Dissociation of the Nuf2-Ndc80 Complex Releases Centromeres from the Spindle-Pole Body during Meiotic Prophase in Fission Yeast

Haruhiko Asakawa; Aki Hayashi; Tokuko Haraguchi; Yasushi Hiraoka

doi:10.1091/mbc.E04-11-0996

分子生物学细胞。2005年5月；16(5): 2325–2338.

数字对象标识：10.1091/桶。E04-11-0996号

PMCID公司：项目编号1087238

PMID：15728720

分裂酵母减数分裂前期Nuf2-Ndc80复合物从纺锤体释放着丝粒

浅川昭彦,^* 阿基·哈亚希,^* 原口德子,^*^†和平冈靖国^*^†

特里莎·戴维斯，监控编辑器

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摘要

在裂变酵母中葡萄裂殖酵母在有丝分裂间期，着丝粒仍然聚集在纺锤体（SPB）上。相反，在减数分裂前期，着丝粒与SPB分离。在这里，我们研究了着丝粒蛋白在小鼠减数分裂活细胞中的行为S.pombe公司我们发现，当着丝粒与SPB分离时，Nuf2-Ndc80复合蛋白（Nuf2、Ndc80、Spc24和Spc25）在减数分裂前期从着丝粒中消失。着丝粒蛋白Mis12也在减数分裂前期解离；然而，Mis6在减数分裂过程中一直存在。当细胞通过Pat1激酶（减数分裂的关键负调控因子）失活诱导减数分裂时，着丝粒在减数分裂前期仍与SPB相关。然而，突变使Nuf2失活会导致SPB中的着丝粒释放第1部分突变体细胞，表明Nuf2-Ndc80复合物将着丝粒连接到SPB。我们进一步发现，从着丝粒中去除Nuf2-Ndc80复合物和着丝粒-SPB分离是由交配信息素信号引起的。因为第1部分突变细胞在第一次减数分裂中也表现出异常的染色体分离，这种异常通过交配信息素信号进行补偿，Nuf2-Ndc80复合体的分离可能与减数分裂染色体分离的动粒重塑有关。

简介

真核染色体在细胞核内空间组织。这种核结构为染色体的活动提供了一个物理框架，但这个框架是动态的，能够改变其功能组织。裂变酵母葡萄裂殖酵母展示了进入减数分裂时着丝粒和端粒动态重新定位的一个显著例子。在这种生物体中，在有丝分裂间期，着丝粒在纺锤体极体（SPB；真菌中的中心体等效结构）附近聚集；然而，在减数分裂前期，着丝粒从SPB分离，而端粒聚集在SPB上。在S.pombe公司在减数分裂前期，这样一个重组的细胞核在细胞两极之间伸长和振荡，端粒聚集在位于运动细胞核前沿的SPB上(近重等人。，1994). 拉长的核通常被称为“马尾”核。众所周知，端粒聚集和细胞核运动通过从端粒对齐染色体和促进同源位点的接触，促进同源染色体配对(丁等。，2004). 然而，减数分裂期间着丝粒-端粒重新定位的机制仍不清楚。对减数分裂前期着丝粒蛋白的分析将有助于我们了解着丝粒从SPB分离的机制。

着丝粒蛋白在着丝粒重新定位过程中的调节可能影响着动粒在减数分裂和有丝分裂中的基本功能。着丝粒蛋白在纺锤体微管的附着中起着重要作用，具有监测纺锤体微管正确附着的检查点功能，并参与染色体分离过程中的力产生。在有丝分裂过程中，由DNA复制产生的成对姐妹染色单体平等地分离到分裂细胞。相反，在减数分裂过程中，姐妹染色单体在第一次减数分裂（减数分裂I）时分离到同一个极（还原分离），而在第二次减数裂（减数裂II）时与有丝分裂一样分离到相反的极（等式分离）。还原分离是通过纺锤体单极附着于减数分裂期间唯一建立的动粒来实现的。从酵母到人类，这些动粒功能是保守的。

的多层结构S.pombe公司有人提出了着丝粒-SPB复合物：在有丝分裂间期，着丝粒通过着丝粒蛋白、异染色质、γ-微管蛋白和其他在异染色素和SPB之间形成“锚”的蛋白层聚集在SPB上(科尼奥拉等。，2001; 另请参见图8). 此外S.pombe公司着丝粒，类似于酿酒酵母和人类，据报道(林下（Hayashi）等。，2004;Obuse公司等。，2004). 着丝粒蛋白Mis6和Nuf2的突变导致有丝分裂间期细胞的着丝粒分离(Saitoh公司等。，1997;阿佩伊伦等。，2003)因此，这些着丝粒蛋白可能为有丝分裂间期的着丝粒聚集提供分子基础。

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图8。

这个S.pombe公司动粒结构。在有丝分裂间期，着丝粒和动粒复合体位于SPB附近，包括Nuf2-Ndc80复合体、Mis12复合体和Mis6复合体。在核配和马尾期，Nuf2-Ndc80复合物和Mis12从着丝粒中消失，导致着丝粒-SPB分离。在马尾期晚期，Mis12复合物和Nuf2-Ndc80复合物再次出现在着丝粒上。

然而，在减数分裂前期，聚集的着丝粒是如何从SPB上分离的，目前尚不清楚。因为S.pombe公司在核配（单倍体核融合）和减数分裂前期，当着丝粒与SPB分离时，Nuf2从着丝粒-SPB复合体中消失(纳贝塔尼等。，2001)，我们推测S.pombe公司Nuf2蛋白可能参与减数分裂前期的着丝粒分离。Nuf2是一种进化上保守的着丝粒蛋白，属于Ndc80复合体，由其他保守蛋白Ndc80/Hec1、Nuf2、Spc24和Spc25组成(豪等。，2001;詹克等。，2001;纳贝塔尼等。，2001;Wigge和Kilmartin，2001年;德卢卡等。，2002;德沃尔夫等。，2003;霍里等。，2003; 麦克利兰等。， 2003,2004;巴拉德瓦杰等。，2004). 在本文中，我们观察了着丝粒蛋白在小鼠活细胞减数分裂过程中的行为S.pombe公司发现Nuf2-Ndc80复合蛋白和Mis12在减数分裂前期消失。此外，我们发现Nuf2在第1部分突变体细胞，进入减数分裂，着丝粒聚集在SPB上。然后我们监测了第1部分Nuf2失活的突变细胞，发现当Nuf2失活性时，着丝粒与SPB分离。这些分析揭示了Nuf2-Ndc80复合蛋白在SPB着丝粒分离中的可能作用。

材料和方法

葡萄球菌菌株和培养基

本研究中使用的菌株列于表1YES和EMM2用作生长培养基，ME用作产孢培养基(莫雷诺等。，1991).

