多不饱和脂肪酸的简化分析方法
1和1Jing X Kang（静X康）
1美国马萨诸塞州波士顿市马萨诸塞总医院和哈佛医学院医学部，邮编02114
王京东
1美国马萨诸塞州波士顿市马萨诸塞总医院和哈佛医学院医学部，邮编02114
1美国马萨诸塞州波士顿市马萨诸塞总医院和哈佛医学院医学部，邮编02114
通讯作者。 收到日期：2004年11月12日；2005年3月24日接受。
版权©2005 Kang和Wang；被许可方BioMed Central Ltd。 摘要
背景
生物材料脂肪酸组成分析是油脂研究中的一项常见任务。传统上，通过气相色谱法进行脂肪酸分析的样品制备包括两个单独的程序：脂质提取和甲基化。这种传统方法复杂、繁琐、耗时。开发一种快速简便的脂质分析方法是必要的。
结果
我们简化了传统方法，将提取和甲基化结合为一个步骤（省略了先前提取的过程）。各种生物样品，包括培养细胞、动物组织和人体标本都已使用新方法进行了测试。统计分析表明，简化方法对组织样品中长链脂肪酸的回收率显著高于传统方法，但两种方法的相对脂肪酸组成没有差异。这种简化的方法可以大大节省时间和材料，并降低样品损失和污染的可能性。
结论
在不影响长链（≥18℃）脂肪酸及其组成的回收率的情况下，可以省略常规用于脂质分析的甲基化前的脂质提取程序。该简化方法快速、易于使用，适用于分析各种生物样品中的总长链多不饱和脂肪酸（例如n-6和n-3脂肪酸），特别是当待分析样品数量较大和/或样品尺寸较小时。
背景
细胞膜脂肪酸组成是细胞功能的重要决定因素[1]. 调节细胞脂肪酸组成是调节不同细胞类型生物反应性的一种广泛使用的方法。最近，脂肪酸状况，特别是细胞或组织中ω-6（n-6）与ω-3（n-3）多不饱和脂肪酸的比率，已成为监测饮食干预（即补充脂肪酸）结果和确定脂质相关疾病（如心血管疾病）风险因素的生物标志物[2]. n-6/n-3脂肪酸比率的测量也可用于确定动物表型，例如我们最近创建的fat-1转基因小鼠[三]. 因此，脂肪酸成分分析是脂质研究中常用的技术。
脂肪酸成分的分析通常采用气相色谱法（GC）。通常，GC样品的制备涉及两个单独的程序：萃取和甲基化。脂质通常通过使用有机溶剂（如氯仿/甲醇）从细胞或组织匀浆中提取[4]. 这一过程耗费时间和材料，可能导致样品损失和污染，并产生有机废物。当待提取和分析的样品数量较大和/或样品尺寸较小时，这些问题变得更加明显。
这项研究验证了一种将提取和甲基化结合为一个步骤的方法。我们的结果表明，这种不需要预先提取的简化方法获得了理想的结果。
结果和讨论
测试的样本包括培养细胞、组织匀浆和红细胞，被分成两等分。在相同的色谱条件下，一种用常规方法分析，另一种用简化方法分析。对传统方法和简化方法所得结果进行了比较。图显示了从这两种方法获得的小鼠心脏组织的一组典型脂肪酸谱。一般来说，使用未经事先提取的简化方法所得结果与使用标准方法所得结果一样好，甚至更好，尤其是当样本量较小时。如表所示简化方法对组织样品中长链脂肪酸的回收率明显高于传统方法，但两种方法的相对脂肪酸组成没有差异。然而，值得注意的是，一些短链和中链脂肪酸（<16C）可能会损失，但那些链长为16个或更多碳的脂肪酸都没有受到影响（图。). 在使用培养细胞、红细胞和鼠尾进行的测试中也发现了类似的结果。这些结果表明，在用GC分析总长链脂肪酸组成时，甲基化前提取脂质是不必要的。我们还发现，液体样品中的水，如果其含量不超过添加的BF3溶液体积的5%，对分析结果没有显著影响。因此，简化方法适用于干燥样品和液体样品。然而，使用简化方法获得的结果仅限于分析样本中总脂质的脂肪酸分布。对于需要单个脂质类别（例如磷脂或甘油三酯）的脂肪酸组成的研究，仍然需要事先提取和分离脂质进行分析。
比较传统方法和简化方法的脂质分析结果（气相色谱）。通过在液氮中研磨使小鼠心脏组织均质化，并使用相同数量（2 mg/样品）的匀浆在相同色谱条件下，按照方法中的描述，通过每种方法进行分析。面板A：使用传统方法获得的GC结果。B组：使用简化方法获得的结果。注意，提取前将脂肪酸23:0（1μg）作为内标添加到样品中。
表1
用常规和简化方法进行脂质分析的定量结果。样品制备和脂质分析如图1所示。每种脂肪酸的数量（绝对量）由其峰面积表示。（两种方法的组织样品的初始重量相同。）每种脂肪酸的面积百分比是通过将其峰面积除以所识别的8种脂肪酸（不包括23:0）的总峰面积来计算的。数值是五个（n=5）测量值的平均值±SD。具有相同字母的每种脂肪酸的值在传统方法和简化方法之间没有显著差异（p<0.05）。
| 确定的脂肪酸 | 数量（峰值面积：×1000计数） | 组成（确定的LCFA总量的百分比） |
