随机CaMKII开关的稳定性：依赖于酶分子数和蛋白质周转

摘要

介绍

分子开关牵涉到许多类型的细胞生物学过程，包括存储有关细胞命运的决定[1]，遗传控制[2]以及大脑中的记忆存储[三]. 这种开关的机制通常取决于某种自催化过程。如果开关由少量分子组成，则随机波动是显著的，确定性描述是不够的[4]. 由于相反反应的动态相互作用，这种波动可以自发地重置开关的状态。此类重置事件对开关用于信息存储的有效性施加了时间限制。因此，了解控制开关稳定性的因素并对如何实现特定生物过程所需的稳定性进行定量分析至关重要。迄今为止，开关的稳定性问题主要与遗传开关有关[5,6,7,8,9].

开关稳定性问题与突触功能特别相关[10,11]因为记忆被认为是由突触强度的变化编码的[12]因为有迹象表明突触强度是由分子开关控制的[13,14,15]. 通过分子开关，我们指的是一个分子或一小群分子，它们可以经历持续的状态变化。在我们的定义中，状态的变化是以离散的方式发生的，而不是以平滑分级的方式。显然，编码记忆的突触开关的自发重置会产生问题，因为这会导致存储的记忆丢失。事实上，至少有一些记忆会持续一辈子，这表明存在着非常稳定的存储过程。

突触信息存储的机制开始被阐明[16]. 已经证明，短暂的强烈刺激可以导致突触强度增加，这一过程称为长期增强（LTP）[17]. 体内研究表明，LTP可以持续至少一年[18]. LTP的启动是由激活N个-甲基-D类-天冬氨酸（NMDA）通道和细胞内钙（Ca）的升高²⁺)浓度[19,20]. 人们普遍认为钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）的激活在LTP中起着关键作用（参见[三]). CaMKII激活持续存在[21]LTP需要[22,23,24]，且其本身足以产生增强作用[25]. 根据行为测试的定义，CaMKII的基因修饰可以阻止其持续激活，从而阻止长期记忆[24]. CaMKII是突触记忆分子的可能性进一步加强，因为它具有自催化特性，可以发挥分子开关的作用[10,26,27]. 尽管CaMKII是长期突触修饰所必需的，因此是记忆分子的有力候选者，但是否有证据表明其持续激活对于维持LTP是必要的仍然是一个悬而未决的问题[23]。

在之前对CaMKII开关的分析中，Zhabotinsky和Lisman[28,29]提出了一个模型，该模型融合了CaMKII全酶的许多关键生化特性和使其去磷酸化的磷酸酶-1（PP1）酶[30,31]. 研究表明，CaMKII全酶的自磷酸化和PP1分子的去磷酸化之间的相互作用可以在游离钙的基础水平上产生两种稳定的磷酸化状态²⁺因此，高Ca的瞬态输入²⁺（例如在LTP诱导中使用的刺激方案期间）可以将系统从非磷酸化（DOWN）状态切换到持续的高磷酸化（UP）状态。LTP诱导后CaMKII激活的持续变化可能是突触强度持续变化的基础。在这些先前的建模工作中，化学反应由质量作用定律确定地描述，排除了对开关稳定性的估计。最近的测量表明，单个突触的突触后密度（PSD）中CaMKII全酶的数量相对较少，这使得考虑随机波动对稳定性的限制变得更加迫切[32]. 对于典型的PSD，大约有30种全酶[32]. 由于缺乏将开关稳定性与开关分子数量联系起来的理论，这一发现的含义尚不清楚。当前的工作使用CaMKII/PP1系统中随机化学反应的蒙特卡罗模拟来解决这个问题。这种方法允许我们定量估计CaMKII开关的稳定性（寿命）及其对分子数的依赖性。因此，我们的结果提供了PSD内CaMKII开关存储长期记忆潜力的新信息。

我们工作的第二个目标是分析分子翻转对开关稳定性的影响。因为生物开关本身是由不稳定的分子组成的，所以必须发生转换。这种周转可能会对道岔稳定性产生不利影响[33]. 然而，转换不一定导致开关重置，因为新分子可能采用依赖于开关中其他分子状态的状态[33,34]. 具体来说，当CaMKII开关处于UP状态时，PP1活动应该饱和。这种饱和度降低了磷酸酶的有效性，因此，当磷酸化的全酶被新合成的未磷酸化的全酶取代时，新的全酶甚至在碱性钙离子上也会因自身磷酸化而磷酸化²⁺水平。这可以恢复切换事件之前存在的交换机的状态。直接测量表明，突触处的CaMKII大约每天翻转一次[35]比突触记忆短得多的时间尺度。然而，还没有为任何类型的分子开关开发出理论来估计这种转换如何在数量上影响稳定性。在这里，我们检查有关CaMKII开关的问题。我们的发现揭示了其他类型分子开关的一般原理。

结果

自催化导致双稳态

为了了解分子开关中随机涨落的影响，我们对CaMKII/PP1开关模型进行了模拟[28,29]. 在此实现中，使用蒙特卡罗方法对反应进行随机建模，单独考虑的CaMKII和PP1分子的数量与单个突触PSD中包含的数量相当。

CaMKII全酶由两个环组成，每个环有六个激酶亚基。每个亚单位在Thr286/287有一个单一的磷酸化位点，当磷酸化时，即使在Ca²⁺/钙调素不再结合。如果满足两个必要条件，则在给定的“底物”亚基上进行位点的自磷酸化[36]. 钙²⁺/钙调蛋白必须与“底物”亚基结合才能揭示其Thr286/287位点。此外，逆时针方向相邻的“催化剂”子单元必须处于活动状态。因此，“开”环所必需的初始自磷酸化需要两个钙分子的结合²⁺/钙调蛋白。环内其他亚基的后续磷酸化更快（参见图1A） 因为磷酸化亚基在没有钙的情况下具有组成活性²⁺/钙调素。因此，只有一个Ca²⁺/如果钙调素的逆时针“催化剂”邻接物已经磷酸化，则钙调素需要磷酸化“底物”亚基。（注意，我们的结果不受自磷酸化方向的影响，但基于几何考虑，我们假设它是不对称的[27,37].) 在休息的Ca²⁺浓度，根据我们的标准参数，初始的自磷酸化以平均每3.5小时一个非磷酸化环的速度发生，而进一步的磷酸化步骤大约每4分钟一个可用的“底物”亚基发生。我们假设PSD中的PP1分子可以去磷酸化PSD中任何全酶上的任何位点。此外，当激酶过度磷酸化时，PP1饱和[29].

