血清反应因子（SRF）是一种MADS-box转录因子，通过结合保守的DNA序列[CC（a/T）]调节参与细胞增殖、迁移、细胞骨架动力学和肌生成的基因6GG]，称为CArG盒或血清反应元件(20). SRF区分不同靶基因的能力取决于其他转录因子结合位点的存在和CArG盒的数量，以及SRF与过多辅因子的关联，其中许多辅因子是细胞类型特异性和信号反应性的(4,7,8; 参考文献中审查31).
已知至少有两条信号通路调节SRF活性，一条涉及Ets结构域家族三元复合因子（TCF）的磷酸化，另一条受Rho家族小GTPase和肌动蛋白动力学控制(9,11,13,14,22,29). TCF通过丝裂原活化蛋白激酶信号转导的磷酸化促进其与SRF在CArG盒附近含有TCF结合位点的靶基因上的关联(14). TCF与SRF的结合可以刺激或抑制SRF活性，这取决于启动子(14,22,35). 相反，SRF靶基因对Rho信号的激活依赖于肌动蛋白聚合，并通过TCF非依赖性机制发生(11,13,29).
肌钙蛋白和肌钙蛋白相关转录因子（MRTFs）MRTF-A（MAL/MKL1）和MRTF-B（MKL2）组成一个转录辅激活子家族，与SRF相关并刺激SRF-依赖性转录(5,12,21,32,33; 参考文献中回顾6和34). 肌球蛋白在心脏和平滑肌细胞中特异表达，对于激活依赖SRF的平滑肌基因是充分和必要的(10,16,32,36). 相反，MRTF在广泛的细胞类型中表达，并调节许多参与细胞增殖和迁移的基因(5,12,27,28,33).
SRF活性对肌动蛋白聚合状态非常敏感。G-肌动蛋白单体抑制SRF活性，而肌动蛋白聚合对血清刺激和RhoA信号的反应通过耗尽抑制性G-肌动蛋白的细胞池刺激SRF活性(9,13,25,29). 最近，MRTF-A/MAL被证明与G-actin相关，导致其在NIH 3T3细胞的细胞质中隔离。血清刺激和Rho信号传导导致MRTF-A易位到细胞核和SRF靶基因的激活(21).
RhoA信号与平滑肌、心肌和骨骼肌细胞的分化以及心肌细胞肥大有关(1,2,10,17,18,26,30,37,38). 显性负性RhoA可以减少肌源性分化，而激活的RhoA则可以促进肌细胞分化和生长(30,38). Rho效应器p160 Rho激酶/ROCK和肌动蛋白跑步机对平滑肌细胞分化是必要的(17,18)和RhoA信号已被证明诱导MRTF-A在平滑肌细胞中的核输入，从而触发平滑肌基因激活(10).
我们描述了一种肌动蛋白结合蛋白，命名为Rho信号的横纹肌激活物（STARS），它在心肌和骨骼肌中特异表达(三). STARS通过涉及肌动蛋白聚合和Rho激活的机制刺激SRF依赖性转录，但STARS激活SRF依赖转录的确切分子机制尚未明确。鉴于最近的证据表明MRTF-A可以在Rho信号的作用下转位到细胞核，我们研究了MRTF-A-或-B是否可能是STARS和SRF之间的联系。在这里，我们表明STARS通过需要Rho-actin信号的机制诱导MRTF-A和-B的核积累并刺激SRF-依赖性转录。这些发现揭示了肌动蛋白动力学与SRF依赖性转录相关的肌肉特异性信号机制，并对理解发育和疾病期间肌肉基因表达的调控具有意义。
材料和方法
质粒。
前面描述了编码STARS、MRTF-A和-B、显性阴性心肌蛋白和C3转移酶的表达载体(三,32,33). MRTF-A和-B的N-末端缺失突变体缺乏RPEL结构域，分别始于氨基酸92和152。荧光素酶报告质粒含有SM22型启动子和串联副本SM22型先前报道过CArG（4×SM22-CArG-荧光素酶）(15). 野生型β-肌动蛋白（pEF-FLAG-actin）及其突变衍生物肌动蛋白R62D和S14C的表达载体由R.Treisman善意提供，如前所述(25).
