的表达式嗜肺军团菌生长条件下的毒力特征

摘要

微生物的一个特点是它们具有显著的能力来改变细胞结构和新陈代谢，以应对环境的变化。作为淡水原生动物的病原体，嗜肺军团菌必须适应作为一种自由生活的微生物在水中生存和在阿米巴虫中复制。至少有一部分有助于这种微生物适应环境的特性也有助于其在肺泡巨噬细胞中生长(7,12)这可能导致被称为军团病的严重肺炎。

某些表达式嗜肺军团菌属性与生长条件相关。例如，通过螺旋吞噬作用进入巨噬细胞和变形虫(18)阿米巴原虫的生长增强了(9). 此外，变形虫和broth-grown之间存在显著的形态和生化差异嗜肺军团菌(1,9,30). 无论是环境条件还是调节嗜肺军团菌毒力性状已经鉴定。

对于许多微生物来说，从指数生长阶段过渡到指数后生长阶段的标志是显著的表型变化(38). 在自然界中，嗜肺军团菌只在细胞内的液泡中复制，细菌密度随时间增加而增加，营养水平可能随时间降低。本研究的目的是确定细菌密度或营养水平是否决定嗜肺军团菌为此，培养条件对6种基因表达的影响嗜肺军团菌特征，包括5个与毒力相关的特征(5,17,19,20,29)，已检查。分析结果表明嗜肺军团菌交替适应细胞内和细胞外环境。

材料和方法

鞭毛生产。

细胞内鞭毛的产生嗜肺军团菌免疫荧光显微镜分析。将培养在盖玻片上的巨噬细胞感染1h，洗涤两次以去除大部分细胞外细菌，然后在新鲜培养基中培养不同时间。重复样品基本上按照前面所述进行固定和染色(33)，使用以下试剂：含有鼠抗-嗜肺军团菌鞭毛单克隆抗体（来自N.C.Engleberg的礼物）稀释为1:100；将德克萨斯红缀合的山羊抗小鼠免疫球蛋白G（Molecular Probes）以1:1500稀释；用0.1μg DNA染色剂4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；Sigma）/ml PBS对细菌进行染色。用配备100×Plan-Neofluar物镜（数值孔径1.3）的Zeiss-Axioplan 2显微镜检查制剂。嗜肺军团菌含有至少一个鞭毛的液泡被评分为阳性；因此，报告了鞭毛的产生和稳定性（见图。​图2b）。2b） ●●●●。由于在免疫染色过程中，坏死的巨噬细胞经常会从盖玻片上脱落和清洗，因此在感染后22小时分析的样本中，鞭毛蛋白阳性空泡的数量可能被低估了。柯达T-Max ASA 400底片用Archimboldi Leafscan-45胶片扫描仪转换成数字图像；使用Adobe Photoshop软件（Adobe Systems，Inc.）优化每张图像的大小、对比度和亮度。

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图2

的特征嗜肺军团菌巨噬细胞中生长的细胞。（a） 巨噬细胞在早期（a和B）、复制期（C至F）和坏死期（G和H）的代表性图像嗜肺军团菌感染。感染2 h（A）、6 h（C和D）、19.5 h（G）、22 h（F和h）和24 h（E）后，用DAPI（A到h）对细菌进行染色，并用鞭毛特异性小鼠单克隆抗体和德克萨斯红结合抗小鼠免疫球蛋白G二级抗体（A′到h′）标记鞭毛。由于细胞内复制的开始并不同步，在感染后19.5小时，样本包括感染的复制和坏死阶段。从培养到OD的培养物中获得的非运动细菌₆₀₀<2，与巨噬细胞孵育2小时作为阴性对照（B）。箭头表示细胞和鞭毛之间的连接，并用作参考点。（b） 细胞内鞭毛的产生嗜肺军团菌通过免疫荧光显微镜对感染指数期后肉汤培养物中的运动菌和钠敏感菌的巨噬细胞进行评分。因为嗜肺军团菌含有一个或多个鞭毛的液泡被评为阳性，阳性液泡的百分比反映了鞭毛的产生和稳定性。由于在免疫染色过程中，坏死的巨噬细胞经常从盖玻片上脱落并被清洗，因此感染后22小时分析的样本中的鞭毛蛋白阳性空泡可能被低估了。所示为三个实验中每个时间点对至少30个吞噬体进行评分所确定的平均值和标准误差。（c）嗜肺军团菌通过在含有或不含100 mM NaCl的CYET培养基上电镀感染培养基稀释液（0 h）或合并巨噬细胞裂解液和培养上清液（2至24 h）来测定钠抗性。显示了一式三份的四到六次实验的平均值和标准误差。