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图1

CaMKII的自磷酸化和PP1饱和导致CaMKIL在静止钙时磷酸化状态的双稳态²⁺

（A） 第一亚基的磷酸化在静息钙时较慢²⁺因为需要两个Ca²⁺/钙调蛋白分子（见正文）。随后的磷酸化速度更快，因为只有一个钙²⁺/钙调素是必需的。

（B） 示意图显示了磷酸化和去磷酸化速率对磷酸化亚基数量的依赖如何产生双稳态。稳定状态位于两条曲线的左（向下）和右（向上）交点处。中间交叉点不稳定。稳定稳态和不稳定稳态之间阴影区域的面积越大，波动就越难破坏稳定稳态（它们的吸引域越大）。

（C） 2秒高钙脉冲²⁺在UP状态吸引域内，将系统（含16个全酶）从低磷酸化状态切换到高磷酸化状态（参见[D]）。磷酸化分数为服务提供商_总数/12N个_CaMK公司.

（D） Ca结束后²⁺脉冲，系统在UP状态下可能需要几十分钟才能达到动态平衡。

（E） UP状态在具有16种全酶的系统中稳定多年。

图1B示意性地指出了自磷酸化和去磷酸化的总速率是如何在静息钙中导致两种稳定状态的²⁺级别。图中的曲线显示了这些反应是如何随着磷酸化位点总数的变化而变化的。交叉点（去磷酸化平衡磷酸化）定义了三种稳定状态，其中左、右稳定，中间不稳定。如果系统的磷酸化被强制（通过瞬态信号或自发波动）远离一个稳定值，从而超过不稳定值，则可能发生切换；然后系统将落入第二个稳定点的吸引域。一旦进入这个盆地，系统的内在动力学就将漂移的时间尺度设定为第二个稳定状态。

本文提出的模型包括CaMKII全酶的随机周转，其平均寿命为30小时，与磷酸化水平无关，如实验确定的[35]. 我们假设，除非另有说明，一旦一种全酶被去除，它就会立即被一种未磷酸化的全酶取代。如果开关处于DOWN状态，新插入的全酶可能会停止：任何自发的磷酸化都会被去磷酸化所抵消，去磷酸化平均在大约5分钟内去除一个亚单位。然而，如果开关处于UP状态，磷酸酶被其他磷酸化全酶饱和，新插入的亚单位去磷酸化的平均时间几乎为1小时。因此，新插入全酶可以因碱性钙激活激酶而开启²⁺水平[28,29]，因为它被磷酸化的时间大大少于周转的时间。因此，交换机的UP状态是稳定的，尽管有周转。

根据中引用的参考，对模型参数进行了约束表1在约束允许变化范围的情况下，我们选择了参数值，以使系统具有双稳态，并具有近似相等的上升和下降状态寿命（见下文）。我们要求我们的标准体系具有相同数量的CaMKII全酶和PP1分子，因为已知它们的浓度相似，但调整了不太确定的希尔常数，Κ_上半年和Κ_氢气,最大化系统寿命（见下文）。虽然我们的模型对Κ_上半年与任何其他参数相比，当所有其他参数都固定时，双稳态仍然存在于一个显著的范围内（最佳值的10%左右）。其他参数的补偿共变保持了系统在固定钙离子下的双稳态Κ_上半年变化幅度超过三倍。我们的研究旨在测试一组貌似合理的动力学参数是否能够使分子开关（有少量参与分子）在波动情况下保持稳定。

表1

模型中使用的参数

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PKA、cAMP依赖性蛋白激酶

交换机的功能有两个关键要求。首先，初始（P0到P1）磷酸化步骤必须比进一步磷酸化步骤慢得多。这与Ca的Hill常数是一样的²⁺激活CaMKII[38,39]明显大于平均Ca²⁺生理静息状态下的浓度（本文大多数为0.7μM对0.1μM）。其次，磷酸酶活性必须饱和，因此在UP状态下每个磷酸化亚基的去磷酸化速率明显慢于在DOWN状态下。这是通过迈克尔斯常数实现的，Κ_M（M）,PP1的浓度远低于CaMKII亚基的浓度（本文中为0.4μM vs 400μM，尽管我们也使用Κ_M（M）10μM[40]). 因此，根据最新的实验数据，可以满足开关工作的两个关键要求。

图1C和​和1D1D（模拟了16种全酶）表明²⁺LTP诱导期间可能发生的类型提升[41]可以将系统从未磷酸化的DOWN状态切换到高度磷酸化的持续UP状态。即使在Ca之后，系统也会向UP状态漂移²⁺降至基本水平(图1D） ●●●●。这种漂移已在实验中观察到[42]. 在漂移期间（可能需要几十分钟），该系统更容易被解除警戒。在这个特殊的例子中（使用16种全酶），不到一小时就可以达到稳定的UP状态(图1D） ●●●●。如中所示图1E、 所产生的UP状态保持稳定至少10年。

基线状态和记忆状态之间的自发转换

我们研究了自发切换事件之间的时间分布，以衡量记忆存储的稳定性。图2A表明，一个含有八种全酶的小系统的总磷酸化水平仅在月的时间尺度上稳定，而不是年；偶尔，波动会导致系统从一种状态变为另一种状态，这可以从磷酸化水平的随机切换中看出。分析表明，处于DOWN或UP状态的时间（即寿命）呈指数分布(图2B） （除了短暂的过渡时间）。这样的指数分布[43]表示对于给定状态，单位时间内的转换概率为常数。寿命的指数分布有一个特征时间常数，它等于该状态下的平均寿命（以及单位时间内过渡概率的倒数）。

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图2

开关稳定性是上升和下降状态寿命之间的权衡

（A） 在具有八种CaMKII全酶的系统中，在向上和向下状态之间的自发切换。

（B） 切换事件之间的寿命分布是指数型的，正如在半对数尺度上拟合UP状态寿命的直线所示。

（C和D）去除一种PP1酶（七种而不是八种）（C）会导致UP状态的寿命更长，而DOWN状态的寿命更短；而添加一种PP1酶（九种而不是八种）（D）则产生相反的效果。

（E） UP状态（正方形）和DOWN状态（圆形）的平均寿命依赖于PP1酶的数量（八种CaMKII全酶）。蓝色填充符号对应于（A）、（C）和（D）中的数据点。线是近似的分析结果（基于材料和方法和[51]). 开关的最佳寿命由两条曲线的交点定义，在该交点处，UP和DOWN状态的寿命相等。蓝色表示参考参数。红色表示k个 ₁=0.75秒⁻¹，标准值的一半。寿命确实取决于动力学参数，但最大稳定性大致相同，尽管PP1分子的数量不同。

