离出32个5-FOA抗性转化子，并测试其对钙调神经磷酸酶抑制剂FK506的敏感性。假定FK506敏感菌株携带CNB1公司基因和没有进一步的特征。从12个转化子中提取质粒，并将其反向转化为PGY318，以确认质粒允许该菌株在含葡萄糖的培养基上生长。在分离出的10个质粒中，有3个质粒进行了DNA序列分析。其中一个包含具有两个完整开放阅读框的第十五号染色体区域，MKK1型和管理层1。仅包含MKK1型，细胞完整性信号通路的MEK同源物(16)，有效地抑制了PGY318的生长缺陷（图。). 另外两个质粒包含一个重叠的第十六染色体区域，包括RLM1型，编码转录因子的血清反应因子家族成员(38)这也与细胞完整性信号有关(7,42,43). 仅包含RLM1型能够进行抑制活动（图。). 研究发现MKK1型或RLM1型抑制fks1Δcnb1Δ突变体表明，细胞完整性途径有助于FKS2。
抑制cnb1Δfks1Δ高拷贝数突变MKK1型或RLM1型.酵母菌株PGY318，用YEp351转化(MKK1型)，是351(RLM1型)或YEp351，划线到补充有2%葡萄糖或2%半乳糖的SD-Leu培养基上，并在30°C下培养。
其他遗传证据支持细胞完整性途径正向调节的观点FKS2型表达式。首先，如前所述fks1Δmpk1Δ双突变体在含糖培养基上不可见(11). 这一结果现在可以用以下方面的缺陷来解释FKS2型表达，类似于fks1Δcnb1Δ双突变体。与此解释一致，我们发现FKS2型从一个高拷贝数的质粒抑制an的生长缺陷fks1Δmpk1Δ双突变体（图。). 其次，我们发现fks1Δrlm1Δ双突变体在含有葡萄糖的培养基上是不可见的，这种缺陷通过过表达FKS2型（图。). 有趣的是，这两个双突变体在含有半乳糖的培养基上都是可行的（见下文关于葡萄糖饥饿的部分）。
抑制mpk1Δfks1Δ突变体和rlm1Δfks1Δ高拷贝数突变FKS2型.酵母菌株PGY440和PGY48，用YEp352转化(FKS2型)或YEp352，划线到补充2%葡萄糖或2%半乳糖的SD-Ura培养基上，并在30°C下培养。
钙2+诱导FKS2型不依赖于细胞完整性途径。
外源钙2+刺激FKS2型钙调神经磷酸酶依赖途径的表达(28). 我们测试了钙也需要细胞完整性信号通路的可能性2+-从属的FKS2型表达式。A类bck1号机组Δ突变体用于本实验，该突变体在细胞完整性途径的MEKK中存在缺陷，并在室温下正常生长。图说明了这一点FKS2型野生型和bck1号机组添加CaCl后在23°C下生长的Δ细胞2（30 mM），表明这种钙调神经磷酸酶依赖性反应不需要细胞完整性途径的MAPK分支。
钙诱导FKS2型该基因独立于细胞完整性途径的信号传导。野生型对数期培养物（1788年）和bck1号机组Δ（DL251）细胞在有或无30mM CaCl的情况下在23°C下生长2在指定的时间内。在指定时间后分离的总RNA被探测FKS2型和行动1mRNA。FKS2型mRNA被标准化为行动1mRNA。这个行动1-归一化的FKS2型在没有CaCl的情况下生长的野生型细胞的mRNA水平2被任意指定为值1。野生型；肌动蛋白，行为1
FKS2型mRNA随着高温生长而积累。
我们之前表明，细胞完整性信号通路在中等高温（即37至39°C）下生长时被强烈激活[18]). 细胞壁结构缺陷导致高温培养时细胞完整性信号裂解的突变(18). 我们已经解释了这些发现，表明热应激下的生长对细胞构建足够细胞壁的能力构成了挑战，细胞对这种能力的反应是激活细胞完整性信号(18). 然而，这种信号传导所诱导的细胞靶点尚未确定。上述观察结果表明FKS2型可能就是这样一个目标。
作为第一步，确定FKS2型是根据细胞完整性信号调节的，我们检测了生长温度对mRNA稳态水平的影响FKS2型.图显示了FKS2型在23°C下生长的细胞中几乎检测不到信使核糖核酸，它被39°C下的生长转变强烈诱导，在转变后2至4小时达到峰值，并且只要细胞在高温下继续生长，信使核糖核酸就会以升高的水平持续存在（未显示）。相反，两者的累积FKS1（FKS1）也不是RHO1型编码GS复合物其他已知成分的mRNA是由高温生长诱导的（图。).