结果

开始了解如何嗜肺军团菌为了适应不同的细胞内和细胞外环境，我们检测了从指数期和指数期后肉汤培养中获得的细菌的六种属性。

钠通过一些不明确的机制抑制了强毒株（而非无毒株）的生长嗜肺军团菌(5,31,36). 为了检查生长阶段对钠敏感性的影响，将从不同生长阶段的培养物中收集的细菌置于含有或不含100 mM NaCl的微生物培养基上，并对菌落形成进行量化。指数相位嗜肺军团菌耐钠，这是一个以前与无毒性遗传相关的性状(5,31). 然而，向指数后阶段的转变以钠敏感性快速增加1000倍为标志（图。​（图1A1A和B）。因此，钠敏感性的表达取决于嗜肺军团菌.

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图1

的特征嗜肺军团菌退出指数增长阶段。（A） OD之间的通信₆₀₀以及嗜肺军团菌AYET肉汤培养。将指数相培养物稀释为1:350（）、1:120（×）、1:35（□）或1:16（○），并在37°C下培养15 h；然后是OD₆₀₀在所示的时间测定每种亚培养物的浓度。四种代表性培养物的结果重叠，生长曲线重叠；在其他几个实验中也得到了类似的结果。（B）嗜肺军团菌钠敏感性通过OD平板培养物测定₆₀₀显示在CYET介质上，无（开放符号）和（封闭符号）100 mM NaCl。重复进行的三个实验用不同的符号（三角形、圆形和方形）表示。（C）嗜肺军团菌细胞毒性是通过活的巨噬细胞在与生长至OD的AYET培养物中获得的细菌培养1小时后减少比色染料Alamar蓝的能力来判断的₆₀₀s为0.374（○）、1.519（Δ）、1.882（□）、2.151（•）和2.231（▴）。显示了三份样品的平均值；标准误差为1.5%至8%。感染的多重性（MOI）通过将相应的肉汤培养物接种在CYET上来计算。显示了三份样品的平均值；标准误差为2.5%至14%。（D） 渗透阻力嗜肺军团菌培养基生长到OD₆₀₀通过在含有或不含0.3 M KCl的AYET中培养1小时，稀释到水中，然后在CYET上电镀重复样品以量化CFU，从而确定显示的s。四个实验的结果都用不同的符号（三角形、正方形、圆形和菱形）表示。（E） 嗜肺军团菌生长到指定的外径₆₀₀使用内吞探针Texas red-ovalbumin，通过荧光显微镜定量分析小鼠逃避巨噬细胞溶酶体的能力。数据来自四个实验，其中吞噬体得分为35（）、75（□）、50（○）或100（△）。作为阳性对照，细菌生长到OD₆₀₀分析>2，然后用福尔马林杀死；与德克萨斯州红-缬氨酸共定位的此类粒子的平均值为67%（标准误差=13）。（F） 的容量嗜肺军团菌生长到外径₆₀₀表明进入巨噬细胞并在巨噬细胞中存活的s被定义为在感染后2小时内对庆大霉素的保护。平均感染率嗜肺军团菌在四个实验中测定了重复或三次样品，每个实验用不同的符号表示。