系统的整体稳定性取决于上升和下降状态的寿命。一般来说，系统中任何增加磷酸化速率的变化都会增加UP状态的寿命，同时减少DOWN状态的寿命。除磷速率的增加则相反。这两种状态的寿命之间的权衡可以通过改变系统中磷酸酶的数量来证明，而所有其他参数都是固定的。如中所示图2C、 磷酸酶数量的减少导致UP状态的寿命增加，但DOWN状态的不稳定；相反，增加磷酸酶的含量会产生相反的效果(图2D） ●●●●。图2E（蓝色）显示了400次转换的平均寿命，这是磷酸酶数量的函数。同样，UP态的寿命随着PP1分子的数量而缩短，而DOWN态的寿命则随着PP1的数量而增加。我们将“系统寿命”定义为两个寿命中较小的一个，因为我们假设突触的随机增强与随机去保持一样不受欢迎；任何一种状态的自发转变都会对记忆有害。因此，系统在两条曲线交叉处是最佳的(图2E） ，其中两个寿命相等（因此两个寿命都不太小）。这种最佳状态对应于磷酸化和去磷酸化过程之间的平衡。因此，我们将两条曲线交叉以达到平衡的磷酸酶浓度定义为最佳浓度。

在上述模拟中，我们将最佳磷酸酶浓度设置为等于CaMKII全酶的浓度（R.J.Colbran，个人通信；参见表1). 我们调整了约束较少的参数以实现这一点。为了了解系统的寿命对这些特定的选择有多敏感，我们用不同的激酶磷酸化速率常数值来模拟系统，改变k个 ₁从1.5秒开始⁻¹至0.75秒⁻¹.图2E（红色）表示最佳磷酸酶浓度也降低了，但在此浓度下，系统寿命仍与原始系统中的一样高（两条曲线的交点偏移，但仍保持相同的寿命）。我们还测试了系统对25倍更大值（10μM）的鲁棒性Κ_M（M）随着最佳磷酸酶浓度的增加，由20种全酶组成的系统在超过10年的时间内保持稳定。因此，实现长寿命并不需要特定水平的酶活性，但需要在磷酸化和去磷酸化速率之间保持适当的平衡。有关如何实现这一点，请参阅“讨论”。

稳定性随分子数指数增加

接下来，我们考虑了系统的寿命如何随着全酶的数量而变化（而PP1和系统的体积是成比例变化的）。图3A和​和3B三B显示了分别使用4个和16个全酶的模型切换行为。我们发现(图3C） 系统稳定性随全酶数量（即系统大小）呈指数增长。由于这种指数依赖性，PSD中每增加一个全酶，系统的寿命几乎会加倍。这些模拟表明，由四种全酶组成的开关只能在几天到几周内保持稳定，而将系统增加到16种全酶可能会导致开关在人类一生中保持稳定。

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图3

开关的稳定性随系统大小（CaMKII全酶和PP1分子的数量）呈指数增加

（A） 具有四种CaMKII全酶和四种PP1酶的系统中的自发转变。磷酸化部分为服务提供商_总数/12N个_CaMK公司.

（B） 含有16种全酶和16种PP1酶的系统，体积是（A）的四倍。注意（A）和（B）之间的不同时间刻度。磷酸化分数为服务提供商_总计/12N个_CaMK公司.

（C） 交换机的寿命随系统大小呈指数级增长。所有物种的数量与系统体积成比例。圆圈是数据点，直线是线性拟合，表示指数依赖性，因为纵坐标是对数刻度。红色星号表示我们明确包含PP1–I1P波动的数据点。

蛋白质周转限制记忆寿命

为了更深入地理解自发转换的原因，我们研究了转换事件发生前一段时间内，转换中发生了什么。中的两个示例图4A和​和4B4B表示在自发过渡到DOWN状态之前的时间内系统磷酸化的总瞬时水平(图4A代表四种全酶系统，图4B代表16）的系统。全息酶周转事件在这些痕迹中很明显，因为周转事件会导致磷酸化水平的突然下降（用红色箭头标记）。在图4A、 在向下转换事件发生前的3小时内发生了四次转换事件图4B、 在相同的时间内发生了六起营业额事件(t吨=−7 h至−4 h），之后内在动力学接管以完成向下过渡。根据每个全酶30小时的平均周转时间，在一个有四个全酶的系统中，预计每7.5小时就会发生一次周转事件，而在一个由16个全酶组成的系统中每1.9小时就会发生周转事件。因此，这些数据表明，如果营业额开始切换到DOWN状态（如下一页所述），那么在过渡之前的时期会发生大量的营业额事件。如此高的营业额是由营业额过程的随机性造成的，并且发生在我们检查的所有痕迹中的这种自发转变之前。因此，蛋白质周转，特别是其随机性，强烈影响系统存储信息的能力。

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图4

蛋白质周转率限制了系统的最大寿命，并导致能量消耗活动的最小速率

（A和B）在含有（A）四个CaMKII全酶和（B）16个CaMJII全酶的系统中，从向上状态过渡到向下状态期间总磷酸化的随机变化，周转事件用箭头标记。红色箭头表示周转事件，导致磷酸化水平突然下降。

（C） 具有八种CaMKII全酶系统的开关寿命与周转率的对数图（红色星号表示30小时周转，本文中用作标准）。

（D） 单个亚基环关闭的速率是打开的环总数的函数（此处显示的是具有八个CaMKII全酶的系统）。随着更多的环被打开，磷酸酶活性饱和，每个环的磷酸化平衡水平增加。因此，系统处于UP状态的环的关闭率接近周转率（虚线），因为PP1进行总环脱磷的概率变小。

（E） 当系统处于UP状态时，翻转（垂直实心黑线）和打开环（彩色阶梯线）之间的动态平衡。在第一次周转时，五个环已经被之前的周转脱磷了。该系统是稳定的，因为环打开的速率与磷酸化环的周转速率相匹配（每次周转事件都可能导致零个、一个或两个磷酸化环丢失）。显示了一个包含20个全酶的系统。