表1。

应变表

应变	基因型
S.pombe公司
HA252-4A型	小时⁹⁰ade6-216 ura4-D18 leu1-32 nuf2⁺：：GFP-ura4⁺萨德1⁺：DsRed-LEU2
HA525型	小时⁹⁰卢1-32 ade6-210 ura4 sad1⁺：DsRed-LEU2 his7⁺：：LacI-GFP lys1⁺：：LacOp nuf2⁺：：CFP-ura4⁺
HA205-2A型	小时⁹⁰ade6-216 ura4-D18 leu1-32 ndc80⁺：：GFP-ura4⁺萨德1⁺：DsRed-LEU2
HA229-11A型	小时⁹⁰ade6-216 ura4-D18 leu1-32 spc24⁺：：GFP-ura4⁺萨德1⁺：：DsRed-LEU2
HA485-10D型	小时⁹⁰ade6-216 ura4-D18 leu1-32 spc25⁺：：GFP-ura4+sad1⁺：：DsRed-LEU2
HA259-1D型	小时⁹⁰ade6-216 leu1-32 lys1⁺：：mis12⁺-GFP第1版⁺：：DsRed-LEU2
HA260-7D型	小时⁹⁰ade6-216 ura4-D18 leu1-32 mis6⁺：：GFP-LEU2 sad1⁺：：DsRed-LEU2
HA309-11C型	小时^-ura4-D18编号2⁺：：GFP-ura4⁺第1-114页
HA495-9B型	小时^-ura4-D18 leu1-32 sad1⁺：：DsRed-LEU2 cen2（D107）：：kan^第页-尿酸4⁺-lacOp his7:：lacI-GFP pat1-114 lys1⁺：：mat-Pc
HA499-1C型	小时^-ura4-D18 leu1-32 sad1⁺：：DsRed-LEU2 cen2（D107）：：kan^第页-尿酸4⁺-lacOp-his7:：lacI-GFP pat1-114
HAR3021-1型	小时^-ura4-D18编号2⁺：：GFP-ura4⁺溶血素1⁺：：mat-Pc零件1-114
哈尔3041-1	小时^-ura4-D18 ndc80⁺：：GFP-ura4⁺溶血素1⁺：：mat-Pc零件1-114
HAR3031-1型	小时^-ura4-D18 spc24⁺：：GFP-ura4⁺溶血素1⁺：：mat-Pc零件1-114
HA3505C-1型	小时^-ura4-D18 cen2（D107）：：mat-Pc-URA3 lys1⁺：：mis12⁺：：GFP第1-114部分
CRLa59-1型	小时^-ura4-D18 leu1-32 lys1⁺：：mat-Pc mis6⁺：：GFP-LEU2第1-114部分
HA529型	小时^-/小时^-ade6-210/ade6-216 ura4/ura4 pat1-114/pat1-114 leu1-32/leu1⁺他的7⁺：：lacI-GFP/his7⁺cen2（D107）：：kan^第页-尿酸4⁺-lacOp/cen2 sad1⁺：：DsRed-LEU2/sad1⁺数字2⁺：：CFP-ura4⁺/无人机2⁺
HA530型	小时^-/小时^-ade6-210/ade6-216 ura4/ura4 pat1-114/pat1-114 leu1-32/leu1⁺他的7⁺：：lacI-GFP/his7⁺cen2（D107）：：kan^第页-尿酸4⁺-lacOp/cen2 sad1⁺：：DsRed-LEU2/sad1⁺编号2-1：CFP-ura4⁺/nuf2-1:：ura4⁺
HA478-1C型	小时⁹⁰ade6-216 ura4 leu1 nuf2-d2:：ura4⁺溶血素1⁺：：nmt1-nuf2⁺：：GFP sid4⁺：：mRFP-KanR
HA252-12B型	小时⁹⁰ade6-216 ura4-D18列2⁺：：GFP-ura4⁺
HA374-2C型	小时⁹⁰ade6-216 ura4-D18列2⁺：：GFP-ura4⁺ndc80型⁺：：HA-LEU2
HA229-1C型	小时⁹⁰ade6-216 ura4-D18 leu1 spc24⁺：：GFP-ura4⁺
HA329-3A型	小时⁹⁰ade6-216 ura4-D18 leu1 spc24⁺：：GFP-ura4⁺ndc80型⁺：：HA-LEU2
HA484-1A型	小时⁹⁰ade6-216 ura4-D18 leu1 spc25⁺：：GFP-ura4⁺
HA484-2C型	小时⁹⁰ade6-216 ura4-D18 leu12 spc25⁺：绿色荧光蛋白受体4⁺ndc80型⁺：：HA-LEU
HA282-3天	小时⁹⁰ade6-216 ura4-D18 leu1-32 nuf2⁺：：GFP-ura4⁺错误12⁺：：HA-LEU2
HA380-11C型	小时⁹⁰ade6-216 ura4-D18 leu1-32 nuf2⁺：：GFP-ura4⁺错误6⁺：：HA-LEU2
HA626-4D型	小时^-leu1-32 pat1-114 nuf2⁺：：HA-LEU2 lys1⁺：：mat-Pc
酿酒酵母
NKY278（挪威克朗）	MATa/MATα，ho:：LYS2/ho:：L YS2，ura3/ura3，LYS2/LYS2
AH109型	MATα，trp1-901，leu2-3，112，ura3-52，his3-200，gal4Δ，gal80Δ，LYS2：：GAL1_UAS公司-镀锌1_塔塔公司-HIS3、GAL2_UAS公司-镀锌2_塔塔公司-ADE2、URA3:：MEL1_UA公司S-MEL公司_塔塔公司-lacZ公司

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显微镜

按照丁的描述观察到活细胞等人。(1998). 必要时（见图图1，1,,3,三,,4,4,,5,5、和和7），7)，在每个时间点以0.4μm的间隔拍摄了10～14个焦点图像。对于免疫荧光显微镜，细胞按所述进行处理(Hagan和Hyams，1988年). 使用大鼠单克隆抗体3F10（印第安纳波利斯罗氏）作为抗HA抗体，使用Alexa488-共轭山羊抗鼠抗体（分子探针，尤金，OR）作为二级抗体。使用德尔塔视觉显微镜系统（Applied Precision，Seattle，WA）采集图像，并使用SoftWoRx软件进行数据分析。原口介绍了显微镜系统的设置等人。(1999).