温度引起的FKS2型mRNA。累计FKS1（FKS1）,FKS2型、和RHO1型在野生型（YPH499）和中国广播公司1Δ（MCY3-1D）细胞。细胞生长为A类600在23°C下，含2%葡萄糖的YEP中0.5至1。通过添加等体积的预热至55°C的新鲜培养基，然后在39°C下搅拌培养指定的时间，立即将温度转变至39°C。检测总RNAFKS2型,FKS1（FKS1）,RHO1型、和行动1mRNA。野生型；肌动蛋白，行为1。
由于FKS1和FKS2是GS复合物的催化亚单位，我们研究了生长温度对GS活性的影响。野生型细胞在强烈诱导下从23°C生长转变为39°C生长6小时FKS2型表达式（图。A） 但这种诱导伴随着GS活性的增加，增加了不到两倍（图。B） ●●●●。这可以解释为FKS1（FKS1）GS活动(28). 在一个福克斯1Δ突变，FKS2型在低温下生长期间，表达量升高（相对于野生型），但随着温度升高，表达量进一步诱导（大约是野生型的三倍）（图。A） ●●●●。这种诱导伴随着GS活性的五倍增加（图。B） 可能是因为这个突变株中的所有GS活性都来源于FKS2型.GS活动FKS2型突变体不受生长温度的影响，这与观察结果一致FKS1（FKS1）mRNA水平不受热应激的影响（图。).
生长温度对谷胱甘肽酶活性的影响福克斯1Δ和平方英尺Δ突变体。（A） 野生型（YPH499）和福克斯1Δ（PGY5）细胞从23℃的对数生长转变为39℃的生长。转移后0和6小时分离的总RNA被探测FKS2型和行动1mRNA。（B） 野生型对数期培养物（YPH499），福克斯1Δ（PGY5），以及平方英尺分离Δ（PGY220）细胞，并在23或39°C下培养6 h。制备粗提取物，并按照材料和方法中的描述测定GS活性。蛋白质；野生型；肌动蛋白，行为1。
接下来，我们检查了其机制FKS2型表达是响应温度升高而诱导的。累计FKS2型mRNA对细胞外钙的反应2+或交配信息素治疗严格依赖钙调神经磷酸酶介导的途径(28). 因此，我们研究了生长温度升高对FKS2型钙调神经磷酸酶突变体的表达(cnb1型Δ [6]). 热感应FKS2型该突变体的mRNA积累几乎与野生型一样强烈（图。)但动力学有些滞后。最值得注意的是，在换班后20分钟在野生型菌株中观察到的反应在中国广播公司1Δ突变体，表明钙调神经磷酸酶可能在热应激反应的早期阶段发挥作用。
细胞完整性途径和钙调神经磷酸酶协同诱导FKS2型高温下表达。
确定热诱导是否需要细胞完整性信号通路FKS2型mRNA积累，我们检测了MPK1型，编码该途径的MAPK的基因。因为英里/千卡1突变体在高温培养时溶解，我们抑制了an的生长缺陷英里/千卡1Δ通过过度表达非活性等位基因突变MPK1型(mpk1-TAYF（英里/小时）[18]). 该等位基因提供的基础激酶活性允许在其他致命温度下存活，但由于突变激酶不能被其活化激酶磷酸化，因此不受调控(18). 图说明了这一点FKS2型mRNA的积累在英里/千卡1通过从23°C生长到39°C生长的转变实现突变，但这种诱导是暂时的FKS2型mRNA水平在换班后2h降至接近诱导前水平。因此FKS2型高温下需要细胞完整性信号通路的MAPK分支。
影响英里/千卡1上的突变FKS2型mRNA积累对生长温度升高的响应。细胞生长和温度变化如图图例所示。总RNA，在指定时间从野生型（1788）或英里/千卡1突变体（DL1009）FKS2型和行动1mRNA。在温度变化前30分钟，通过向培养物中添加药物，使最终浓度达到0.2 mg/ml，用FK506对细胞进行预处理。野生型；肌动蛋白，行为1。