接下来我们研究了蛋白质周转率，ν_T型,影响开关的稳定性。我们发现，蛋白质周转率的增加对DOWN状态的寿命影响不大，但会显著缩短UP状态的寿命。同样，如果营业额负责启动系统中的向下切换，这也是可以预料的。由于当两个寿命相似时，系统是最优的，在一系列模拟中，我们使用不同的蛋白质周转率，我们还调整了PP1的量，以返回到最优系统（其中UP和DOWN状态寿命相似）。因此，我们可以在图4C开关的最佳寿命是蛋白质周转平均时间的函数。对于小于1个月的周转时间，最佳系统稳定性强烈依赖于周转率，这表明蛋白质周转是开关稳定性的限制因素。事实上，使周转率非常快（每小时）可能会导致系统失去所有双稳态。

在我们系统的UP状态下，蛋白质周转用未磷酸化的全酶取代磷酸化的酶，从而有效地起到磷酸酶的作用。因此，将这种有效的磷酸酶活性与磷酸酶本身产生的去磷酸化速率进行比较是很有意义的。我们通过计算单个磷酸化环关闭的总速率，即在P0状态下成为非磷酸化环。这种关闭率是周转率和磷酸酶脱磷率的总和。当环的开启和关闭速率远低于单个亚基磷酸化或去磷酸化的速率时，我们的近似计算是准确的，因为它假设一个环在关闭之前有时间达到所有磷酸化配置（参见材料和方法). 根据这个假设，我们得到了一个环在每个磷酸化构型上花费的时间比例。无磷酸化状态P0是一个环被关闭的状态，可以通过转换或从具有单一磷酸化位点P1的状态中去磷酸化来实现。因此，环路关闭的平均速率(图4D） 由提供ν _三 Ρ_{Ρ 1} + ν_T型,哪里ν _三是每磷酸化亚基磷酸酶活性的比率(ν _三属于方程式8),Ρ_{Ρ 1}是环在配置P1中花费的时间比例ν_T型是蛋白质周转率。注意，随着打开的环的数量增加，系统的总磷酸化增加，导致两者都增加ν _三和Ρ_{Ρ 1}减少。如中所示图4D、 当系统中超过一半的环打开时，环关闭的速率与周转率相同，ν_T型,自身（水平虚线图4D） ●●●●。因此，在30小时的周转率和磷酸酶的最佳浓度下，磷酸酶无法在UP状态下关闭环；磷酸化环的丢失纯粹是由于周转。

接下来，我们试图可视化系统如何保持在UP状态，即使在30小时内（平均），周转导致大约三分之二的磷酸化全酶被非磷酸化酶替换。在图4E、 我们提供了几个小时活动的快照，以显示单个环的周转和再磷酸化的时间过程。中的系统图4E含有20种全酶，因此UP状态在几十年内是稳定的。营业额事件用垂直线标记。变成磷酸化的非磷酸化环由彩色阶梯线表示，其中每一步都表示一个亚单位的磷酸化。应该注意的是，在任何时候，即使系统处于UP状态，由于之前的周转，许多环都是未磷酸化的。戒指的开启速率与戒指关闭的数量成正比。平均而言，开启的总速率与因周转而丢失的磷酸化戒指的速率相匹配。环的开启和周转之间的动态平衡决定了任何时候未磷酸化环的平均数量。在由20个全酶组成的系统中（因此有40个环），未磷酸化环的数量通常从4个到8个不等。数字是第一次换手事件之前的5图4E，在发生两次相邻的换手事件后，最多达到9次图4该图还说明了一旦一个亚基在一个环上磷酸化，其他亚基就会迅速跟进。

反应剂浓度波动的影响

在我们迄今为止的模拟中，我们没有考虑控制激酶和磷酸酶反应的信号通路中的噪声。仔细分析这个问题需要了解导致双向突触修饰的信号，并考虑降噪机制；两者都超出了本文的范围。然而，我们想确定我们所建模的开关是否能够在其输入中承受合理的噪声水平。在这类模型中，Ca中的反应速率是非线性的²⁺浓度，因此钙的波动²⁺浓度影响平均反应速率，并提供关于平均速率的额外噪音。此外，钙的功能依赖性²⁺并不是所有反应步骤都是一样的。尤其是钙的波动²⁺浓度增加了缓慢初始（P0到P1）磷酸化步骤的平均速率，这需要两个钙²⁺/钙调蛋白，在更大程度上比任何其他反应步骤。相对反应速率的变化意味着，原则上，足够大的波动可以完全破坏双稳态，无论系统大小如何。这类开关对钙没有绝对保护²⁺波动引起的，我们要求在我们的模型中Ca发生足够强烈的变化²⁺如LTP期间发生的，导致从DOWN（向下）状态切换到UP（向上）状态（参见图1C） ●●●●。然而，该系统应该对在没有LTP的情况下发生的较小的实际波动具有鲁棒性。图5A（蓝色方块）表明，具有我们的标准参数（但基线值较低，为0.07μM）的系统能够承受Ca可能引起的适度波动²⁺通过NMDA受体介导的通道流入（0.1μM振幅，100 ms衰减时间[44])由于自发突触前动作电位（0.5-Hz泊松序列），稳定性仅略有下降。虽然寿命随着系统尺寸的增加而增加的幅度小于没有波动的情况(图5A、 黑圈），外推表明，一个含有20个全酶的系统足以有100年的寿命。如果我们使用振幅为1.0μM的较大波动，调整参数以补偿波动产生的平均活性变化很重要。进行这种调整（参见材料和方法)游离Ca有1.0μM波动的系统²⁺浓度（衰减时间为100 ms，高于0.1-0.5赫兹泊松序列中的μM基线）比原始系统稍稳定，无Ca波动²⁺(图5A、 红色三角形）。我们得出结论，钙的合理水平²⁺棘的波动不一定会影响开关的稳定性。

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图5

游离钙浓度和酶总数存在自发波动时的开关稳定性

（A） Ca的作用²⁺稳定性（寿命）的波动与CaMKII全酶的数量有关。圆圈表示不含Ca的原始系统²⁺波动。正方形表示含有游离Ca的原始系统²⁺振幅波动0.1μM，基线波动0.07μM。三角形表示调整后的系统中含有游离Ca²⁺振幅波动1.0μM，基线波动0.1μM。调整后的系统具有替代参数，例如N个_{聚丙烯 1}=N个_CaMK公司/2,k个 ₁=6秒⁻¹,k个 ₂=7秒⁻¹、和K_{H（H） 1}=4.0微米。纵坐标是对数刻度。

（B） PP1分子数量波动对UP状态（正方形/实线）和DOWN状态（圆圈/虚线）寿命的影响（16种全酶）。abcisa上的时间刻度是PP1分子数量增加或减少1的平均时间。红色表示12<N个_{聚丙烯 1}< 20. 蓝色表示8<N个_{聚丙烯 1}< 24. 纵坐标是对数刻度。