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图1。

Nuf2在减数分裂过程中的行为。（A）有丝分裂生长细胞中的Nuf2-GFP（绿色）和Sad1-DsRed（红色）S.pombe公司菌株（HA252–4A）。细胞核用Hoechst33342（蓝色）染色。棒材，1μm。（B）活细胞观察S.pombe公司核配和减数分裂前期的Nuf2-GFP。HA252-4A菌株在产孢培养基上培养，获得活合子细胞的延时图像。显示了Nuf2 GFP（绿色）和Sad1 DsRed（品红色）。时间0表示Sad1-DsRed点熔断的时间。虽然Nuf2-GFP从着丝粒中消失，但有时在细胞质中观察到微弱的GFP信号（例如，31和42分钟时的框架）；这种细胞质信号可以与着丝粒信号区分开来，因为它们不遵循马尾核运动。棒材，10μm。（C） Nuf2在着丝粒的定位。HA525菌株在产孢培养基上培养。Nuf2-CFP（蓝色），岑1-GFP（绿色）和Sad1-DsRed（红色）。棒材，10μm。（D）观察酿酒酵母Nuf2蛋白在减数分裂前期。酿酒酵母在诱导减数分裂后0和5小时取NKY278菌株，然后制备用于免疫染色。Ndc10蛋白染色作为着丝粒标记。棒材，15μm。

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图3。

Nuf2-Ndc80复合蛋白在核配和减数分裂前期的行为。（A）观察S.pombe公司Ndc80、Spc24和Spc25蛋白质。在有丝分裂生长的细胞（HA205–2A、HA229–11C和HA485–1D菌株）中观察到Nuf2因子（绿色）和Sad1-DsRed（红色）。细胞核用Hoechst33342（蓝色）染色。棒材，1μm。（B）核配和减数分裂前期Ndc80、Spc24和Spc25的活细胞观察。将HA205–2A、HA229–11A或HA485–1D菌株培养在产孢培养基上，并按照图1.Ndc80-GFP、Spc24-GFP或Spc25-GFP（绿色）和Sad1-DsRed（洋红色）显示在合并图像中。棒材，10μm。（C） Nuf2-Ndc80复合蛋白的行为动力学。每隔5分钟记录表达Nuf2-GFP、Ndc80-GFP，Spc24-GFP或Spc25-GFP的细胞的时程图像。马尾期平均分为五个亚期。在每个子阶段中，对观察到GFP斑点信号的时间点的数量进行计数，并除以时间点的总数，以计算阳性GFP信号的频率。将百分比绘制为各子阶段的时间进程。检测的活细胞数量：Nuf2-GFP为22，Ndc80-GFP 14，Spc24-GFP 12，Spc25-GFP 11。

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图4。

Mis12和Mis6的行为。（A） Mis12或Mis6在减数分裂前期的定位。Mis12-GFP（HA259–1D，顶部）和Mis6-GFP菌株（HA260–7D，底部）在产孢培养基上培养，观察合子细胞。图中显示了典型的马尾核。Mis12-GFP和Mis6-GFP以绿色显示。SPB用Sad1-DsRed（红色）显示，细胞核用Hoechst33342（蓝色）染色。（B和C）Mis12和Mis6在核配和减数分裂前期的行为。在孢子形成培养基中每10分钟观察一次Mis12-GFP（HA259–1D）或Mis6-GFP菌株（HA260–7D）的活合子。Mis12-GFP或Mis6-GFP（绿色）和Sad1-DsRed（洋红色）也显示在合并图像中。棒材，10μm。（D） Mis12和Nuf2（左）之间以及Mis6和Nuf2之间的免疫沉淀分析（右）。表达Nuf2-GFP的Mis12和Mis12-HA细胞的提取物（HA282-3D和HA252-12B）以及表达Nuf2-GFP的Mis6和Mis6-HA细胞的萃取物（HA380-11C和HA252-12B）用抗-HA珠培养，沉淀物（IP）用抗GFP抗体进行免疫印迹分析。还分析了全细胞提取物（WCE）。提取物是从生长培养物中制备的。在右侧面板中，P表示沉淀；S、上清液。（E） Mis6或Mis12与Nuf2-Ndc80复合蛋白之间的酵母双杂交分析。用所示的质粒组合转化酵母菌株，将其置于选择性（顶部）和非选择性培养基（底部）上，并培养3天。

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图5。

中Nuf2的行为第1部分交配信息素信号的突变细胞。（A）着丝粒和SPB在生活中的位置第1部分突变细胞在缺乏或存在c（c）-类型垫子基因。菌株HA499-1C(小时⁻ 第1-114页)或HA495–9B(小时⁻ 第1-114页加材料-Pc)在26°C条件下因氮饥饿而在G1期被捕。在这些菌株中，使用GFP-LacI（识别lacO序列）显示染色体II的着丝粒区域，使用Sad1-DsRed显示SPB。细胞核用Hoechst33342（蓝色）染色。棒材，10μm。（B）在a.n=100的每个菌株中，着丝粒（cen2）从SPB分离的统计分析。（C）中Nuf2的行为第1部分-诱导减数分裂。小时⁻ 第1-114页在26°C的允许温度下，通过氮饥饿将表达Nuf2 GFP（HA309–11C）的细胞阻滞在G1中，然后在转移到34°C后观察到Nuf2 GFP。每帧中的数字表示温度变化后的时间（以分钟为单位）。棒材，10μm。（D）中Nuf2的行为第1部分突变体细胞c（c）-类型垫子基因。A菌株HAR3021-1(小时⁻ 图1-114编号2⁺-GFP菌株包藏垫子Pc）如C.Bar所述，观察到10μm。（E）中Ndc80、Spc24、Mis12和Mis6的行为第1部分突变体细胞c（c）-类型垫子基因。Ndc80-GFP、Spc24-GFP，Mis12-GFP和Mis6-GFP在小时⁻ 第1-114页携带材料-Pc在26°C下通过氮饥饿诱导G1期阻滞后的基因（HAR3041-1、HAR3031-1、HA3505C-1和CRLa59-1）。棒材，10μm。

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图7。

着丝粒分离编号2-1中的突变第1部分-诱导减数分裂前期。（A）减数分裂的进展数字2⁺/数字2⁺和编号2-1/编号2-1背景中的菌株第1部分^ts秒突变（分别为HA529和HA530）。这两个菌株在26°C下通过氮饥饿在G1中被截留，然后转移到34°C。用DAPI染色观察细胞核分裂情况。（B）着丝粒、SPB和Nuf2的定位。两种菌株都是在A中温度变化4小时后观察到的。通过lacO/GFP-LacI方法观察到的染色体II（cen2）的着丝粒周围区域(山本和平冈，2003年; 绿色）、Sad1-DsRed（红色）和Nuf2-CFP（蓝色）显示的SPB与亮场显微照片合并显示。条形，1μm。（C）着丝粒-SPB分离的频率。在A中温度变化（0 h）后的指定时间点，在每个菌株的细胞中测量着丝粒（cen2）和SPB之间的距离。每个时间点至少观察到100个细胞。cen2-SPB距离大于0.55μm的细胞显示为cen2-SPB-游离细胞。Mann-Whitney进一步比较了两个菌株的cen2和SPB之间的距离U型测试。p值，0小时为0.79，2小时为0.69，4小时为<0.0001。每个图表右侧的数字表示没有检测到Nuf2或Nuf2-1蛋白CFP信号的细胞百分比。（D）着丝粒-SPB距离的分布。以0.25-μm的间隔绘制以C为单位测量的cen2-SPB距离直方图，并绘制无人机2⁺（蓝色）和编号2-1（红色）0、2和4小时。