为了确定FKS2型mRNA在mpk1型突变体是钙调神经磷酸酶依赖性的，我们用钙调神经蛋白抑制剂FK506预处理培养物。野生型和mpk1型在23℃下生长的突变菌株在将温度升高至39℃之前用FK506（200 ng/ml）处理30 min。正如预期的那样FKS2型用FK506处理的野生型菌株中的mRNA积累（图。)与在中国广播公司1Δ突变体（图。). 预处理英里/千卡1FK506完全阻断的突变体FKS2型mRNA积累，表明在该突变体中观察到的瞬时诱导是钙调神经磷酸酶依赖性的。因此，钙调神经磷酸酶与细胞完整性信号通路并行协作，诱导FKS2型mRNA对生长温度升高的反应。钙调神经磷酸酶依赖性途径诱导FKS2型mRNA，而细胞完整性途径（通过MPK1作用）诱导延迟但持续的增加。这些途径似乎相互独立地发挥作用，因为它们对FKS2型表达大致是相加的，因为必须阻断这两条通路才能防止FKS2型mRNA的积累完全是对温度升高的反应。钙调神经磷酸酶介导的FKS2型通过外源钙2+此外，钙调神经磷酸酶和PKC1反应序列FKS2型启动子是可分离的（见下文）。
剖析FKS2型发起人。
为了进一步明确钙调神经磷酸酶和细胞完整性依赖性调控的分子机制FKS2型表达式，我们创建了几个FKS2型报告质粒。序列5′到FKS2型翻译起始位点从核苷酸−706到−1或从−928到−2融合到大肠杆菌lacZ基因（编码β-半乳糖苷酶）。表结果表明，携带这两种质粒之一的野生型菌株分别诱导了10倍或20倍的β-半乳糖苷酶活性，以响应从23°C生长到39°C生长的24小时转变。第三个报告质粒，包含FKS2型核苷酸−706到−360的序列与基底融合CYC1（日历年1）该启动子也被高温生长强烈激活（表)，表明从−359到−1的区域对于FKS2型转录。一株携带无控制质粒的菌株FKS2型序列和仅基础CYC1（日历年1）该启动子在两种温度下表达了相似水平的β-半乳糖苷酶活性。我们得出结论FKS2型由核苷酸−928和−360之间的启动子序列介导的信使核糖核酸，解释了观察到的信使核糖核酸积累因温度升高而增加的部分或全部原因。
表2
温度诱导β-半乳糖苷酶的表达FKS2-lacZ公司报告质粒一
| FKS2-lacZ公司报告质粒 | β-半乳糖苷酶sp活性（nmol/min/mg蛋白质）
|
|---|
| 23°C | 39摄氏度 | 23°C+钙2+ |
|---|
| 3.3 | 67.2 | 51.8 |
| 1.8 | 17.7 | 1.9 |
| 1.8 | 17.1 | 2 |
| 1.5 | 2.1 | 1.9 |
| |
我们还研究了各种FKS2-lacZ公司外源CaCl报告质粒2虽然FKS2型含有928bp 5′序列的报告质粒对外源钙的反应强烈2+，这会刺激FKS2型钙调神经磷酸酶依赖途径的表达(28)，报告质粒仅含有706bp的FKS2型对这种刺激没有反应（表). 这表明钙调神经磷酸酶应答序列位于核苷酸−928和−706之间的222 bp内。因为携带FKS2型从−706到−360的序列受到高温生长的刺激，PKC1响应序列必须位于−360到−707之间，因此，可以与钙调神经磷酸酶响应序列分离。这些结果进一步支持了以下结论：钙调神经磷酸酶和细胞完整性信号调节的机制FKS2型表达是完全独立的。