（C） 全酶和PP1分子数量在各自范围内波动时，UP状态（正方形/实线）和DOWN状态（圆圈/虚线）的寿命14<N个_CaMK公司<18和8<N个_{聚丙烯 1}< 24. PP1波动的时间尺度沿abcisa变化。CaMKII波动的时间尺度由周转率（每全酶30小时）确定。纵坐标是对数刻度。

到目前为止，在我们的模拟中，我们假设酶分子的数量是固定的，但原则上，这些数量可能会随时间而波动，可能会影响稳定性。我们实施了几组模拟来解决这个问题。在每组中，我们对PP1波动的一系列时间尺度进行了大量模拟。具体来说，我们改变了PSD中PP1分子数量的随机步长加一或减一之间的平均时间，并将此时间绘制为x轴图5B和​和5C。5应该注意的是，系统偏离最佳状态的总时间通常是许多这样的时间步长的总和。在第一组模拟中，在CaMKII全酶数量保持不变的情况下，我们假设PP1分子的数量可能会波动正负25%，因此在16种全酶的特定情况下，PP1分子数量在12到20之间变化。中给出了UP和DOWN状态的使用寿命图5B为红色。寿命随着PP1变化之间的平均时间的增加而减少。这是因为缓慢的波动会导致系统在很长一段时间内远未达到最佳状态。相反，如果波动很快，即使系统暂时失去双稳态，系统也可能没有时间进行转换。尽管如此，即使每6小时改变一次，含有16种全酶的系统在超过20年的时间内保持稳定。第二，我们将PP1的波动幅度增加到正负50%（在这种情况下，是3倍的变化，从8到24）。模拟结果如下图5B（蓝色）表示波动幅度的增加会导致系统的平均寿命降低。同样，如果波动相对较快，则不会严重降低开关性能。值得注意的是，当PP1分子的数量在几十分钟的时间尺度内变化三倍时，开关寿命仍平均超过10年。第三，我们引入了CaMKII全酶数量的缓慢波动，假设全酶随机插入以及随机周转。由于去除时间标度设置为每全酶30小时[35]，平均插入速率是固定的（每30小时16个），以确保PSD内16个全酶的适当平均值。如上所述，模拟涵盖了PP1波动的一系列时间尺度，其数量可能在8到24之间变化。我们发现，全酶数量的变化比仅PP1的变化更有害。特别是，PSD中全酶的丢失会破坏UP状态。这是因为当全酶丢失时，开关大小的减小加剧了上述非最佳CaMKII与PP1比率的影响（参见。图3C） ●●●●。图5C表示当CaMKII全酶的数量在14到18之间变化时产生的寿命。如果没有PP1波动（相当于时间步长为零），DOWN状态几乎不会受到全酶数量缓慢波动（圆圈/虚线）的影响，但UP状态的稳定性大大降低（正方形/实线）。包括PP1的缓慢波动±50%可将“向上”和“向下”状态的寿命降低到10年以下。虽然平均20个全酶的系统会更稳定，但我们得出的结论是，在周转期间，从PSD中移除的全酶需要相对快速地更换，更换的时间尺度为分钟，而不是小时，以避免开关退化。此外，如果CaMKII没有锚定，但能够自由地扩散进出PSD，则存在的全酶数量的波动将增加，并且不可能实现双稳态[45,46].

讨论

本文考虑了基于PSD中CaMKII和PP1相互作用的双稳态开关的抗波动稳定性。尽管之前已经提出了这种开关的确定性模型[28,29]之前不可能定量评估开关用于长期信息存储的潜力，因为自发重置率未知。鉴于突触处的CaMKII分子数量较少[32]反应中的随机波动必然导致在某些时间尺度上的开关重置。我们的结果表明，这个时间尺度在很大程度上取决于组成开关的分子数量（参见图3C） ●●●●。事实上，这种依赖性是高度非线性的，与所涉及的分子数成指数关系。我们已经证明，当全酶的数量大于15时，这个时间尺度可以超过人类的寿命（参见图3B） ，前提是系统参数处于最佳范围。数量少得多的全酶，如四种，将导致一周时间尺度上的自发转换（参见图3A） ●●●●。一种有趣的可能性是，最初少量的CaMKII全酶足以在初始巩固期内即时存储信息，并且随着时间的推移[47,48]，大量的全酶在PSD处积累，从而形成更多的永久记忆（参见图3C） ●●●●。我们的一般结论是，相对较小的CaMKII分子群，如在PSD中发现的（平均为30个全酶），可以作为高度稳定的开关发挥作用，并可能在很长一段时间内辅助信息存储。

寿命对系统大小的指数依赖性与一般理论考虑一致[11]. 这是因为开关可以被描述为一个具有“双阱”有效势能的生化系统，其中两个极小值被一个屏障隔开。反应中的波动在势垒上产生噪声驱动的跳跃，其方式类似于在实际势垒上的热驱动跳跃[11,49,50,51]. 有效屏障高度与系统尺寸成正比[49]众所周知，在恒定噪声源的情况下，跨越障碍物的跃迁时间随障碍物高度呈指数增长[51,52]. 直观地，当临界数量的CaMKII环（与系统大小成比例）时，会触发从UP状态到DOWN状态的转换N个)同时进行脱磷。就概率而言N个与预期投币次数增加的效果相同吗N个排成一排，每个人都有一个概率第页= 1/2. 以下情况的概率N个连续的头是第页^N个，在此之前的预期时间（抛硬币次数）为（1/第页)^N个= 2^N个,随着N个类推，系统越大，CaMKII的环必须随机关闭而不恢复，才能在整个系统中引起切换。如果去磷酸化事件没有“连续”发生，在短时间间隔内关闭临界数量的CaMKII环，则相反的反应（自动磷酸化）有时间抵消并打开环，允许自然动力学将系统驱动回UP平衡状态。

另一项发现是CaMKII的分子转换强烈限制了开关的稳定性（参见图4). 如果没有营业额，则开关稳定性可能会更高一个数量级（参见图4C） ●●●●。我们的分析显示了磷酸酶和激酶活性的速率与蛋白质周转速率之间的一组有趣的关系，它们对开关稳定性的影响。原则上，按比例降低基础磷酸酶和激酶的比率可以提高开关的稳定性。这种降低脱磷率的方法还有另一个可取的特点，即降低能耗。这是因为UP状态由生化学家所称的“无效循环”组成，其中ATP利用磷酸化的速率等于去磷酸化速率。尽管最小化能量利用率要求系统“冷却”（降低磷酸酶和激酶速率），但我们的结果表明，冷却的有效程度是有限制的，这一限制是由蛋白质周转率决定的。具体地说，如果冷却使磷酸酶和激酶速率过低，系统在分子转换事件后无法恢复稳定值（新插入的未磷酸化的激酶分子不会像在图4E） ●●●●。在这种情况下，未磷酸化的激酶分子将积累，无情地接近重置为DOWN状态的阈值。