细胞培养和转染。
NIH 3T3细胞在含有10%小牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中生长，COS1、293T和HeLa细胞在含有10%胎牛血清的DMEM中生长。根据制造商的说明，使用Fugene（Roche）进行转染。对于免疫细胞化学，在转染后12小时，将接种在6孔培养皿中的玻璃盖玻片上的细胞转移到没有血清的DMEM。20小时后，用20%胎牛血清刺激细胞，并进行免疫细胞化学。除非另有说明，否则使用500 ng的每个质粒。对于荧光素酶分析，转染12小时后，将在12孔培养皿中生长的细胞转移到无血清的DMEM。两天后，对细胞进行裂解并检测报告基因的表达。除非另有说明，否则使用200 ng荧光素酶报告质粒和100 ng每个表达质粒。通过添加不含cDNA插入的表达载体，每个孔的DNA总量保持不变。RSV发起人驱动lacZ公司所有转染均包含表达质粒作为内部对照。在转染后12 h添加细胞分裂素D（CD；1μM）（Sigma-Aldrich）和latrunculin B（LB；0.5μM），并向对照孔添加10%乙醇（最终浓度，0.01%）。
用含20%胎牛血清的DMEM维持C2C12小鼠成肌细胞系。用含2%马血清的DMEM替代培养基，在12孔培养皿中以约90%的汇合率培养C2C12细胞，诱导分化。如前所述，进行初级新生大鼠心室肌细胞培养(三).
荧光素酶分析。
按照制造商的说明采集细胞，并测量荧光素酶和对照β-半乳糖苷酶的活性（Promega）。所有化验至少进行两次，每次化验三次。
免疫细胞化学。
用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞，用4%甲醛固定10分钟，用0.1%Triton X-100在PBS中渗透5分钟。细胞在室温下在PBS的3%牛血清白蛋白中封闭30分钟。然后在室温下用PBS中3%牛血清白蛋白稀释的一级抗体培养细胞60分钟。使用抗-Myc多克隆抗体（1:200；Santa Cruz）和抗FLAG M2单克隆抗体（1:1000；Sigma-Aldrich）。二级抗体是兔抗小鼠免疫球蛋白G异硫氰酸荧光素或德克萨斯红（Vector Lab），以1:200的稀释度使用。采用含有DAPI（4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚）（载体）的Vectashield培养基进行安装。
免疫沉淀和免疫印迹。
为了进行免疫沉淀，293T细胞生长在6厘米直径的培养皿中，并使用Fugene转染几种表达载体。转染后24小时，用无血清DMEM替换培养基，并继续维持24小时。然后用冰镇磷酸盐缓冲液冲洗细胞一次，并在1ml免疫沉淀缓冲液中溶解（PBS含有1%Triton X-100、1mM苯甲基磺酰氟和从Sigma购买的蛋白酶抑制剂混合物）。对裂解产物进行超声处理，并通过离心进行清除。用1μl抗FLAG抗体（M2；Sigma）和蛋白G-Sepharose（Zymed）免疫沉淀FLAG-MRTF-A、FLAG-MRFT-B或FLAG-β-actin。用免疫沉淀缓冲液清洗珠子三次，蛋白质在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上溶解。用抗Myc（1:2000稀释；Santa Cruz）、抗肌动蛋白（1:500稀释；Chemicon）或抗FLAG抗体（1:5000稀释）和1:5000稀释的辣根结合二级抗体对蛋白质进行免疫印迹。用Western blotting luminol试剂（Santa Cruz）观察信号。