毒株嗜肺军团菌通过不依赖于细胞内细菌复制的未定义机制杀死真核细胞；相反，至少有一些无毒菌株没有细胞病变(20). 通过以下方法确定生长期是否影响细胞毒性的表达嗜肺军团菌，将培养的巨噬细胞与不同细胞密度的培养物中获得的细菌孵育1h，然后测量巨噬细胞的活力，作为还原类色素阿拉玛蓝的能力。指数后相位嗜肺军团菌杀死巨噬细胞，而指数期细菌没有（图。​（图1C）。1C） ●●●●。然而，与钠敏感性不同，嗜肺军团菌在指数后阶段，细胞毒性表现为有限的一段时间。在一个有代表性的实验中，只有9%的巨噬细胞在细菌培养至OD的1小时后存活下来₆₀₀2.06，并以8:1的比例添加。在肉汤培养中再培养3小时后，细菌不再具有细胞毒性；80%的巨噬细胞培养物与细菌以15:1的比例孵育1h后存活。因此，细胞毒性的表达嗜肺军团菌依赖于生长阶段。

作为淡水阿米巴的胞内寄生虫，嗜肺军团菌大概是在高渗透压和低渗透压的环境中交替出现。为了测试渗透性休克抵抗力是否受生长条件的调节，从不同生长阶段的培养物中收集的细菌被转移到含有0.3 M KCl的肉汤中，并稀释到蒸馏水中，然后对菌落形成进行量化。渗透性休克后，指数期细胞的平板效率下降了10倍以上，而指数期后细胞则未受影响（图。​（图1D）。1D） ●●●●。因此，类似于大肠杆菌(21),嗜肺军团菌在指数增长后阶段变得耐渗透。

吞噬体的能力嗜肺军团菌避免巨噬细胞溶酶体降解是其发病的关键(2,15,17,34). 判断生长期是否影响嗜肺军团菌用荧光显微镜定量了含有指数期或指数后期细菌的吞噬体与荧光内吞探针的共定位。大约80%的指数期细菌，但不到5%的指数期后生物，居住在溶酶体中，这是通过与德克萨斯州红-缬蛋白共定位来判断的（图。​（图1E）。1E） 。因此，与之前的报告一致(34)，容量嗜肺军团菌为了避免溶酶体降解，在指数后阶段获得。

作为相对毒力的独立度量嗜肺军团菌比较其在巨噬细胞中的进入和存活情况。将细菌添加到培养的巨噬细胞中两小时后，根据对外源性庆大霉素的耐药性判断，指数期接种物中细胞内存活的不到0.2%。相反，超过5%的指数期后接种物进入巨噬细胞并存活下来（图。​（图1F）。1F） ●●●●。因此，正如它们更有效地逃避溶酶体所预测的那样，指数后阶段嗜肺军团菌生物体比指数期细菌更具传染性。这里没有研究指数期和指数期后细菌是否以相同的效率结合并进入巨噬细胞。

嗜肺军团菌毒力和鞭毛表达在遗传上是相关的，但细胞内生长并不需要运动性和鞭毛本身(26,29). 相反，鞭毛和其他毒力因子可能受到协调调节(29). 确定生长阶段对嗜肺军团菌用相控显微镜检测不同细胞密度培养物中的细菌运动性。指数后相位嗜肺军团菌细胞是高度运动的，但指数期细胞是不运动的（数据未显示）。因此，与之前的研究一致，运动和一些嗜肺军团菌毒力因子似乎受生长条件的协调调节(29,30).

接下来，我们检查了嗜肺军团菌巨噬细胞在生长过程中表型发生改变。就像指数期后肉汤培养一样，嗜肺军团菌在细胞内复制期结束时从宿主细胞释放出来的物质是能动的(30). 因此，我们通过免疫荧光显微镜确定鞭毛的生成是否在巨噬细胞的生长过程中受到调节。正如预期的那样，指数期细菌没有鞭毛（图。​（图2a，2a、 面板B，数据未显示），而运动指数后阶段后2小时嗜肺军团菌细胞被添加到巨噬细胞中，几乎100%的细胞内细菌被鞭毛化（图。​（图2a，2a、 面板a和图。​图2b）。2b） ●●●●。然而，在感染后6小时，吞噬体包含4到8个细菌，但只有一个鞭毛（图。​（图2a，2a、 面板C和D，以及图。​图2b）。2b） ●●●●。19.5小时后，液泡通常含有数十种细菌，但没有鞭毛（图。​（图2a，2a、 面板E和F，以及图。​图2b）。2b） ●●●●。相反，感染后22小时，坏死的巨噬细胞含有数十个鞭毛嗜肺军团菌细胞经常被观察到（图。​（图2a，2a、 面板G和H，以及图。​图2b）。2b） ●●●●。因此，与指数后阶段的运动表达一致，嗜肺军团菌只在其细胞内生命周期的最后阶段产生鞭毛。