我们的结果表明，开关的稳定性敏感地取决于磷酸化和去磷酸化速率的平衡。因此，我们评估了PP1与CaMKII比率的变化如何影响开关状态的寿命（参见图2E） ●●●●。我们发现，在数十分钟的时间尺度上，比率的短期波动不会显著降低开关性能（参见图5B） ●●●●。缓慢的波动更有害，尤其是当CaMKII全酶的数量过低时，UP状态的稳定性会受到影响（参见图5C） ●●●●。与对短期波动的稳健性相比，我们的系统要求活动的长期平均比率受到限制（参见图2E） ●●●●。因此，如果所有其他参数和浓度都是固定的，那么PP1分子与CaMKII分子的数量之比应该处于一个较窄的最佳范围内（参见图2E） ●●●●。因此，有兴趣了解是否存在特殊机制来长期稳定PP1与CaMKII的比率。促进PP1与CaMKII的必要固定比率可能是在PSD结构中保持CaMKIL和PP1的支架蛋白的功能之一[53,54,55,56,57,58]. 此外，我们的结果（参见图5A） 表明钙含量适中²⁺短期内波动是可以容忍的，但我们发现长期内必须严格控制平均水平（控制在几个百分点以内；数据未显示）。由于激酶活性取决于游离钙调素的水平，因此可以进一步预计，游离钙调蛋白在长时间内受到调节。这可能是已知钙调素缓冲液的一个重要功能[59,60]. 如果没有控制机构，开关的稳定性将大大降低。

我们的研究有几个局限性值得注意。当我们讨论钙的影响时²⁺波动（参见图5A） ，我们没有包括Ca的详细反应步骤²⁺在我们的模型中与钙调蛋白结合，但使用了基于Ca的反应速率的稳态值²⁺/钙调素。在浓度快速变化期间，可能无法达到这些稳态速率。因此，磷酸化率可能不随钙变化²⁺正如我们所建模的那样，在这种情况下，必须改变其他参数或浓度，以保持最佳系统。然而，包括钙调素结合步骤，并消除自由利用的过量钙调素的假设，将减少游离钙急剧短暂升高的影响²⁺因此，钙的流入²⁺导致LTP可能大于此处显示的值（参见图1C） ，并且系统可以稳定到更大的Ca²⁺波动比我们包括的波动要大。自发钙的定量测量²⁺需要体内波动来评估开关稳定性是否对实际波动具有鲁棒性。我们所做的第二种简化可能会导致低估稳定性。我们假设在PSD中结合的CaMKII分子以在自由溶液中测得的相同动力学常数运行。然而，PSD中的部分或全部CaMKII可能与NMDA受体结合[61,62]. 这种结合增加了第一位点的自磷酸化速率，使其仅与一个钙调蛋白结合而不是两个。如果这种与NMDA受体的结合仅在LTP事件发生后才显著发生，当系统处于UP状态时，蛋白质周转的影响将减少，因为在整个系统有时间切换到DOWN状态之前，未磷酸化的环将迅速磷酸化。

虽然我们所描述的开关可能在人类一生中都是稳定的，但长期信息存储可能不需要如此大的稳定性。一种可能性是，这种长期稳定性不仅仅是开关的特性，而是开关与由记忆特异性突触连接创建的吸引子网络之间的相互作用产生的。根据这个想法[47,48]，吸引子的重新激活，可能在睡眠期间，通过将开关设置回正确的状态，可以刷新记忆。对于这样一个系统的工作，平均开关稳定性只需要大于吸引子重新激活之间的时间。在记忆的早期阶段，当巩固很重要时，这种重新激活似乎很重要[47,63]. 然而，我们对此类再活化过程的发生频率知之甚少。此外，在初始巩固后，重新激活在长期维持记忆痕迹中的作用仍不清楚。这方面的进展将加强我们对决定大脑记忆整体稳定性的分子和网络特性相互作用的理解。

材料和方法

模型

我们将CaMKII六个亚单位的每个环视为一个独立的实体[37,64,65,66]. 每个亚单位可以处于两种状态之一：磷酸化或未磷酸化。六个亚基之间的一组可能的构型导致一个环有14种可区分的状态，这里用磷酸化亚基的数量标记：P0、P1、P2（P2有三种构型，因为两个磷酸化亚单位可以相邻，也可以被一个或两个非磷酸化亚单元分开），P3（四种配置）、P4（三种配置）、P5和P6。不同的构型具有不同的多重性，在计算改变构型的反应速率时计算这些多重性。环的第一个亚基（P0到P1）的磷酸化需要两个激活的钙调素结合，因此在静息钙时速度较慢²⁺浓度（参见图1A） ●●●●。一旦单个亚单位被磷酸化，它可以定向催化相邻亚单位的磷酸化[27]从而使静息钙的进一步磷酸化步骤更快²⁺浓度（参见图1A） ●●●●。我们将处于非磷酸化状态的环P0称为关闭，将具有任何其他磷酸化水平的环称为开启。一旦环开启，我们就不会在计算中包括该环的进一步缓慢步骤，因为更快的定向步骤占主导地位。

取三的Hill系数[40,67]，对于每个亚单位的初始磷酸化率：

以及顺时针相邻亚基的磷酸化：

通过Michaelis–Menten方案进行去磷酸化：

以迈克尔常数，，以及其中服务提供商表示磷酸化亚基，而S公司表示未磷酸化的。在这里的模拟中，我们假设k个 ₊=k个 ₂/K_M（M）并设置k个 ₋到零，但我们发现结果不受以下相对值的显著影响k个 ₋和k个 ₊在固定的k个 ₂和K_M（M）.