酿酒酵母菌株与细胞学

酿酒酵母使用NKY278菌株（SK1的衍生物）(表1). 培养基、减数分裂同步化和免疫荧光染色酿酒酵母细胞在Hayashi中描述等。，(1998). 抗-Nuf2和抗Ndc10抗体分别由P.Silver博士（马萨诸塞州剑桥市Dana-farber）和J.Kilmartin博士（英国剑桥市MRC实验室）提供。

蛋白质分析

对于免疫沉淀，细胞在YES培养基中生长，密度为0.5–1×10⁷用提取缓冲液（50 mM HEPESKOH[pH7.5]，含140 mM NaCl、1 mM EDTA、1%Triton X-100和0.1%脱乙酰胆酸钠）洗涤每毫升细胞三次。然后将细胞重新悬浮在含有蛋白酶抑制剂的500μl提取缓冲液中，并在Fast-Prep机器（加利福尼亚州卡尔斯巴德Bio101）中使用玻璃珠进行溶解。旋转提取物后，使用BCA蛋白质检测试剂盒（加州里士满Bio-Rad）测定蛋白质浓度。用0.5 mg抗HA抗体3F10（Roche）与蛋白G-Sepharose（Amersham Biotech，Piscataway，NJ）孵育1 h，对4毫克总蛋白提取物进行免疫沉淀。用提取缓冲液清洗免疫沉淀，并进行SDS-PAGE和Western blot分析。用小鼠多克隆抗GFP抗体（Clontech，Palo Alto，CA）检测GFP标记蛋白。根据Masai制备煮沸提取物等人。(1995). 从10中提取的蛋白质⁷细胞通过SDS-PAGE分离，然后转移到PVDF膜。用大鼠单克隆抗HA抗体3F10检测HA标记蛋白。还用小鼠抗Cdc2抗体（日本北海道大学M.Yamashita博士的礼物）检测了这些印迹，作为负荷控制。

酵母双杂交分析

MATCHMAKER GAL4双杂交系统（Clontech）用于酵母双杂交分析。的cDNAS.pombe编号2⁺,ndc80型⁺,spc24型⁺,spc25型⁺,mis6（错误6）⁺、和错误12⁺通过RT-PCR合成基因或使用S.pombe公司使用合适的寡核苷酸引物构建cDNA文库，并将框架内连接到pGBT9或pGAD424。这个酿酒酵母携带这些质粒的菌株（AH109）检测了两个报告基因的表达(HIS3型和ADE2型)根据Clontech MATCHMAKER系统手册。

融合基因的构建

GFP标记的施工S.pombe编号2⁺基因已在前面描述过(纳贝塔尼等。，2001). PCR引物列于表2.构建HA-tagged数字2⁺基因数字2⁺用引物nuf2-1和nuf2-21进行PCR扩增基因组DNA。用酶消化得到的片段生态T22I，在数字2⁺编码区域，以及不是一、并被克隆到Pst（磅/平方英尺）我-不是pTN218的I站点，包含HA标签(中村等。，2001)，创建pHA124。构建CFP标记数字2⁺基因载体、CFP片段和nmt1（纳米1）将终止器连接到pYC6(近重等。，2004); 得到的向量被指定为pCST62。这个数字2⁺然后使用引物nuf2-1和nuf2-20从基因组DNA中扩增基因，生成巴姆HI限制位点位于编码区的3′末端。用酶消化得到的片段生态T14I和巴姆HI，并结扎到Pst（磅/平方英尺）我-巴姆pCST62的HI位点，产生pHA135。这个编号2-1使用与编号2-1：：GFP构造(纳贝塔尼等。，2001)作为模板。产生的结果nuf2-1型如上所述处理突变基因片段以构建pHA136。适当的S.pombe公司用pHA124、pHA135和pHA136转化菌株，用于进一步操作。将这些结构集成到内生结构中数字2⁺该位点经PCR证实。过表达的质粒数字2⁺-GFP融合基因构建如下。这个数字2⁺利用引物nuf2-1和nuf2-2对编码区进行PCR扩增。用酶消化得到的片段Pst（磅/平方英尺）我和巴姆HI并克隆到pEGFP-N1（Clontech）的同一位点，产生Sp（nuf2-gfp⁺). 接下来，要获得数字2⁺-GFP融合基因片段Sp（nuf2-GFP⁺)被消化了不是一、直截了当，再次消化Bgl公司二、然后克隆到巴姆HI（高）-Sma公司pREP1的I位点，包含硫胺素可抑制nmt1（纳米1）发起人(Maundrell，1993年). 所得质粒pnmt-nuf2EGFP被进一步消化Pst（磅/平方英尺）我和囊并克隆到pYC36的同一位点(近重等人。，2004)，产生pnmt-nuf2EGFP/36。然后将pnmt-nuf2EGFP/36转化为S.pombe公司应变和整合溶血素1轨迹。通过PCR确认整合后，内源性数字2⁺基因被破坏数字2-d2无效突变等位基因(纳贝塔尼等。，2001). GFP标记的施工S.pombe ndc80号⁺,spc24型⁺、和spc25型⁺基因表现如下。的一部分S.pombe ndc80号⁺利用引物ndc80-1和ndc80-2对编码区进行PCR扩增。用酶消化得到的片段生态RI，在ndc80型⁺编码区域，以及巴姆HI并与连接生态RI公司-巴姆pCT54的HI片段(纳贝塔尼等。，2001). 这个S.pombe spc24型⁺利用引物spc24-1和spc24-2对编码区进行PCR扩增。用酶消化得到的片段生态T22I，在spc24型⁺编码区域，以及巴姆HI，并用精神分裂症我-巴姆pCT54的HI片段。的一部分S.pombe spc25型⁺利用引物spc25-4和spc25-6对编码区进行PCR扩增。将得到的片段克隆到pCST53中，该pCST52携带GFP和ura4型⁺基因（由Y.Chikashige提供）。构建HA-taggedndc80型⁺基因的一部分ndc80型⁺使用引物ndc80-7和ndc80-13通过PCR扩增编码区。用酶消化得到的片段萨尔我和不是我和克隆到pTN218的同一位点。这些构造被转换为S.pombe公司促进每个内源性位点整合的菌株。PCR或基因组Southern分析证实整合发生在正确的位点。A类错误12⁺-GFP融合构建物（由Y.Chikashige提供）如下：一个包含启动子区和ORF的DNA片段错误12⁺通过PCR扩增基因（介于−621和1795之间），并将片段克隆到pYC36中(近重等。，2004)带有GFP基因和nmt1（纳米1）⁺基因，产生pYC767。pYC767随后转化为S.pombe公司整合压力溶血素1⁺基因位点。在溶血素1⁺该位点经PCR证实。