在HeLa细胞中进行STARS表达分析时，将细胞溶解在100μl免疫沉淀缓冲液中。用抗Myc或抗α-微管蛋白（Sigma）抗体对20微升的裂解物进行免疫印迹。
RNA干扰。
为了对STARS进行RNA干扰分析，合成了一个21-核苷酸小干扰RNA（siRNA）双链，其中两个脱氧胸苷碱基为3′末端，对应于STARS特异序列5′-CCA GGT TAC TTT CGG AGA a-3′。BLOCK-iT荧光寡核苷酸（Invitrogen）用作非特异性对照。对于荧光素酶测定，在DMEM中的未分化C2C12细胞中进行100pmol的siRNA和500ng的4×SM22-CArG荧光素酶报告质粒的转染，DMEM具有60%汇合的20%胎牛血清，Fugene诱导分化2天后分化C2C12细胞或新生大鼠原代心室肌细胞。呼吸道合胞病毒启动子驱动lacZ公司所有转染均包含表达质粒作为内部对照。转染后60 h收集细胞进行荧光素酶检测。为了验证siRNA-介导的STARS表达敲除的效率，将含有10%胎牛血清的DMEM保存在六孔培养皿中的HeLa细胞转染100 ng myc-STARS表达载体和200 pmol siRNA。转染48 h后采集细胞进行Western blot分析。
结果
STARS通过MRTF激活SRF。
鉴于肌动蛋白动力学在SRF活性控制中的作用以及MRTF-A作为Rho-actin信号转导至SRF的最新研究，我们研究了肌肉特异性肌动蛋白结合蛋白STARS和RhoA及SRF激活剂(三)，可能通过MRTF刺激SRF活性。如图所示。、STARS和MRTF-A或-B协同激活由SM22型启动子，包含一对SRF结合位点(15)，在缺乏血清的NIH 3T3细胞中。相反，STARS并没有增强不同量心肌蛋白的转录活性（图。). 的响应能力SM22型当两个SRF结合位点突变时，STARS和MRTFs的启动子被取消（图。). STARS还增强了MRTF-A和-B在一个报告质粒上的转录活性，该报告质粒含有来自SM22型发起人和Elb（Elb）最小启动子（图。). 因此，CArG盒对于STARS和MRTF的协同转录活性是必要的和充分的。STARS和MRTFs的协同激活也在其他类型的细胞中观察到，包括COS1和293T细胞（图。).
STARS刺激MRTF活性。nsrsid4287733\delrsid4287733如材料和方法中所述，用编码STARS、MRTF-A（20 ng）、MRTF-B（100 ng）或心肌蛋白（10 ng）和SM22-荧光素酶（A、B和C）或4×CArG-荧光素酶（D）的表达载体瞬时转染NIH 3T3细胞。（B） 用编码STARS（10、50和100 ng）和MRTF-A（20 ng）或MRTF-B（100 ng）的表达载体转染细胞。（C） 用指定剂量的表达载体转染细胞，表达载体编码含有STARS的心肌蛋白（100 ng）。值表示为激活级别(n个-fold）荧光素酶表达高于报告基因水平±标准偏差（误差条）。如上所述，用编码STARS、MRTF-A或MRTF-B和SM22-荧光素酶的表达载体瞬时转染COS1（E）和293T（F）细胞。值表示为激活级别(n个-fold）荧光素酶表达高于报告基因水平±标准偏差（误差条）。
STARS模拟MRTF的核移位。
与以前的报告一致(10,21)在没有血清的情况下，MRTF-A主要定位于NIH 3T3细胞的细胞质中，并在血清刺激下积聚在细胞核中（图。). 尽管MRTF-B对血清的反应不如MRTF-A（图。). 无论是否有血清，肌球蛋白主要定位于NIH 3T3细胞的细胞核（图。).