磷酸化抑制剂-1（I1P）是一种非竞争性拮抗剂，可使磷酸酶失活[68,69,70]. 我们遵循Zhabotinsky的公式[28]，假设PSD中的自由抑制剂-1（I1）水平恒定（0.1μM），这是由于I1与较大细胞体积的自由交换。这种与较大细胞的自由交换很重要，因为PSD中的自由I1分子数量平均少于一个。甚至脊椎本身所含的I1分子也比PSD中的PP1分子少。然而，PP1与抑制剂的快速和强烈结合意味着PSD充当自由I1的汇，PSD中所有I1的总浓度显著大于自由I1。重要的是，PSD和脊椎体积之间的I1交换变化很快，脊椎和母体树突之间的τ≤1s，这一时间尺度比磷酸酶和激酶反应的时间尺度快得多。

I1被cAMP依赖性蛋白激酶磷酸化，被钙调神经磷酸酶去磷酸化²⁺，希尔系数为3[71]因为钙调神经磷酸酶需要钙²⁺/激活钙调素。因此，I1的磷酸化程度较低，磷酸酶在较高Ca下的抑制程度较低²⁺浓度。这些反应步骤（由Zhabotinsky建模[28])假设速度很快，因此我们可以将游离I1P浓度的稳定水平记为

以及分数，（f）_{e（电子）},磷酸酶不含抑制剂，因此具有活性

具有K_我=k ₄ /k _三.

在这里介绍的大多数结果中，我们没有随机模拟磷酸酶抑制反应。由于反应发生的时间比其他反应步骤快，我们可以使用准静态假设，只使用其平衡值[72]. 我们确实通过进行模拟来测试这个假设，模拟中包括了I1磷酸化的随机步骤（而不是方程式4)抑制PP1（而不是方程式5). 模拟这样的快速过程（比其他反应快两到三个数量级）意味着每单位时间的反应总数会大幅增加，因此所需的计算机时间也会相应增加。我们测试的三个系统的结果（中的红色星号图3C） 与没有如此快速波动的结果没有显著差异。因此，我们有信心使用其他数据点的平衡值。

营业额以一定的速度出现，ν_T型,和作用相当于非饱和脱磷酸化过程，因为我们假设所有的全酶都被未磷酸化的酶取代，并且任何附着的PP1都被释放回系统。

可以进行分析计算ν _三PP1对每个磷酸化亚基的脱磷酸速率。请注意，从图1B、 我们需要ν _三在高磷酸化时降低，以便单位时间内脱磷亚基的总浓度，ν _三·[服务提供商_总数]饱和（我们已经写出了磷酸化亚基的总浓度[服务提供商_总数] = [服务提供商] + [聚丙烯1服务提供商]). 在右侧写下除磷速率方程式3作为ν _三·[服务提供商_总数]，我们假设中间产物[聚丙烯1服务提供商]，处于稳定状态。我们合并方程式3用另外两种方法[聚丙烯1服务提供商]可以更改。也就是说，非竞争性抑制导致反应

而人员流动导致

所以我们计算了有效的脱磷速率常数，ν _三，来自ν _三·[服务提供商_总数] =k个 ₂[聚丙烯1服务提供商]假设d日[聚丙烯1服务提供商]/日期=0.结果是，写入[E类 ₀] =N个_{聚丙烯 1} N个_A类/体积，

其中磷酸化亚基的浓度不含磷酸酶[服务提供商]，由给出

正如预期的那样，ν _三，显著减少[服务提供商_总数] >K_M（M）这样，在UP状态下，总的磷酸化是一个常量（请参见图1B） ●●●●。在可忽略的磷酸化限度内，,方程式9简化以提供

因此，从方程式8,

在高磷酸化限度内（其中),方程式9成为

导致

我们的推导不同于标准的Michaelis–Menten方法，因为我们不能假设任何时候，所以[服务提供商] ≠ [服务提供商_总数].

蒙特卡罗模拟

我们对该模型进行了蒙特卡罗模拟，其中计算了CaMKII全酶的所有微观结构，并将这些状态之间的化学反应模拟为随机马尔可夫过程。我们使用了Gillespie的算法[51,73]，可以概括如下。我们确定了环的所有可能构型。总共有56个，因为对于给定数量的配置，编号：，在磷酸基团中，PP1结合的数量可以从0到n个（假设n个<N个_{聚丙烯 1}). 因此，对于磷酸基团的14种构型中的每一种，包括酶在内的构型数量乘以n个+1.例如，一个含有两个磷酸化亚基（P2）的环可以连接多达两个PP1酶。由于环上的两个磷酸化亚基有三种可区分的构型，并且每个构型可以连接零个、一个或两个PP1酶，因此我们包括P2的九种不同构型。我们有以下数量的配置：P0（1）、P1（1×2）、P2（3×3）、P3（4×4）、P4（3×5）、P5（1×6）和P6（1×7），总共得到56个。我们没有明确计算PP1与磷酸基团结合的不同相对位置，而只是在去磷酸化发生时随机选择一个磷酸化亚基。

在任何时间点，系统处于由每个配置中的环数定义的状态，表示为{N个_我},我= 1, 2,…, 56. 每个配置中的环数{N个_我}确定每个可能反应步骤的速率{第页_j个}. 反应步骤将一个环从56种构型中的一种转变为另一种构型。由于三种类型的反应步骤（磷酸化、PP1结合或去磷酸化）可以从大多数配置中发生，因此该系统总共有144个可区分的反应步骤。然而，在任何特定情况下，大多数利率都为零。蛋白质周转和其他过程一样是随机处理的。周转导致两个随机选择的环（即一个全酶）被两个处于P0状态（完全未磷酸化）的环所取代。

模拟背后的基本假设是，任何特定速率，第页_j个(t吨)，仅取决于当前配置，而不取决于系统的历史记录。这使得反应方案成为马尔可夫过程。处理少量分子时所需的关键步骤是回忆一下，确定性速率是随机过程的宏观平均值，即概率，P（P）_j个日期反应步骤的j个在很短的时间间隔内，日期，由提供

也就是说，速率只是单位时间内发生的概率，并且，考虑到马尔可夫假设，我们现在有一个泊松过程。

Gillespie的算法首先将所有反应步骤的速率相加，得到平均速率，对_T型,对于配置的任何更改：

反应步骤之前经过的时间分布遵循指数衰减，

这是一个标准结果，很容易验证，因为它满足了必要的要求：

也就是说，反应在时间步长上的概率τ到τ+dτ等于对(τ)dτ乘以之前未发生反应的概率τ.

一旦随机选择了下一个反应步骤的时间，就要进行第二次随机选择，以决定发生哪种特定反应。相对概率，第页_j个，每一个反应步骤都与它们的速率成正比，第页_j个=第页_j个/对_T型.