表2。

本研究中使用的寡核苷酸序列

寡核苷酸名称	序列
编号2-1	5′AGCGCTGCCAGATATGCACAAACACAC3′
编号2-2	5英尺CCGGATCC公司(巴姆HI）GAGTTAGAAGACCTTAG3′
编号2-20	5英尺高GGATCC公司(巴姆HI）AGAGTTAGAGACCTTAAG3′
编号2-21	5英尺GCGGCCGC公司(不是一） CAGAGTTAGAGACCTTAA3′
ndc80-1型	5′CCAGATCTTGATGCAAGATTCTCCTCTTACG3′
ndc80-2型	5′重心GGATCC公司(巴姆HI）AGTTCCGAACGAGAGAGTC3′
ndc80-7型	5′CAAGTCGAC公司(萨尔一） TGCGCTACGCAAGTCGTCAAC3′
ndc80-13型	5英尺GAAGCGGCCGC公司(不是一） CCAGTTCCGAACGAGATAG3′
spc24-1型	5′CCAGATCTTGATGTCAGAGAGTCCAATTGAAC3′
spc24-2型	5′立方厘米GGATCC公司(巴姆HI）TTTTT GTCCTTACTATCATCAAG3′
spc25-4型	5英尺AGAGGATCC公司(巴姆HI）AATCAATTGAGACAGATCC3′
spc25-6型	5英尺ACTGTCGAC公司(萨尔一） TTACCGCGCAATCAT3′

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下划线表示人为添加的限制位置。

结果

减数分裂前期细胞核2从着丝粒消失

S.pombe公司在有丝分裂间期，着丝粒聚集在SPB上，但在核配和马尾期，着丝粒与SPB分离。着丝粒的行为与Nuf2定位相关S.pombe公司：在有丝分裂细胞周期中，Nuf2位于细胞核的着丝粒上，但在有核分裂和马尾期未观察到(纳贝塔尼等。，2001). 为了跟踪Nuf2随时间的消失和再现，我们观察了Nuf2-GFP融合蛋白在小鼠单个活细胞中的表达S.pombe公司。SPB也使用标记为DsRed的Sad1可视化(Chikashieg和Hirakaoka，2001年;近重等。，2004). 如所示图1，Nuf2 GFP，位于有丝分裂间期的着丝粒SPB簇(图1A)，在核配时从着丝粒上消失(图1B; −10–0分钟，当两个Sad1-DsRed点融合为一个点时）和马尾阶段（当融合的Sad1-DsRed在细胞内振荡时）。在马尾晚期，中期I之前，Nuf2-GFP在细胞核中重新出现为一个单点（136分钟；箭头所示）。在所有22个活细胞中观察到Nuf2定位的变化。为了证实Nuf2在着丝粒处重新出现，我们在同一细胞中同时观察到Nuf2-CFP融合蛋白和着丝粒。在这些实验中，使用lacO/GFP-LacI识别系统显示了I号染色体的近着丝粒区域（cen1）(纳贝希马等。，1998). 当Nuf2-CFP再次出现时，它与GFP-标记的cen1区域共定位(图1C). 这些结果表明，Nuf2在核配之前与着丝粒分离，在第一次减数分裂之前与着丝粒重新结合。Nuf2从着丝粒中消失的时间与着丝粒从SPB中分离的时间一致。

在芽殖酵母中也观察到减数分裂中Nuf2的消失酿酒酵母.英寸酿酒酵母，如中所示S.pombe公司，在有丝分裂细胞周期中，着丝粒在SPB附近形成簇，在进入减数分裂时分散(林下（Hayashi）等。，1998;金等。，1998). 当减数分裂被同步诱导时，酿酒酵母细胞在2~5h进入减数分裂前期，随后进行第一次和第二次减数分裂。在减数分裂前期，着丝粒簇首先沿直线延伸，然后分散在细胞核中(林下（Hayashi）等。，1998). 免疫荧光染色显示酿酒酵母Nuf2（ScNuf2）在减数分裂前期消失。在诱导减数分裂之前，ScNuf2与着丝粒标记蛋白Ndc10共定位（箭头所示；图1D，0小时）。在诱导减数分裂后5小时，一些细胞显示出着丝粒的线型，在着丝粒线的一端检测到ScNuf2信号（如图中右上角的两个细胞所示图1D，5h），但大多数细胞显示出分散的着丝粒模式，这些细胞中未检测到ScNuf2信号，而Ndc10在着丝粒处观察到分散的定位模式（箭头所示；图1D，5小时）。这些结果表明，在减数分裂前期观察到的Nuf2的消失S.pombe公司保存在酿酒酵母.

Nuf2相互作用蛋白在减数分裂前期也消失

在许多生物体中，Nuf2与Ndc80、Spc24和Spc25形成蛋白质复合物，作为动粒复合物的一部分(Wigge和Kilmartin，2001年;詹克等。，2001; 麦克利兰等。， 2003,2004;巴拉德瓦杰等。，2004). 在S.pombe公司根据Nuf2相互作用蛋白、Ndc80、Spc24和Spc25的氨基酸序列分别鉴定了它们的同源物（SPBC11C11.03、SPBC336.08和SPCC188.04c；Wigge和Kilmartin，2001年;詹克等。，2001; 麦克利兰等。， 2003,2004;德沃尔夫等。，2003;巴拉德瓦杰等。，2004). 我们已经证实，SPBC11C11.03、SPBC336.08和SPCC188.04c的GFP标记基因产物定位于有丝分裂的着丝粒(图3A). 此外，酵母双杂交和免疫沉淀试验表明Nuf2、SPBC11C11.03、SPBC336.08和SPCC188.04c相互作用(图2、A和B). 根据这些结果，我们得出以下结论：SPBC11C11.03、SPBC336.08和SPCC188.04cS.pombe公司分别为Ndc80、Spc24和Spc25。我们的双杂交检测结果S.pombe公司Nuf2-Ndc80复合物与酿酒酵母尽管存在一些差异（请参见讨论).

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图2。

Nuf2-Ndc80复合蛋白的相互作用。（A） Nuf2-Ndc80复合物的酵母双杂交分析。用所示的质粒组合转化酵母细胞，在选择性（顶部）和非选择性培养基（底部）上发现，并培养3天。使用含有1 mM 3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）的SD/-Leu、-Trp、-His和-Ade培养基作为选择性培养基。（B） Nuf2-Ndc80复合物的免疫沉淀分析。表达Nuf2-GFP的提取物（HA252-12B和HA374-2C，顶面板）、Spc24-GFP（HA229-1C和HA329-3A，中面板）或Spc25-GFP。所有提取物均从生长培养物中制备，并与抗-HA珠培养。用抗GFP抗体进行Western blotting分析沉淀物（IP）和全细胞提取物（WCE）。