响应STARS的MRTF的核易位。（A）在存在或不存在20%血清的情况下，用编码FLAG标记的MRTF或肌苷的表达载体瞬时转染NIH 3T3细胞。在底部面板中，用编码MRTFs、心肌蛋白和STARS的表达载体转染无血清的细胞。通过FLAG表位的免疫染色来确定MRTF和肌苷的亚细胞分布。（B） 在有或无20%血清或STARS的情况下，测定A组细胞核中含有MRTFs或心肌蛋白的转染细胞的百分比。在每种条件下，至少对150个转染细胞进行计数。数值为平均值±标准偏差（误差线）。（C） 用编码STARS或显性阴性（DN）心肌蛋白和SM22荧光素酶的表达载体瞬时转染NIH 3T3、COS1和293T细胞，如材料和方法中所述。数值表示为荧光素酶表达激活水平高于报告基因单独水平±标准偏差（误差线）。（D） 如图所示，在有或无20%血清的情况下，用编码缺乏N末端RPEL结构域的FLAG标记MRTF突变体的表达载体瞬时转染NIH 3T3细胞。通过FLAG表位的免疫染色确定ΔN-MRTFs的亚细胞分布。（E） 如图所示，用编码MRTFs或ΔN-MRTFs的表达载体瞬时转染NIH 3T3细胞，该表达载体带有或不带有STARS和SM22-荧光素酶。数值表示为荧光素酶表达激活水平高于报告基因单独水平±标准偏差（误差线）。
在与编码MRTFs和STARS的表达质粒共同转染的NIH 3T3细胞中，MRTFs在没有血清的情况下移位到细胞核（图。). 无STARS或有STARS时，心肌细胞核定位不变。因此，STARS可以替代血清刺激，促进MRTFs的核移位，从而激活SRF依赖性转录。
为了证实MRTFs介导STARS活性以诱导SRF依赖性转录，我们接下来将STARS与一个显性阴性心肌蛋白突变体共表达，该突变体可以抑制多种细胞类型中心肌蛋白和MRTF-a和-B的转录活性。如图所示。在NIH 3T3、COS1和293T细胞中，显性负性心肌蛋白完全阻断STARS诱导SRF依赖性转录的能力（图。). 显性负性心肌蛋白也抑制NIH 3T3细胞中STARS和MRTFs的协同活性（数据未显示）。STARS并没有改变MRTFs的表达水平，这表明STARS仅通过促进MRTF-A和-B的核移位来刺激SRF依赖性转录。
据报道，MRTF-A的N末端区域可将MRTF-A隔离在血清缺乏的NIH 3T3细胞的细胞质中(21). 因此，在没有血清或STARS的情况下，MRTF-A或-B缺失保守N末端区域的缺失突变体（ΔN-MRTF-A或ΔN-MRTF-B）组成性地定位于NIH 3T3细胞的细胞核（图。). 在没有STARS的情况下，这些N末端缺失突变体比野生型蛋白更有效地激活SRF依赖性报告子，而STARS并没有进一步增强它们的转录活性（图。). 总之，这些结果有力地支持了MRTF的核转位介导STARS对SRF活性的刺激作用的观点。
STARS的肌动蛋白结合活性对于MRTF-A和-B的核积累是必要的和充分的。
为了进一步探讨STARS刺激SRF活性的机制，我们测试了一系列STARS突变体对MRTF核转位和SRF依赖性转录激活的影响。STARS蛋白包含375个氨基酸，其保守的肌动蛋白结合域包含在C末端142个残基中(三). STARS C末端缺失突变体N233不能结合肌动蛋白或激活SRF，不能诱导MRTF-A和-B的核积累（图。). 相反，STARS（C142）的C端142个氨基酸结合肌动蛋白并刺激SRF(三)，诱导MRTFs的核积累与全长STARS一样有效（图。).
STARS的肌动蛋白结合活性是刺激MRTF活性的必要条件和充分条件。（A） 用编码FLAG标记MRTFs和N233或C142 STARS突变体的表达载体瞬时转染NIH 3T3细胞。通过FLAG表位的免疫染色确定MRTFs的亚细胞分布。（B） 测定了在N233和C142 STARS突变体存在或不存在的情况下，A组细胞核中含有MRTF的转染细胞的百分比。在每种条件下，至少对150个转染细胞进行计数。数值为平均值±标准偏差（误差线）。如图所示，在不含血清的情况下，用编码FLAG标记MRTFs和野生型STARS或N233和C142 STARS突变体以及SM22-荧光素酶（C）或4×CArG-荧光素酶（D）的表达载体瞬时转染NIH 3T3细胞。数值表示为荧光素酶表达激活水平高于报告基因单独水平±标准偏差（误差线）。（E） 如图所示，在没有血清的情况下，用编码α-肌动蛋白、STARS和SM22萤光素酶的表达载体瞬时转染NIH 3T3细胞。数值表示为荧光素酶表达激活水平高于报告基因单独水平±标准偏差（误差线）。