接下来我们研究了生产过剩的影响MKK1型或RLM1型从高拷贝数质粒FKS2型使用上述报告质粒表达。的过度表达MKK1型或RLM1型增加了报告者的β-半乳糖苷酶表达的基础水平（在25°C时）FKS2型从−706到−1的序列分别约为三倍或八倍（未显示数据）。如预期的那样，用于控制FKS2型通过细胞完整性途径表达，核苷酸−359到−1的区域对于MKK1型β-半乳糖苷酶表达过度。令人惊讶的是RLM1型缺少该区域（未显示）的记者消除了生产过剩，这表明RLM1型影响FKS2型通过细胞完整性信号以外的机制表达。RLM1（CTA[T/A]）的共识DNA结合位点没有完美匹配4标签[7])存在于序列5′至FKS2型翻译起始位点，但在−336位（CTAAAGATAG）存在一个与该一致性存在单一错配的孤立序列。
RLM1转录因子不参与FKS2型表达式。
RLM1型已建议调节MPK1的一些功能(7,42,43). 因此，即使在FKS2型启动子与RLM1型-响应序列，我们检查了rlm1型累积能力Δ突变FKS2型mRNA对生长温度升高的反应。为了消除钙调神经磷酸酶依赖途径的作用rlm1型Δ菌株用FK506预处理。图表明该突变体在热诱导FKS2型这表明推测的转录因子并不介导MPK1依赖性功能。此外fks1Δrlm1Δ双突变体在25至30°C下无法生长，但在38°C下生长可以挽救它（数据未显示），这与热诱导FKS2型独立于RLM1。
转录因子RLM1对温度诱导的FKS2型野生型对数期培养物（1783年）和rlm1型在23°C下生长的Δ（GMY63-5D）细胞受到温度变化和FK506处理，如图图例所示。和.在温度变化后的指定时间分离的总RNA进行探测FKS2型和行动1mRNA。野生型；肌动蛋白，行为1。
诱导FKS2型通过葡萄糖饥饿和进入固定相表达。
累计FKS2型据报道，在非葡萄糖碳源上生长期间，mRNA以钙调神经磷酸酶非依赖性的方式增加(28). 图A表示bck1号机组Δ突变体在积累FKS2型以半乳糖、醋酸盐或甘油为碳源生长的细胞中的mRNA，表明这种反应并不依赖于细胞完整性途径的MAPK分支。类似地rlm1型Δ突变诱导FKS2型在含有半乳糖的培养基上正常表达（未显示）。这些结果与以下观察结果一致：fks1Δmpk1Δ和fks1Δrlm1Δ双突变体可以在半乳糖上生长，但不能以葡萄糖作为碳源（图。). 为了确定FKS2型我们检测到，mRNA对非葡萄糖碳源生长的反应可能反映了对葡萄糖饥饿的一般反应FKS2型mRNA水平对从高糖（2%）到低糖（0.05%）生长条件的变化作出反应。换低血糖后2小时内，FKS2型mRNA水平被诱导了七倍（数据未显示），这表明葡萄糖的缺乏而不是替代碳源的存在是导致FKS2型归纳。
诱导FKS2型低碳源的表达和进入固定相与细胞完整性途径和钙调神经磷酸酶无关。（A）野生型（1788）和bck1号机组Δ（DL251）细胞在添加2%葡萄糖、2%半乳糖、2%甘油或2%醋酸钠的YEP中于23°C下生长至中对数期。检测总RNAFKS2型和行动1mRNA。的级别FKS2型mRNA的表达与在添加2%葡萄糖的YEP中生长的野生型相对。（B） 文化bck1号机组Δ（DL251）和中国广播公司1Δ（MCY3-1D）及其等基因野生型菌株（分别为1788和YPH499）在含有2%葡萄糖的YEP中生长。总RNA，从对数期培养物中提取（log）（1.5×107至3×107细胞/ml）或固定相（STAT）（4.5×108至6×108细胞/ml），检测FKS1（FKS1）,FKS2型、和行动1mRNA。野生型；肌动蛋白，行为1。