然后，我们讨论了Ndc80、Spc24和Spc25在核配和马尾期是否消失。我们构建了Ndc80-GFP、Spc24-GFP或Spc25-GFP融合基因替换其各自内源性位点的菌株。ndc80型⁺,spc24型⁺、和spc25型⁺是必需的基因，并且各自的GFP融合构建物能够执行其基因组对应物的功能（未发表的数据）。如所示图3B在活细胞中的观察表明，Ndc80-GFP、Spc24-GFP和Spc25-GFP在有核分裂和马尾阶段消失，并在减数分裂之前重新出现（箭头所示），类似于Nuf2-GFP的发现。为了定量分析Nuf2-Ndc80复合蛋白的行为，我们将马尾期分为五个相等的亚期（每个亚期平均为30.1分钟），正如在Ding中所做的那样等人。(2004)，并计算GFP信号被检测为点时的时间点数量（参见图例图3B). 在所检测的22个细胞中，有15个细胞在IV亚期再次出现Nuf2；Ndc80、Spc24和Spc25也在大多数细胞的IV期亚期再次出现（分别为10个细胞（共14个细胞）、8个细胞（共计12个细胞）和9个细胞（总共11个细胞）；图3C). 在IV期亚期，同源着丝粒的结合有一个高峰(丁等。，2004)虽然不清楚着丝粒处Nuf2-Ndc80复合蛋白的再现是否与染色体配对有关。该分析表明，Nuf2、Ndc80、Spc24和Spc25在减数分裂前期的相似时间再次出现。因此，Nuf2、Ndc80、Spc24和Spc25可能在减数分裂期间表现为复合体。

Mis6在减数分裂前期仍位于着丝粒，而Mis12在着丝粒处水平降低

接下来，我们研究了特征鲜明的S.pombe公司着丝粒蛋白，Mis6和Mis12(Saitoh公司等。，1997;五岛等。，1999)，属于单独的子复合体(林下（Hayashi）等。，2004;Obuse公司等。，2004).图4A显示了在减数分裂前期表达Mis12-GFP（顶面板）和Mis6-GFP（底面板）的菌株。尽管在细胞核内观察到Mis6-GFP斑点，但未检测到Mis12-GFP斑点或其强度显著降低。活细胞中的观察结果表明，在有核分裂和马尾期，着丝粒处的Mis12-GFP水平显著降低，与Nuf2、Ndc80、Spc24和Spc25类似(图4B; 0–60分钟）。在所检测的9个细胞中，有8个细胞的信号减弱。与细胞核内无染色痕迹的Nuf2不同，Mis12-GFP偶尔会在细胞核内产生微弱的弥散染色(图4B). 这些结果表明，Mis12从着丝粒分离并扩散到整个细胞核。还应该注意到，Mis12在着丝粒上的重现时间明显早于Nuf2-Ndc80复合物(图4B; 与数字比较图1B1B年和和3B3B公司).

相反，在减数分裂过程中，Mis6-GFP始终位于着丝粒(图4C)：首先在每个单倍体细胞核中定位为SPB附近的单个斑点（−10 min），在核融合后（SPB融合表示），斑点分散成几个与SPB分离的斑点（0 min），反映着着丝粒从SPB分离；这些Mis6-GFP斑点跟随马尾核运动（20–160分钟），并在减数分裂期间（170–180分钟）分离。在所有20个受检细胞中都重现了结果。因此，Mis6和Mis12在减数分裂中表现不同。

Mis6和Mis12的不同行为表明存在至少两组着丝粒蛋白：一组是包括Mis6在内的组成型着丝粒蛋白，另一组包括Nuf2-Ndc80复合物和Mis12，它们在减数分裂前期完全或部分从着丝粒解离。免疫沉淀分析也表明Nuf2-Ndc80复合物和Mis12属于同一组。在表达Nuf2-GFP和Mis6-HA或Mis12-HA的营养细胞中，免疫沉淀分析检测到Nuf2与Mis12共沉淀(图4D)，表明Nuf2与Mis12形成复合物。然而，Nuf2与Mis12的相互作用可能是间接的，因为在酵母双杂交试验中未检测到相互作用(图4E). 相反，免疫沉淀分析均未检测到Nuf2和Mis6之间的相互作用(图4D)或酵母双杂交试验(图4E). 因此，在有丝分裂异步培养中，Nuf2和Mis6之间的相互作用可能非常微弱。

在pat1诱导的减数分裂中Nuf2保持在着丝粒位置，并在配对信息素信号传递中消失

我们使用一个温度敏感的突变等位基因来检测Nuf2的消失是否与着丝粒-SPB分离相关第1部分(第1-114页). Pat1是一种激酶，对减数分裂的启动起负调控作用，Pat1激酶的失活可诱导减数分裂(海滩等。，1985;Iino和Yamamoto，1985年;护士，1985年;瓦塔纳贝等。，1997). 单倍体细胞第1-114页通过转移到限制温度，可以诱导突变体同步进入减数分裂。重要的是第1-114页与野生型细胞不同，突变细胞的着丝粒在减数分裂前期仍和SPB相关(近重等。，2004;图5、A和B). 在中观察到Nuf2-GFP第1-114页在限制温度下诱导突变细胞进入减数分裂。在这些细胞中，在核运动期间连续观察到一个Nuf2斑点；后来，该点分成两个，然后又分成四个点，反映了两轮减数分裂(图5C). 这些结果表明，当着丝粒与SPB结合时，Nuf2仍位于着丝粒上第1-114页突变体。

什么时候？第1-114页细胞暴露在交配信息素下，着丝粒从SPB上脱落（Y.Chikashige和Y.Hiraoka，未发表的结果）。因此，我们检查了Nuf2在第1-114页交配信息素反应激活后的细胞。为了激活交配信息素信号，我们构建了第1部分单倍体细胞，表达垫子相反交配类型的基因。c型的表达垫子基因的作用与添加交配信息素的作用相同(山本和平冈，2003年). 的确，在小时⁻ 第1部分表达单倍体细胞材料-Pc，c型垫子的基因小时⁺交配型，着丝粒与SPB分离(图5、A和B). 在这些细胞中，在减数分裂诱导时未检测到Nuf2-GFP(图5D). 随着减数分裂的进行，Nuf2-GFP在细胞核内重新出现为一个单点，在减数分裂期间分为两个和四个点(图5D). 对Ndc80-GFP、Spc24-GFP，Spc25-GFP和Mis12-GFP进行了相同的实验。这些蛋白质，如Nuf2，在第1-114页表达mat-c材料基因(图5E). 相反，Mis6-GFP在相同条件下并没有消失，但在细胞核内形成了分散的几个斑点，表明它与从SPB分离出来的着丝粒有关(图5E). 因此，Nuf2-Ndc80复合体和Mis12的消失与减数分裂前期着丝粒从SPB上脱落有关。这些结果还表明，从着丝粒中去除Nuf2-Ndc80复合物受到交配信息素信号的调控。