嗜肺军团菌在巨噬细胞感染的整个初级周期中测量钠敏感性。与巨噬细胞复制期间指数期肉汤培养的表型一致，嗜肺军团菌具有抗钠性。伴随巨噬细胞的溶解和细菌的释放，钠抗性显著下降（图。​（图2c）。2c） ●●●●。因此，至少两个嗜肺军团菌性状不仅取决于肉汤中的生长阶段，也取决于巨噬细胞中的生长状态。

有趣的是，巨噬细胞似乎能转化钠敏感性嗜肺军团菌抗钠表型。当仅在RPMI-FBS中培养24小时时，指数期后细菌仍然对钠敏感（数据未显示）。相反，当接种物含有4%的抗钠剂时嗜肺军团菌与巨噬细胞孵育2h，近60%的细胞相关细菌具有抗钠性（图。​（图2c）。2c） ●●●●。抗钠细菌亚群似乎没有选择性地与巨噬细胞相关，因为抗钠细菌的总数在2小时培养期间通常增加了三倍或更多（数据未显示）。我们赞成巨噬细胞诱导嗜肺军团菌钠抗性表型，很可能是在没有细菌分裂的情况下，因为嗜肺军团菌在肉汤或细胞中的生成时间至少为2小时，嗜肺军团菌在组织培养基中不复制，通常在感染后4小时才能观察到细胞内生长(16,19,33,37).

在肉汤和巨噬细胞中生长期间，嗜肺军团菌许多毒力性状的表达明显受环境条件的调节。与其他微生物调节系统类似，这种表型转换可能是由当地环境中特定因子的积累或耗竭触发的(13,22). 相应地，指数期细胞在转移到指数期后培养上清液中时应具有毒性，与培养密度无关。正如预期的那样，当指数期细胞在指数期后培养获得的肉汤中培养3小时时，细胞毒性（图。​（图3B），三B） ，钠敏感性（图。​（图3C），三C） ，并诱导运动（数据未显示）。重要的是，用复合氨基酸或规定的氨基酸供应补充条件培养基会阻止所有三个性状的表达（图。​（图3三和数据未显示）。特别是，似乎含有限制氨基酸供应的培养基诱导从指数期退出并刺激毒性表型的表达，而支持细菌复制的培养基则没有（对比图。​图3A三A至图。​图3B三B和C）。因此，当氨基酸受到限制时，嗜肺军团菌退出指数期并表达毒力表型。

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图3

指数期的生长、细胞毒性和抗钠性嗜肺军团菌在指数期后上清液中培养。从具有OD的指数期培养物中收集的细胞₆₀₀在由相同的指数相培养物（E/E；OD）制备的上清液中培养0.62倍₆₀₀=0.57（0 h时）（开放正方形）或来自OD的指数后阶段培养₆₀₀2.09，补充H₂O（E/P；OD₆₀₀0小时=0.65）（闭合圈），酵母提取物（E/P+YE；OD₆₀₀0小时=0.65）（闭合方块），或五种氨基酸的混合物（E/P+AA；OD₆₀₀0 h时=0.62）（闭合三角形）。作为毒力表型的阳性对照，从OD的指数期后培养物中收集的细胞₆₀₀在由相同的指数后阶段培养物（P/P；OD）制备的上清液中培养2.09倍₆₀₀=0 h时的1.94）（开圆）。（A） 每组条件下细菌生长的相对水平表示为OD的比率₆₀₀在指定的时间到达OD₆₀₀0 h时的细胞毒性嗜肺军团菌如上所述培养3h，按照图的图例所述进行测定。​图1C。1C.所示为重复样品的平均值；误差条指示值的范围。观察到的细胞毒性依赖于细胞，因为指数期后培养上清液本身不存在细胞病变（数据未显示）。图A和B描述了单个实验的结果；在其他四个实验中也得到了类似的结果。（C） 抗钠性嗜肺军团菌根据图中的图例确定上述文化。​图11和​和2。2显示了重复进行的五个实验数据的平均值和标准误差。