接下来，我们研究了营养素消耗对FKS2型当细胞进入稳定期时表达。图B表明尽管FKS2型在23°C对数生长期的细胞中表达较低，其mRNA在葡萄糖供应耗尽并在此温度下进入稳定期的细胞内积累。伴随而来的FKS1（FKS1）在稳定期细胞中观察到mRNA表达。两者都是钙调神经磷酸酶突变体(中国广播公司1Δ）和细胞完整性途径突变体(bck1号机组Δ）在该反应中表现出类似于野生型细胞的行为（图。B） 表明，与葡萄糖饥饿反应一样，固定相诱导表达FKS2型不依赖于这两种信号通路。
因为钙调神经磷酸酶和细胞完整性信号通路都不负责饥饿诱导的FKS2型，我们假设葡萄糖降压途径由SNF1系列可能会调节FKS2型在这些条件下。蛋白激酶由SNF1系列许多葡萄糖抑制基因的去表达都需要基因(三). 确定是否诱导FKS2型葡萄糖饥饿和进入稳定期时mRNA的积累取决于SNF1系列基因，我们测试了一个snf1Δ10转录激活突变体FKS2型上述报告质粒。表表明FKS2型5′序列928bp的报告质粒对葡萄糖饥饿反应SNF1系列细胞，但不是在其他等基因中snf1Δ10突变体，表明SNF1系列-依赖性降压负责FKS1（FKS1）葡萄糖饥饿反应的转录诱导。相比之下，记者只有706个基点FKS2型即使在SNF1系列单元格，表示SNF1系列-依赖序列位于这些报告子的端点之间的222bp区域内。
表3
的角色SNF1系列和MIG1公司在归纳中FKS2型葡萄糖饥饿和进入固定相的表达一
| FKS2-lacZ公司报告质粒 | 菌株（基因） | β-半乳糖苷酶sp活性（nmol/min/mg蛋白质）
|
|---|
| 2%葡萄糖 | 0.05%葡萄糖 | 日志阶段 | 固定相位 |
|---|
| 1093万立方厘米(SNF1系列) | 7.9 | 23.7 | 7.1 | 380.4 |
| 846加元(snf1Δ10) | 14.1 | 14.7 | 11.7 | 368.8 |
| YM4797型(米格1) | 7.5 | 16.7 | ND（无损检测） | ND（无损检测） |
| YM4807型(米格1Δ) | 68.4 | 96.3 | ND（无损检测） | ND（无损检测） |
| 1093万立方厘米(SNF1系列) | 3.1 | 3.3 | 2.5 | 5.4 |
| 1846万加元(snf1Δ10) | 3.7 | 3.6 | 4.2 | 7.5 |
| YM4797型(MIG1公司) | 2.1 | 2.1 | ND（无损检测） | ND（无损检测） |
| YM4807型(米格1Δ) | 3.8 | 3.8 | ND（无损检测） | ND（无损检测） |
Mazur等人(28)确定了两个假定的“碳源调节序列”FKS2型启动子区位于位置−583和−489。我们的启动子分析表明，这些序列不足以诱导FKS2型对葡萄糖缺乏的反应，可能不参与这种调节。相反，SNF1蛋白激酶通过抑制MIG1转录抑制物介导葡萄糖可抑制基因的去表达(41). 检查FKS2型启动子区揭示了两个一致的MIG1结合位点(31,32)位置−785和−847。这两个地点都位于222-bp区域内，这是区分饥饿反应的区域FKS2型来自无反应报告者的报告，强烈表明MIG1阻遏物在饥饿诱导的FKS2型这得到了以下观察结果的支持：米格1Δ突变体显示饥饿反应报告者的基础表达水平（2%葡萄糖）是同类报告者的九倍MIG1公司应变（表). 正如预期的那样米格1Δ突变体显示，相对于野生型，无反应报告者的基础表达增加了不到两倍。