为了测试观察到的蛋白质消失是由于降解引起的可能性，我们检查了在着丝粒处未检测到Nuf2-GFP荧光时Nuf2蛋白的命运。在这些实验中，我们分析了Nuf2-HA融合蛋白第1-114页表达材料-Pc基因。我们首先通过免疫荧光染色证实，Nuf2-HA的行为与Nuf2-GFP相似：在野生型减数分裂的减数分裂前期，Nuf2-HA从着丝粒中消失（未发表数据）。也在中第1-114页表达材料-Pc基因，在大多数显示马尾核的细胞中未观察到Nuf2-HA着丝粒定位(图6A，顶面板），而Nuf2-HA信号有时在显示有丝分裂间期样圆形核的细胞中观察到(图6A，底部面板）。因此，我们通过免疫印迹分析分析了Nuf2-HA融合蛋白在该菌株中的表达。的表达式材料-Pc中的基因第1-114页细胞可以同步诱导减数分裂(图6B和免疫印迹分析发现，Nuf2蛋白的量在整个减数分裂过程中基本不变(图6B，顶部面板）。这一结果表明，Nuf2的消失不是由于蛋白质降解引起的。接下来，我们检测了过表达Nuf2-GFP的细胞。在这些实验中，表达Nuf2-GFP的细胞在硫胺素可阻遏物的控制下nmt1（纳米1）启动子在不含硫胺的产孢培养基上培养以诱导表达。在减数分裂前期细胞中，过表达的Nuf2-GFP不位于着丝粒，而在有丝分裂细胞中，Nuf2-GFF定位于着丝粒(图6C). 这些结果强烈表明，Nuf2在减数分裂前期从着丝粒中被主动去除。

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图6。

（A） h中Nuf2-HA蛋白的免疫荧光染色⁻ 第1-114页具有材料-Pc（菌株HA626-4D）。通过氮饥饿诱导G1期阻滞后固定细胞，并进行免疫荧光。观察到200多个细胞检测Nuf2-HA。棒材，1μm。（B）减数分裂过程中Nuf2的表达。菌株HA626–4D的细胞通过氮饥饿被阻滞在G1中，并通过改变图例中描述的温度，诱导其进行同步减数分裂图5制备细胞提取物并用抗HA抗体进行免疫印迹分析。作为负荷控制，用抗Cdc2抗体检测Cdc2。用DAPI染色细胞核来监测核分裂动力学。（C）外源性表达Nuf2的定位。菌株HA478–1C的细胞，在硫胺素可抑制性下表达Nuf2-GFPnmt1（纳米1）将启动子培养在含有或不含硫胺的产孢培养基上，观察减数分裂前期细胞。细胞核用Hoechst-33342染色。箭头表示有丝分裂间期细胞。

Nuf2的分离释放SPB中的着丝粒

观察到的Nuf2-Ndc80复合物解离与着丝粒-SPB分离之间的相关性增加了Nuf2-Nd80复合物的解离直接导致着丝粒-SPB分离的可能性。为了检验这种可能性，我们使用了一个对温度敏感的突变等位基因数字2(编号2-1). 在限制温度下，对温度敏感的Nuf2-1蛋白不定位于着丝粒(纳贝塔尼等。，2001). 如果Nuf2的去除导致着丝粒从SPB上分离，那么着丝粒在编号2-1限制温度下的突变细胞。因此，我们在二倍体野生型中诱导了减数分裂(数字2⁺)或编号2-1背景为第1-114页(图7A;数字2⁺/数字2⁺和编号2-1/编号2-1并检查了着丝粒和SPB的位置。此外，Nuf2蛋白（或Nuf2–1突变蛋白）编号2-1突变细胞）通过用CFP标记而显现。在数字2⁺背景为的单元格第1部分突变，Nuf2-CFP定位于着丝粒，在大多数细胞中着丝粒与SPB相关(图7B，左）；在减数分裂前期，着丝粒-SPB的分离频率为16-21%(图7C（左），着丝粒与SPB之间的距离分布基本保持不变(图7D). 相反，在编号2-1单元格，带有第1部分突变，着丝粒-SPB距离随着减数分裂前期的进行而增加(图7D)显示着丝粒-SPB分离的细胞数量从0小时的26%增加到2小时的35%和4小时的49%(图7B，右；图7C而没有检测到Nuf2–1蛋白CFP信号的细胞数量从0小时的5%增加到2小时的46%和4小时的69%。这些结果表明，Nuf2失活会导致着丝粒与SPB的连接丢失，从而导致着丝束与SPB分离。然而，值得注意的是，显示着丝粒-SPB分离的细胞数量的增加略慢于没有检测到Nuf2-1信号的细胞数量。这可能是因为位于着丝粒的Nuf2-1蛋白的检测不到的水平仍然起着将着丝粒连接到SPB的作用，或者是因为在失去着丝粒-SPB连接后，着丝粒逐渐从SPB分离。

讨论

在本报告中，我们描述了Nuf2-Ndc80复合体在S.pombe公司在有限的减数分裂期内，着丝粒处Nuf2-Ndc80复合蛋白（Nuf2、Ndc80、Spc24和Spc25）和Mis12的水平显著降低，而另一个着丝粒蛋白Mis6在整个减数分裂期间仍留在着丝粒。着丝粒中Nuf2-Ndc80复合体和Mis12的消失与减数分裂前期着丝粒从SPB中的分离相一致(图8). 此外编号2-1突变释放了SPB的着丝粒第1部分突变体细胞，证明Nuf2在着丝粒与SPB的连接中起着重要作用。此外，Nuf2-Ndc80复合物和Mis12从着丝粒中去除是由交配信息素信号引起的。在减数分裂前期去除这些着丝粒蛋白可能是重塑动粒减数分裂特异性结构所必需的。在减数分裂前期留在着丝粒上的其他着丝粒蛋白，如Mis6，可能在重塑过程中维持着丝粒的结构和功能完整性方面发挥作用。

裂变酵母中的Nuf2-Ndc80复合物

Nuf2-Ndc80复合体是许多真核生物中保守的动粒复合体。所有Nuf2-Ndc80复合蛋白可能都是其功能所必需的。在酿酒酵母，其中任何一个的突变NUF2、NDC80、SPC24、，和SPC25系列在有丝分裂中破坏着丝粒和纺锤体微管之间的连接(他等。，2001;詹克等。，2001;Wigge和Kilmartin，2001年;德沃尔夫等。，2003)表明这些蛋白质在Nuf2-Ndc80复合物中都具有不可或缺的功能。

Nuf2-Ndc80复合组分（Nuf2、Ndc80、Spc24和Spc25）的同源物已在S.pombe公司(詹克等。，2001;纳贝塔尼等。，2001;Wigge和Kilmartin，2001年;巴拉德瓦杰等。，2004)但它们之间的相互作用尚未被描述。在本文中，我们在酵母双杂交分析中证明了这些成分之间的相互作用：Ndc80与Nuf2和Spc24相互作用，Spc24与Spc25相互作用；Nuf2和Spc24相互作用。这些结果导致S.pombe公司与之前报道的双杂交相互作用基本一致酿酒酵母(赵等。，1998;詹克等。，2001)，但有一些例外。Spc25和Spc25之间的相互作用酿酒酵母在中未检测到S.pombe公司报告的Nuf2和Spc25之间的相互作用酿酒酵母在3-AT存在时未检测到(图2A)，但在缺乏3-AT（未公布的数据）的情况下检测到，这表明Nuf2和Spc25在S.pombe公司.

