由致病菌株产生的空泡毒素VacA幽门螺杆菌是胃十二指肠溃疡发病机制中的主要毒力因子(4,5,19). 在培养基中加入VacA后的几个小时内，细胞会形成细胞内液泡，最终充满整个细胞液，导致细胞耐受和坏死(7,9). 小鼠胃粘膜细胞中出现空泡(11)还有狗(17)经口感染VacA。上皮和粘膜坏死后通常伴随着细胞增殖和组织再生，但炎症胃粘膜释放的坏死因子被认为有助于慢性炎症的形成(18). 液泡是酸性的，因此，它们吸收膜渗透性弱碱，如中性红，这提供了对液泡程度的快速定量测定(2,三). 液泡起源于内吞途径的晚期，含有晚期内体和溶酶体的蛋白质标记(12,15,16).
在以下培养基中幽门螺杆菌，VacA是一种95-kDa蛋白，以及与非共价相互作用相关的37-和58-kDa片段(18). 最近，研究表明，VacA可以在HeLa细胞的胞质溶胶中表达，在那里它会导致液泡的形成，与添加到培养基中并被培养细胞内吞的VacA诱导的液泡无法区分(6,8). 综上所述，这些结果表明VacA是一种能够与细胞结合并进入胞浆的毒素，与所有a-B型毒素一样，VacA在胞浆中表达其毒性活性。这些毒素由一个B结构域组成，参与细胞表面结合和催化活性a原聚体进入细胞(5,6,14). 目前，还没有关于VacA结构域A在其95-kDa多肽链中的位置以及该结构域的大小的信息。
为了回答这些问题，我们逐步缩短了编码VacA的基因，以便在转染HeLa细胞的胞浆中产生越来越小的片段真空吸尘器基因构建。在大多数双链A-B型毒素中，A链是氨基末端。因此，我们从VacA的C端进行性缺失开始，然后分析N端缺失的影响。转染细胞在转染后20小时通过目测和中性红摄取定量测量来检测空泡形成。
图的左侧面板中列出了C末端缺失的突变体。通过PCR扩增质粒ptox140获得(10)使用适当的5′和3′寡核苷酸速度我和巴姆HI限制位点。通过混合10 ng质粒ptox140和每个引物的50 pmol进行PCR扩增。反应混合物在94°C下预培养5 min，按照以下方案执行30个扩增周期：在94°C下变性30 s，在50°C下退火30 s，并在72°C下延伸1.5 min。最后一个PCR步骤在72°C下执行5 min。在连接反应之前，从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段。用酶消化载体pGEM7Zf（+）（Promega）速度我和巴姆HI与碎片在结扎反应中混合。将结扎混合物引入大肠杆菌XL-1 CaCl蓝色2转换过程。用双脱氧测序法检查核苷酸序列。通过使用最短的C末端缺失VacA突变体制备N末端缺失突变体，该突变体在细胞质中显示出完全活性：用速度我和生态RI（该限制位点自然存在于序列中），并与通过PCR扩增获得的PCR产物连接，通过使用含有速度我和生态RI限制位点。通过混合10 ng质粒ptox140和每个引物的50 pmol进行PCR扩增。将反应混合物在94°C下预孵育2分钟，并按照以下方案进行27个扩增循环：在94°C下变性1分钟，在52°C下退火2分钟，在72°C下延伸2分钟。最后一个PCR步骤在72°C下进行5分钟。从氨苄青霉素抗性菌落制备的质粒DNA，用于转染HeLa细胞。如前所述进行转染(6)简单地说，HeLa细胞与重组痘苗病毒vT7在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养30分钟，补充20 mM HEPES（pH 7.2），然后转染到含有3.7 g NaHCO的DMEM中三公升−1，10 mM HEPES（pH 7.2），10 mM-羟基脲，DNA（9 ngμl−1)和DOTAP（Boheringer）（27 ngμl−1)在37°C下持续2小时。
胞浆表达的VacA缺失突变体的抽空活性。左侧面板列出了本研究中HeLa细胞胞浆内生成的VacA片段。右侧面板报告细胞空泡化程度，定量分析为转染细胞（转染后20小时）吸收的中性红量。数据显示为最大值的百分比。报告的值是至少三个不同实验的平均值，条形代表标准偏差。与信号序列相对应的前33个残基，不存在于成熟毒素分子中，不包括在这里(4).
这一系列转染实验后获得的结果总结在图中。95-kDa毒素的C末端可以去除250多个残基，而不会丧失任何空泡化活性。此外，删除另外160个残基（VacA1-511）仍会留下具有相当大细胞溶质活性的毒素。用片段1-511转染的HeLa细胞显示出较小的液泡，具有类似的圆形外观，主要局限于核周区域。检测到不同VacA片段（片段1-913、1-511和1-377）的类似表达水平，通过电泳和抗VacA抗体染色的转染细胞提取物的免疫印迹进行评估（数据未显示）。因此，VacA的空泡化活性似乎仅限于多肽链的氨基末端部分。p58的残氨基末端部分存在于结构体1-672中，是活性所必需的，其作用很可能是协助p37结构域的正确折叠。用VacA1-672结构进行的N末端缺失结果分析进一步证实了这一结论，该结构是最短的C末端缺失的VacA，在胞浆中显示出完全活性。缺失24个残基的N末端缺失的VacA完全不活跃（图的下部。). 随后考虑了逐渐缩短的缺失，但即使是VacA6-672构建物（仅缺少五个N末端残基）也表现出强烈的活性降低。
这里的结果清楚地表明，VacA的细胞溶质活性位于毒素的氨基末端区域，其整个N末端是通过作用于细胞溶质诱导液泡所必需的。对这些结果的解释并不简单。氨基末端24残基长片段具有整体疏水性(4)它可能参与调节毒素与细胞膜细胞溶质表面的结合或将毒素导向选定的细胞溶质底物。另一种可能性是，去除一些N末端残基会影响蛋白质的稳定性，正如人类白细胞介素1β的情况一样(1). 然而，情况似乎并非如此，因为免疫印迹法进行的对照实验表明，在空泡化分析时，转染细胞中存在类似水平的不同片段（未显示）。
从目前的工作中也可以明显看出，58-kDa片段的很大一部分对于VacA的细胞溶质活性是不必要的。这一发现与p58具有膜活性并增加脂质体对K的渗透性这一事实相一致+(13)是几种a-B毒素的B原生质体所共有的属性。总之，这些数据提供了强有力的证据，证明VacA是一种A-B型毒素。
使用相同的实验方法，我们目前正在测试不同毒素片段以及p37结构域的单个氨基酸残基的作用，尽管用不同方法进行的广泛序列比较尚未揭示VacA的可能生物活性，它可以精确定位要突变的选定残留物。这些信息在设计VacA突变体时非常有价值，VacA变异体被认为是针对由以下原因引起的胃十二指肠疾病的治疗性疫苗的可能成分幽门螺杆菌.