给定下一反应步骤的时间和类型，系统的总时间提前了τ和数量{N个_我}在相关配置中，更新了受影响反应步骤的反应速率。这个过程现在以一组新的反应速率重复。对总磷酸化进行监控，并根据平衡值设置用于确定切换到UP状态或切换到DOWN状态的阈值，但通常，如果总磷酸化低于10%，我们会记录到DOWN状态的过渡，如果它自发上升到70%，我们记录向UP状态的转换。需要注意的是，系统在向上和向下状态之间切换所需的时间是小时的数量级，这使得在实际系统处于“过渡”时高估了状态的寿命。然而，这种小时数量级的误差是微不足道的（与典型平均寿命的许多年相比）除了这里介绍的最不稳定的系统。

模拟从0%或100%磷酸化开始，但在很短的时间内（至少与UP和DOWN状态的寿命相比），系统分别接近UP或DOWN的平衡值。

关断率计算

我们将处于非磷酸化状态的环P0定义为关闭，将任何亚基磷酸化的环定义为打开。我们通过假设系统中所有打开的环在环的打开和关闭事件之间的时间内达到磷酸化水平的动态平衡来计算环关闭的速率。当单个亚单位的磷酸化和去磷酸化速率比环的开启和关闭速率快得多时，这种近似称为时间尺度分离是有效的（如图4E） ●●●●。

对于给定的总磷酸化量，我们确切地知道磷酸酶的平均活性。知道这一活动意味着可以计算出所有反应的平均速率。不同的平均速率决定了全酶从一种构型到另一种构型的变化速率，因此了解平均速率可以从数字上获得相对时间量，Ρ_我,在每个配置中花费，我因此，我们可以计算系统何时具有给定的总磷酸化水平，服务提供商_总数每个环的平均磷酸化水平是多少，，其中P（P）_我是构型的磷酸化我.磷酸化的总水平，服务提供商_总数，当给定数量的环打开时，N个_在,由提供

自服务提供商_总数与…成比例P（P）_{av（平均值）}和P（P）_{av（平均值）}取决于服务提供商_总数，我们对方程进行迭代，以找到服务提供商_总数和P（P）_{av（平均值）}对于的每个值N个_在.

要查找每个环的关闭速率，请参见图4D、 对于每个打开的环数，总磷酸化，服务提供商_总数,按上述计算。的价值服务提供商_总数确定每个亚单位的磷酸酶活性，ν _三，这会影响环在每个配置中花费的时间比例。值得注意的是ν _三就是说，环上的磷酸化程度越高Ρ_{P（P） 1}.关闭戒指的比率是周转率的总和，ν_T型以及PP1对只有一个磷酸化亚基的全酶的去磷酸化速率，ν_三Ρ_{P（P） 1}.

钙²⁺流入和波动

对于LTP诱导协议，我们使用Ca突发²⁺由Ca的泊松序列构成的流入²⁺100 Hz时的脉冲。每个脉冲都是0.1-μM阶跃增加，然后是游离钙的100ms指数衰减²⁺浓度。

背景钙的影响研究²⁺波动，我们假设Ca²⁺通过NMDA受体的进入是一个随机泊松序列，平均速率为0.5 Hz。我们为每个Ca建模²⁺流入为0.1或1.0μM的阶跃上升，随后是100 ms时间常数的指数衰减([44]，假设膜电位为-50 mV，脊椎体积为0.1μm^三; 峰值[Ca²⁺]每突触前峰上升0.14μM）。我们降低了钙的基本水平²⁺0.1至0.07μM-μM振幅模拟，保持所有其他参数不变，以保持磷酸化和去磷酸化速率之间的近似平衡。我们假设突触前神经元的不应期为2ms，因此没有两个Ca²⁺流入发生在如此短的间隔内（因此Ca列²⁺输入并非完全泊松，但包括2-ms的负相关）。

如果涨落幅度太大（例如，如果在这种情况下，涨落幅度是0.1μM到0.2μM的两倍），并且模型参数是固定的，则双稳态完全丧失，因为涨落实际上改变了反应步骤的平均有效动力学速率，并使其超出了系统双稳态的范围。因此，在振幅为1.0μM的模拟中，我们保持了基本Ca²⁺0.1μM的水平并调整其他参数（参见图例图5)保持不同反应速率之间的适当平衡。例如，我们包括一个更高的Κ_{H（H） 1}以保持初始磷酸化步骤的低速率。在替代参数下，只有当Ca²⁺存在波动。

注意游离Ca的数量²⁺PSD中的离子平均少于一个。然而，Ca²⁺通过Ca作用²⁺-结合钙调素（浓度较高），以及两种游离钙的交换²⁺突触后密度和脊椎之间的钙调素比这里考虑的波动和典型的CaMKII反应步骤都要快得多。因此，我们可以忽略这种强烈但快速的“爆炸”噪音。游离钙的交换²⁺或者树突轴和脊椎之间的钙调蛋白会引起显著的额外波动，但前提是它的时间尺度比钙之间的解离步骤慢²⁺和钙调蛋白，或Ca²⁺/钙调素和CaMKII。未来的工作，包括这些特定的结合反应步骤[74]有必要更准确地阐明钙的动力学效应²⁺系统上的更改。

参数

标准系统的参数如所示表1在一个参数变化的图形中，除非另有说明，否则所有其他参数均根据表格固定。全酶数量变化的数字还包括按比例变化的体积和磷酸酶数量，以保持固定的浓度。PP1的标准浓度等于CaMKII全酶的标准浓度，为20分子/10⁶纳米^三或33μM。我们拥有20个全酶的最大系统略小于30个全酶平均突触[32]. 因此，体积小于平均值，对应于直径为250 nm的圆柱形PSD（相比之下，平均直径为350 nm[32])假设全酶主要位于厚度略大于20nm的单层中，则体积为10⁶纳米^三用于反应域。

对于表中没有实验参考的那些参数，我们选择了在合理范围内的值，给出了类似化学反应的值。我们选择了适合我们系统的简单值。例如，低迈克尔斯常数是有益的，因为双稳态的范围增加了[28]. 通常，在不改变其他参数的情况下，任何一个参数的变化都会产生如所示的效果图2，其中磷酸酶的数量是不同的。例如，如果钙调神经磷酸酶的活性较高（例如，给予ν _钙N个=2.0而不是ν _钙N个=1.0），则I1P的量减半，未受抑制的PP1的量增加。因此，UP状态的稳定性降低，而DOWN状态的稳定性增加。然而，PP1总浓度较低的系统将与原始系统一样工作。因此，修改单个参数确实会降低系统性能，从而缩短一种状态相对于另一种状态的寿命。然而，如果细胞能够将物种浓度保持在由参数实际值确定的最佳范围内，则可以获得此处显示的最佳结果（参见[28]).

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