葡萄孢动粒的亚复合结构

在这项研究中，我们确定了两组主要的着丝粒蛋白：在减数分裂前期，一组的着丝粒蛋白水平降低；另一组在着丝粒的水平保持不变。Nuf2-Ndc80复合蛋白和Mis12属于前者，Mis6属于后者。相反，在有丝分裂细胞周期中，所有这些蛋白质都保留在着丝粒上。最近有研究表明，Mis6和Mis12在着丝粒上形成不同的亚复合物(林下（Hayashi）等。，2004;Obuse公司等。，2004). Nuf2-Ndc80复合体和Mis12从着丝粒中消失或降低，而Mis6在减数分裂前期仍位于着丝粒，这一事实表明，这些亚复合体在减数分化中的调控不同(图8). 的级别酿酒酵母在减数分裂的着丝粒处，Nuf2的同源性也降低，这表明Nuf2-Ndc80复合体从着丝粒分离的进化保守机制。

在这项研究中，我们证明了Mis12和Nuf2-Ndc80复合物在有丝分裂细胞周期中的物理相互作用S.pombe公司最近有报道称hMis12（人类Mis12同源物）与Ndc80/Hec1相互作用(Obuse公司等。，2004)表明裂变酵母和人的动粒具有相似的亚复合结构。然而，Mis12可能属于着丝粒上Nuf2-Ndc80复合体的一个单独的亚复合体S.pombe公司.英寸错误12温度敏感突变细胞，Mis12突变蛋白在限制温度下从着丝粒中消失(五岛等。，2003). 在这些突变细胞的有丝分裂间期，着丝粒从SPB分散，而Nuf2作为一个单点留在SPB（H.Asakawa，未发表的观察结果）。因此，我们建议Nuf2位于SPB侧，Mis12位于着丝粒侧，如图8这一观点与免疫荧光和免疫电子显微镜研究一致，这些研究表明Ndc80位于Cnp1和SPB之间(科尼奥拉等。，2001). Cnp1是一种着丝粒特异性组蛋白H3变异蛋白，被Mis6招募到着丝粒(高桥等。，2000). 动粒亚复合物的这种结构可能反映了这样一个事实，即在减数分裂前期，Mis12比Nuf2复合物更早地在着丝粒重新出现。

减数分裂前期着丝粒Nuf2去除的调控

在本文中，我们证明了Nuf2-Ndc80复合体的着丝粒定位在减数分裂期间受到调控。在Pat1激酶失活诱导的减数分裂中，Nuf2-Ndc80复合物并没有从着丝粒中消失，而是在交配信息素反应时消失。我们之前已经证明，仅Pat1失活不足以将着丝粒从SPB上分离出来，并且需要交配信息素信号（本研究；近重等。，2004;山本等。，2004). 因此，从着丝粒中去除Nuf2-Ndc80复合物和从SPB中分离着丝粒并不是仅通过Pat1失活来实现的，需要交配信息素信号。Pat1激酶的一个重要靶点是Mei2，它是减数分裂的关键诱导因子(瓦塔纳贝等。，1997). 研究表明，在核配期间美2突变细胞的着丝粒经常与SPB相关，Nuf2仍位于着丝粒-SPB簇（H.Asakawa，未发表的观察结果）。因此，Nuf2的去除可能在一定程度上受到Mei2激活的调节。考虑到着丝粒处Nuf2的消失会导致着丝粒-SPB分离，我们预计Nuf2的去除会受到交配信息素信号下游Pat1依赖性和Pat1非依赖性调节途径的调节，正如端粒-SPB-聚集所证明的那样(山本等。，2004). 虽然交配信息素信号下游的因素仍然未知，但一个重要的因素可能是Polo激酶。Polo激酶在减数分裂着丝粒中起作用。在酿酒酵母，Polo激酶是Rec8的裂解和Mam1的补充所必需的，Mam1是减数分裂I中姐妹动粒单取向的一个基本因子(克莱恩等人。，2003;Lee和Amon，2003年). Polo激酶可能在减数分裂前期的动粒结构中起作用。另一个重要候选基因是Bub1检查点激酶。在减数分裂中，Bub1是维持减数分裂凝集素Rec8和斯戈I（Rec8的保护者）确保正确的染色体分离S.pombe公司(伯纳德等。，2001;北岛等。，2004). Bub1以外的检查点蛋白也可能参与Nuf2-Ndc80复合体的行为，因为据报道，这些检查点蛋白在有丝分裂细胞周期中与Nuf2-Nd80复合体相互作用(马丁·卢埃斯马等。，2002;德卢卡等。，2003;吉列等。，2004),

动粒重塑和减数分裂姐妹染色单体分离

减数分裂过程中去除一些着丝粒蛋白的意义是什么？这三个减数分裂染色体事件之间有着有趣的关联：1）在减数分裂前期，Nuf2从着丝粒分离；2）减数分裂早期，着丝粒从SPB分离；3）在第一次减数分裂时，染色体的还原分离。当Pat1失活诱导细胞减数分裂时，这些细胞在所有这些染色体事件中表现出异常行为：Nuf2仍位于着丝粒（本研究），着丝粒仍与SPB相关（本研究；近重等。，2004)姐妹染色单体在第一次减数分裂时没有表现出还原分离(山本和平冈，2003年). 通过激活交配信息素信号，有可能将所有这些异常活动转换为正常行为：Nuf2从着丝粒分离（本研究），着丝粒从SPB分离（本试验），染色体还原分离得到恢复(山本和平冈，2003年;山本等。，2004).

一个有趣的问题是，Nuf2-Ndc80复合物的消失和/或着丝粒从SPB分离是否是姐妹染色单体还原分离的先决条件。在减数分裂前期，减数分裂特异性着丝粒蛋白有望并入动粒，以建立减数分裂I中姐妹染色单体还原分离所需的单取向结构第1部分突变体在减数分裂I中表现出异常分离，这种异常通过交配信息素信号来补偿，但这种差异的分子基础尚不清楚。这是首次报道这种分子在第1部分带有或不带有交配信息素信号的突变细胞。Nuf2-Ndc80复合蛋白和Mis12的交配信息素依赖性分离可能是减数分裂染色体正确分离所需的动粒重构过程的一部分。一种令人着迷的可能性是，从着丝粒中去除Nuf2-Ndc80复合体是动粒减数分裂重构所必需的。在第1部分突变细胞在没有交配信息素反应的情况下，动粒可能在减数分裂期间保留含有Nuf2-Ndc80复合体的有丝分裂结构，导致减数分裂I中姐妹染色单体的两极分离。

致谢

我们感谢柳田光弘、Pamela Silver、John Kilmartin、Masakane Yamashita、Taro Nakamura、Akira Nabetani和Yuji Chikashiege提供抗体、质粒和裂变酵母菌株；Kaori Tatsumi、Hiroko Osakada和Chie Mori提供技术援助；Kohta Takahashi、Shigeaki Saitoh和Ayumu Yamamoto对手稿进行批判性阅读。这项工作得到了日本科学技术署对Y.H.和T.H.的资助。

笔记

这篇文章在年印刷之前在网上发表媒体中的MBC(http://www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc.E04–11–0996)2005年2月23日。

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文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会