STARS突变体诱导MRTF核定位的能力与SRF依赖性转录之间存在精确的相关性。STARS N233未能增强SRF依赖性报告子的MRTF依赖性激活，而STARS C142协同增强MRTF介导的转录至与全长STARS相同的水平（图。). 这些结果表明，STARS的肌动蛋白结合域对于STARS对MRTF的核积累和转录激活是必要的和充分的。为了排除STARS的活性是对肌动蛋白连接蛋白过度表达的一般非特异性反应的可能性，我们测试了α-肌动蛋白、，一种不相关的肌动蛋白结合蛋白，影响MRTF介导的转录。如图所示。α-肌动蛋白的过度表达不能单独或与MRTF联合刺激SRF依赖的转录。因此，STARS的影响似乎是特定的。
肌动蛋白动力学和Rho参与STARS的活动。
为了评估肌动蛋白动力学和Rho信号在STARS诱导的MRTFs核移位和转录激活中的潜在参与，我们研究了一系列影响肌动蛋白聚合的因素对STARS活性的影响。用latrunculin B处理NIH 3T3细胞，其可隔离肌动蛋白单体并防止依赖Rho的MRTF-A核累积和SRF活化(21)，在STARS存在下阻止MRTF-A和-B的核聚积（图。). 相反，细胞松弛素D使肌动蛋白二聚，但阻止肌动蛋白聚合并激活SRF，即使在没有STARS的情况下也能强烈诱导MRTF的核移位（图。). 与它们对MRTF核导入的影响一致，LB显著阻断了STARS对MRTF-依赖性转录的刺激作用，CD单独增强了MRTFs的活性（图。). 这些结果支持了肌动蛋白动力学参与STARS诱导的MRTF核积累和SRF通过MRTF转录激活的观点。
在有无STARS的情况下，肌动蛋白修饰剂对MRTF亚细胞定位的影响。（A）用编码FLAG-标记MRTF的表达载体瞬时转染NIH 3T3细胞，分别用LB（0.5μM）或CD（1μM）处理，或与编码C3转移酶的载体共转染NIH3T3或Rho19N（1μg）。通过FLAG表位的免疫染色确定MRTFs的亚细胞分布。（B） 测定了在STARS存在下，A组细胞核中含有MRTFs的转染细胞的百分比。在每种条件下对至少150个转染的细胞进行计数。数值为平均值±标准偏差（误差线）。
在有无STARS的情况下，肌动蛋白修饰剂对MRTFs转录活性的影响。如图所示，用编码STARS和MRTFs以及SM22-荧光素酶或4×CArG-荧光素酶的表达载体瞬时转染NIH 3T3细胞。（A） 如图所示，用LB或CD处理细胞。（B） 如图所示，用编码C3转移酶（50 ng）或Rho19N（1μg）的表达载体共同转染细胞。数值表示为荧光素酶表达激活水平高于报告基因单独水平±标准偏差（误差线）。
由于Rho活性对肌动蛋白动力学至关重要，我们接下来研究了RhoA在STARS诱导的核积累和MRTFs转录活性增强中的潜在参与。表达C3转移酶（ADP-核糖基化并使Rho失活）抑制MRTFs的核积累和STARS对MRTFs转录活性的刺激作用，正如显性阴性RhoA突变体Rho19N一样（图。和). 尽管STARS需要Rho活性来诱导肌动蛋白跑台运动和MRTF核转位，而Rho活动的抑制会阻断STARS活性，但STARS转染细胞中RhoA活性的测定与未转染细胞没有差异（数据未显示）。因此，STARS似乎没有作为Rho的上游激活物发挥作用，但需要Rho-actin信号传导和肌动蛋白动力学的变化来激发其对MRTF和SRF活性的刺激作用。
STARS促进MRTFs与肌动蛋白的分离。