与葡萄糖饥饿的影响相似，只有报告质粒具有较长的FKS2型调节序列在进入稳定期时转录激活（表). 然而，与对葡萄糖饥饿的反应不同，这种激活并没有SNF1系列依赖。The ability of asnf1Δ10去压榨突变体FKS2型进入稳定相时的表达揭示了在222-bp区域中存在另一个调控序列FKS2型核苷酸−928和−706之间的启动子。
讨论
细胞完整性信号通路和钙调神经磷酸酶平行作用刺激FKS2型表达对热应力的响应。
FKS1和FKS2是GS复合体的替代亚单位(8,15,28,36). 钙调神经磷酸酶是FKS2型钙调神经磷酸酶的双突变体(CNB1公司)以及FKS1（FKS1）由于缺乏FKS2型表达式(11). 确定其他监管机构FKS2型缺失菌株的表达、剂量依赖性抑制因子CNB1公司和FKS1（FKS1）被隔离。通过此屏幕隔离的两个抑制器是MKK1型和RLM1型，分别编码MEK激酶和转录因子的血清反应因子家族成员(16,42). 这两个基因以前都参与了由RHO1型和PKC1。这些结果表明FKS2型表达也受细胞完整性信号的控制。
细胞完整性信号传导受到高温（如37至39°C）下生长的强烈刺激，但既不能调节表征良好的热休克反应，也不能调节应激元件（STRE）控制的应激反应基因的表达(18). 我们发现FKS2型由23°C到39°C的生长转变刺激，尽管该基因不具有热休克元素(30)或STREs(27)序列5′的1kb范围内到其翻译起始位点。类似于在高生长温度下维持细胞完整性信号(18)，表达增加FKS2型当细胞在高温下继续生长时，它会被无限期地维持。三种证据表明，细胞完整性途径和钙调神经磷酸酶平行作用，刺激FKS2型表达式。首先，钙调神经磷酸酶突变体表现出延迟但持续的诱导FKS2型表达对温度升高的响应，而细胞完整性信号突变(英里/千卡1)显示出快速但短暂的感应FKS2型以应对这一挑战。这些途径对FKS2型表达量与野生型大致相加。这些结果表明钙调神经磷酸酶介导对温度变化的早期反应，细胞完整性信号通路介导持续维持FKS2型在升高的温度下表达。同时抑制这两条途径完全阻止了FKS2型第二，归纳FKS2型外源钙的表达2+钙调神经磷酸酶依赖性过程在细胞完整性信号缺陷突变体中未受损。第三，钙调神经磷酸酶反应区FKS2型启动子可与细胞完整性信号反应区分离。钙调神经磷酸酶响应序列位于−928和−706之间的区域，而细胞完整性响应序列位于–706和−360之间的区域。在这方面，有趣的是，在哺乳动物T细胞中，钙调神经磷酸酶和蛋白激酶C协同激活白细胞介素2基因的转录(10). 因此，这些信号分子的合作活动可能是一个共同的主题。
细胞完整性信号传导参与FKS2型表达表明存在一个细胞壁构建的调节回路，其中RHO1 G蛋白控制GS的活性和至少一个组分的表达。然而，生长期间温度升高对野生型细胞中GS活性的影响不大。这可以解释为FKS1（FKS1）其表达不受温度升高的影响。仅在福克斯1突变体是GS活性随温度升高而显著增加。这些结果表明FKS2型作为细胞完整性信号的效应器，它的重要性不高。这一结论得到了生长缺陷缺失的支持FKS2型功能(28).