讨论

嗜肺军团菌是一种机会性人类病原体，其自然宿主为淡水阿米巴。为了开始了解这种微生物如何识别和响应不同的细胞外和细胞内环境，培养条件对嗜肺军团菌检测钠敏感性、细胞毒性、渗透阻力、逃避吞噬-溶酶体融合、细胞内存活和运动。一系列定量微生物和细胞生物学检测的结果显示嗜肺军团菌退出指数增长阶段。综上所述，这些观察结果表明嗜肺军团菌毒力（图。​（图4）。4). 当宿主细胞的营养水平和其他条件有利时，嗜肺军团菌表示要最大限度地复制的函数。当氨基酸受到限制时，细胞内细菌产生因子来溶解废宿主细胞，在渗透胁迫下生存，在环境中扩散，并重建细胞内生态位以防止溶酶体降解。到达一个丰富的细胞内环境刺激了复制表型的回归。

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图4

的模型嗜肺军团菌根据文本中描述的生长条件进行表型调节。E、 指数增长期；P、 指数增长后阶段。

本模型与之前的研究一致嗜肺军团菌毒力。特别地，嗜肺军团菌鞭毛的表达和毒力在遗传上是相关的，尽管细胞内生长既不需要运动性也不需要鞭毛(26,29). 与微生物培养基中培养的细菌相比，嗜肺军团菌真核细胞释放出的生物体短而厚，运动能力强；它们具有光滑、厚的细胞壁、较高的β-羟基丁酸含量和不同的染色特性，并且表达不同的蛋白质阵列(1,9,30). 此外，温度会影响细胞外生长的形态嗜肺军团菌(14,24,28). 无论是所有或部分的相应遗传决定因素嗜肺军团菌性状构成一个对氨基酸水平作出反应的调节子，尚待确定。

特定毒力性状的表达模式可能为其功能或生化基础提供线索。例如，假设的作用嗜肺军团菌细胞毒素（图。​（图1C1C和​和3B）三B） 尚未建立。我们观察到，在固定相的有限时间内表现出最大细胞毒性，这表明嗜肺军团菌细胞毒素介导宿主细胞的逃逸。然而，我们的实验并没有排除一种替代模型，在该模型中，这种明显的细胞毒活性需要嗜肺军团菌在吸收过程中直接形成其新的复制液泡。

遗传和动力学研究(5,31,36)（图。​（图1）1)已关联嗜肺军团菌钠敏感性与毒力；然而，这一特性的生物学基础尚不清楚。有人提出，毒性因子易位装置的组装和/或活性，如假定的Icm-Dot蛋白复合物(32,35)，可使钠的抑制水平扩散到指数期后细胞的细胞质中(36). 同时归纳嗜肺军团菌钠敏感性、细胞毒性和对营养限制的感染性与这种机制相一致。

嗜肺军团菌与其他几种细菌病原体一样，具有应对环境变化的能力，以确保其在环境中生存(27). 例如禽分枝杆菌通过巨噬细胞或阿米巴的生长或暴露于低氧张力或高渗压而增强(三,4,8). 同样沙门氏菌当氧气限制时，spp被诱导进入哺乳动物细胞(23). 最后，链球菌红原毒素B的表达和沙门氏菌基因受到调节以应对营养物质的消耗(6,13). 详细了解嗜肺军团菌毒力可能有助于鉴定使这种病原体能够寄生在真核细胞上的效应功能。了解嗜肺军团菌毒力调节机制也可能建议从环境或感染的肺部根除这种病原体的方法。

鸣谢

参考文献