MRTF-A先前显示与肌动蛋白相关(24). 激活Rho信号和肌动蛋白跑步机将肌动蛋白从MRTF-A中分离出来并诱导MRTF-A的核蓄积(21). 鉴于STARS的肌动蛋白结合和肌动蛋白聚合活性，我们研究了STARS是否可能通过将MRTF与肌动蛋白分离来促进MRTF的核导入。如图所示。，内源性肌动蛋白与FLAG-MRTF-A和FLAG-MRTF-B一起在293T细胞的提取物中免疫沉淀。STARS的存在导致与MRTFs免疫共沉淀的内源性肌动蛋白数量减少，表明STARS导致肌动蛋白-MRTF复合物解离。事实上，在STARS的存在下，与FLAG-β-肌动蛋白共免疫沉淀的Myc-MRTF的量也减少了（图。). 在共免疫沉淀实验中未观察到MRTFs和STARS之间的直接物理相互作用（数据未显示）。
STARS和肌动蛋白对MRTF活性的调节。（A） STARS将MRTFs与内源性肌动蛋白分离。用1μg编码FLAG-MRTF的表达载体转染293T细胞（含或不含Myc-STARS）。用抗FLAG免疫沉淀（IP）细胞提取物，并用所示抗体进行蛋白质印迹分析。（B） 用密度测定法测定A组肌动蛋白免疫沉淀与MRTF的相对量。数值表示为平均值±标准偏差（误差线）。（C） STARS导致MRTF-结合蛋白复合物解离。用编码FLAG-β-actin（1μg）和myc-MRTFs（4μg）及/或myc-STARS（100 ng）的表达载体转染293T细胞。用抗FLAG免疫沉淀（IP）细胞提取物，并用所示抗体进行蛋白质印迹分析。（D） 各种肌动蛋白突变体对STARS诱导的MRTFs介导转录激活的影响。用编码STARS、MRTFs和野生型（WT）肌动蛋白或各种肌动蛋白突变体（S14C或R62D）和SM22-荧光素酶报告子的表达载体瞬时转染NIH 3T3细胞。数值表示为荧光素酶表达激活水平高于报告基因单独水平±标准偏差（误差线）。
如研究所示，未聚合的G-actin控制MRTF活性(21)我们之前已经证明STARS诱导肌动蛋白聚合(三)，我们假设STARS通过耗尽G-actin池来激活MRTF。因此，我们测试了各种肌动蛋白突变体对STARS诱导的MRTF介导转录激活的影响。野生型肌动蛋白的表达增加了G-actin的数量，但不会改变F-actin/G-actin的比率，降低了STARS激活MRTF依赖性转录的能力，尽管在缺乏STARS的情况下，它并没有显著改变MRTF的活性，这有利于F-肌动蛋白的形成并增加F-肌动蛋白/G-肌动蛋白的比例(25)，即使在没有STARS的情况下也刺激MRTF活性，并通过STARS消除MRTF的进一步激活。相反，肌动蛋白R62D突变体无法聚合并降低F-actin/G-actin比率，抑制了MRTF活动，还降低了STARS增强MRTF活动的能力（图。). 总之，这些结果支持了这样一种观点，即STARS通过消耗G-actin池来诱导MRTF从肌动蛋白中分离，从而刺激MRTF活性。
抑制STARS可降低肌肉细胞中的SRF活性。
上述实验表明，肌肉特异性蛋白质STARS的强制表达可以刺激非肌肉细胞中的MRTF/SRF活性。为了确定STARS在肌肉细胞SRF介导转录中的潜在作用，我们使用siRNA敲除C2C12骨骼肌细胞和大鼠心肌细胞内源性STARS的表达，在存在STARS siRNA和非特异性对照siRNA的情况下，通过在转染HeLa细胞中过度表达STARS进行测试。如图所示。，STARS siRNA有效地抑制了STARS蛋白的表达。
STARS siRNA降低肌肉细胞中的SRF活性。（A） 用编码myc-STARS和STARS siRNA的表达载体瞬时转染HeLa细胞或对照非特异性siRNA。用抗myc或抗α-微管蛋白抗体进行Western印迹分析细胞裂解产物。（B） STARS siRNA与4×CArG-荧光素酶共同转染未分化（undiff）C2C12细胞、分化（diff）C2 C12细胞（诱导分化后2-5天）或初生大鼠心室肌细胞（NRVM）。数值表示为高于报告基因水平的荧光素酶表达激活水平，控制siRNA±标准偏差（误差条）。