|
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| 常规方法 | 简化方法 | 常规方法 | 简化方法 |
| 16:0 | 26.3 ± 0.8一 | 30.4 ± 0.6b条 | 14.6 ± 0.1一 | 14.5 ± 0.6一 |
| 18:0 | 34.5 ± 1.2一 | 37.5 ± 0.4b条 | 18.9 ± 0.2一 | 18.5 ± 0.3一 |
| 18:1(9) | 18.1 ± 0.6一 | 21.6 ± 0.3b条 | 10.1 ± 0.1一 | 10.3 ± 0.1一 |
| 18:2(6) | 29.3 ± 0.9一 | 35.3 ± 0.5b条 | 16.3 ± 0.2一 | 16.8 ± 0.3一 |
| 20:4(6) | 12.7 ± 0.5一 | 15.0 ± 0.2b条 | 7.0 ± 0.2一 | 7.1 ± 0.1一 |
| 22:5(3) | 4.1 ± 0.2一 | 5.0 ± 0.3b条 | 2.1 ± 0.1一 | 2.3 ± 0.2一 |
| 22:6(3) | 55.1 ± 1.6一 | 64.4 ± 1.3b条 | 30.6 ± 0.2一 | 30.7 ± 0.3一 |
| 23:0（标准） | 42.9 ± 1.6一 | 47.7 ± 1.0b条 | | |
结论
本研究表明，在生物样品中长链（≥18 C）多不饱和脂肪酸的脂质分析中，传统上采用的甲基化前的脂质提取程序可以省略，而不会影响长链脂肪酸及其组成的回收。此简化方法适用于分析各种生物样品中的长链脂肪酸组成，但不适用于中短链（<16C）脂肪酸的定量。由于改进后的方法相对简单和敏感，它具有许多优点，包括节省时间和易于使用，减少样品损失和污染的可能性，并且只需要少量样品和溶剂。在待分析样品数量大和/或样品尺寸小的情况下，这些优势变得更加明显。例如，在需要监测大量受试者红细胞或其他样本的多不饱和脂肪酸组成（尤其是n-3脂肪酸含量）的大型临床试验中，使用简化方法将使脂质分析任务更加容易。这种新方法对于显示独特脂肪酸特征的转基因动物的表型分析特别有用，例如我们最近培育的fat-1转基因小鼠[三].
方法
常规方法
通过与Folch方法类似的程序提取细胞或组织脂质[4]. 添加含有0.005%丁基羟基甲苯（作为抗氧化剂）的氯仿/甲醇（2:1，v/v）（通常向50–100μl样品中添加5 ml溶剂）并剧烈混合1分钟，然后在4°C下放置过夜。添加一毫升0.9%氯化钠并再次混合。收集含有脂质的氯仿相。用另外2 ml氯仿提取残余物。将氯仿混合并在氮气下干燥，然后进行甲基化。为了监测回收率，在样品中加入脂肪酸C23:0（通常在2 mg组织样品中加入1μg）作为内标。
脂肪酸甲酯的制备方法与上述方法类似[5,6]使用BF三/甲醇试剂（14%三氟化硼）。将脂质样品与1 ml己烷混合在16 ml玻璃管中，玻璃管内装有聚四氟乙烯衬里盖。高炉三/添加MeOH试剂（1 ml），将混合物在金属块或砂浴中在90–110°C下加热1小时，冷却至室温，并在添加1 ml H后在己烷相萃取甲酯2O.让样品静置20–30分钟，然后去除上己烷层并在氮气下浓缩。
脂肪酸甲酯通过气相色谱法进行分析，使用配备有火焰离子化检测器的全自动HP5890系统，如前所述[7]色谱采用Omegawax 250毛细管柱（30 m×0.25 mm I.D.）。通过与脂肪酸标准品（Nu-chek-Prep、Elysian、MN）进行比较来确定峰，并使用Perkin-Elmer M1积分器分析每个解析峰的面积及其百分比。
简化方法
将玻璃甲基化管中的小份细胞颗粒或组织匀浆（<50μl）与1 ml己烷和1 ml 14%BF混合三/MeOH试剂。用氮气覆盖后，将混合物在100°C下加热1小时，冷却至室温，并在添加1 ml H后在己烷相萃取甲酯2O、将样品离心1分钟，然后去除上己烷层并在氮气下浓缩。如上所述，通过气相色谱法分析脂肪酸甲酯。
统计分析
使用非配对t检验比较两种方法的结果，以及P（P）<0.05的值被认为是显著的。结果为平均值±标准偏差。
作者的贡献
JXK公司构思研究，参与实验的设计和实施，并准备手稿。
JW公司进行样品制备、GC分析和数据收集。
致谢
作者感谢Kelley Kallin的技术援助。本研究得到了美国癌症协会（RSG-03-140-01-CNE）和美国癌症研究所（2A017-REV）向J.X.K提供的资助。
工具书类
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