我们的结果为细胞完整性信号的直接靶点提供了第一个明确的证据。Igual等人(14)提出细胞完整性途径正向调节FKS1（FKS1）然而，这是基于以下观察结果：FKS1（FKS1）mRNA水平在pkc1和英里/千卡1突变体。此外，该研究中检测到的最严重受损的信号突变pkc1型Δ应变在有渗透支持的情况下保持不变，在稳态水平下仅显示25%至35%的下降FKS1（FKS1）mRNA与野生型比较。最后，Igual等人未能观察到FKS1（FKS1）本研究证实，野生型细胞的温度升高刺激了细胞完整性信号的mRNA，并提示我们FKS1（FKS1）不受此信号通路的控制。报告的减少FKS1（FKS1）细胞完整性途径突变体中的mRNA水平可能由这些突变体生长速度的差异或其他次要因素解释。
RLM1转录因子不需要用于热诱导FKS2型表达式。
RLM1型编码与细胞完整性信号有关的转录因子的血清反应因子家族成员(7,42,43). 隐性突变RLM1型被分离出来作为一种生长缺陷的抑制因子，该生长缺陷与表达过活跃MKK1型等位基因(42). 最近的报告表明，RLM1的转录活性受到MPK1磷酸化的积极调节(7,43). 然而rlm1型Δ突变体没有显示细胞完整性缺陷，这表明它在细胞完整性信号传导中的任何作用都很小。此外，只有RLM1型-相关酵母基因，指定SMP1公司，也无法单独或结合显示细胞完整性缺陷rlm1型(7,43).
我们发现RLM1型抑制了cnb1Δfks1Δ双突变体，可能通过介导FKS2型这一结论得到以下观察结果的支持：RLM1型生产过剩增加了FKS2型在室温下表达八倍。此外rlm1Δfks1Δ双突变体表现出合成致死性，其被过度表达的FKS2型，进一步表明RLM1型通常有助于FKS2型表达式。然而rlm1型Δ突变体不缺乏诱导FKS2型温度升档响应的表达式。此外，唯一可能的RLM1结合位点(7)在FKS2型启动子位于该基因热诱导所必需的区域内。这些结果支持以下结论：尽管RLM1有助于FKS2型表达，它不介导由细胞完整性信号刺激的该基因的热诱导。因为FKS2型钙调神经磷酸酶的表达，RLM1型，并且细胞完整性信号似乎是独立的，这些输入中每一个的合成致命性福克斯1Δ表明它们都对FKS2型在没有FKS1。
的表达式FKS2型应对葡萄糖缺乏和进入固定相。
的规定FKS2型表达受多种信号通路的独立控制。除了细胞完整性途径的作用外，钙调神经磷酸酶和RLM1型在这个基因的调控中，FKS2型发现对葡萄糖饥饿的诱导受SNF1蛋白激酶的控制。葡萄糖抑制FKS2型显然是由MIG1转录阻遏物在MIG1的两个共有结合位点上介导的FKS2型启动子。此外，FKS2型当细胞进入稳定期时，表达受到强烈诱导。然而，尽管此诱导的调控位点与SNF1和钙调神经磷酸酶应答序列（−928到−706）定位在同一区域，但两者都没有snf1Δ突变体nor a中国广播公司1Δ突变体的固定相反应受损。因此，FKS2型进入稳定期的诱导反应是控制该基因的第五种不同的调控输入。这些输入的摘要如图所示。.
的表达式FKS1（FKS1）和FKS2型通常相互对立FKS1（FKS1）在最佳生长条件下占优势。然而，FKS2型钙内流、交配信息素、热应激、葡萄糖缺乏、进入稳定期以及FKS1（FKS1）.诱导FKS2型通常伴随着FKS1（FKS1）表达，使细胞中GS活性水平不会因这些条件而发生明显改变。那么，为什么细胞在压力下会从一种GS形式转移到另一种形式？一种可能性是，GS的两种形式在功能上可能是不同的，但尚未被发现。例如，来自FKS2的GS可能比来自FKS1的GS更稳定，从而提高了在停滞状态和压力条件下的存活率。