在C2C12细胞中，当成肌细胞分化为肌管时，在血清剥夺后2天诱导STARS表达(三). STARS siRNA可有效降低分化诱导后2至5天分化的C2C12细胞中由串联SRF-结合位点控制的荧光素酶报告基因的表达，但不降低不表达STARS的未分化的C2C1细胞中的荧光素酶报告基因表达（图。). STARS siRNA也显著降低了表达STARS的原代新生大鼠心室肌细胞中该报告基因的表达（图。). 这些结果支持了内源性STARS参与肌肉细胞SRF激活的结论。
讨论
STARS是一种肌肉特异性肌动蛋白结合蛋白，能够通过涉及RhoA和肌动蛋白聚合的机制刺激SRF依赖性转录(三). 我们之前推测，STARS通过耗尽G-actin池来激活SRF，STARS的活性可能由一种未知的中间蛋白介导。本研究结果表明，STARS通过依赖RhoA和肌动蛋白聚合的机制诱导MRTF-A和-B的核积累，从而激活SRF-依赖性转录。这些发现确定MRTF-A和-B是STARS和SRF之间的联系。
STARS诱导MRTF-A和-B的核移位。
与最近的报道一致，血清通过依赖RhoA的MRTF-A核聚积诱导SRF介导的转录(10,21)我们的结果表明，STARS可以替代血清信号，促进MRTF-A和-B的核转位，从而激活SRF-依赖性转录。STARS刺激MRTF核转位只需要STARS的肌动蛋白结合域，并被LB抑制，LB隔离G-actin单体。同样，用C3转移酶抑制RhoA活性或显性负性RhoA的表达可阻止MRTF的核积聚及其对SRF的刺激。Rho-actin信号似乎促进MRTFs的核积累，至少部分是通过增强肌动蛋白聚合和单体G-actin的耗竭，从而导致G-actin从MRTF-A中解离，以及MRTF-A-的核积累(21). 事实上，MRTF-A/MAL最近被报道与G-actin直接相互作用(24). 由于STARS直接与肌动蛋白结合并似乎能增强肌动蛋白聚合，因此我们支持这样的观点，即STARS通过耗尽G-actin库促进MRTF的核积累（图。). LB能够隔离G-actin单体，阻止MRTF对STARS的核定位，STARS能够破坏actin与MRTF的结合，这与这一概念一致。
解释STARS刺激MRTF活性的模型。STARS与肌动蛋白结合，并在基础Rho活性存在的情况下促进肌动蛋白聚合，从而释放MRTF，使其免受G-actin的抑制影响，从而允许MRTF的核输入和SRF活性的刺激。SRF激活肌动蛋白基因，允许负反馈循环。
MRTF的N末端区域包含一系列被称为RPEL基序的保守氨基酸，这些氨基酸已被证明通过与肌动蛋白结合将MRTF隔离在细胞质中(21,25). 与STARS通过将MRTF从单体G-肌动蛋白中取代来促进MRTF的核导入的可能性一致，RPEL基序是STARS对MRTF的作用所必需的。心肌蛋白的RPEL区域与MRTF-A和-B的RPEL区不同，并且心肌蛋白不保留在细胞质中。因此，心肌蛋白组成性地定位于细胞核，其活性不被STARS增强。
发育和疾病期间肌肉基因调控的意义。
STARS表达的心肌和骨骼肌特异性以及STARS siRNA降低这些细胞类型中SRF介导的转录的发现表明，STARS为SRF激活提供了肌肉特异性机制。这种机制可以通过STARS的强制表达部署在非肌肉细胞中，这可以通过其在各种非肌肉细胞类型中刺激MRTF核导入和SRF活性的能力来证明。
值得注意的是，SRF调节细胞骨架肌动蛋白基因的表达，并且自身是肌动蛋白动力学调节的目标。因此，通过肌动蛋白动力学对SRF活性的调节提供了一个调节环，细胞可以根据细胞骨架动力学的变化调节肌动蛋白细胞骨架成分编码基因的表达。STARS可能调节肌肉细胞的调节回路。事实上，不仅β-actin，而且由SRF靶基因编码的骨骼肌α-actin也能与MRTF-A结合(24). 在肌肉细胞中，STARS可促进肌肉特异性肌动蛋白的聚合，并阻止未聚合肌动蛋白抑制MRTF活性，从而维持SRF诱导的肌肉特异性转录肌动蛋白基因。由于心肌对STARS的作用不敏感，因此无论肌动蛋白的聚合状态如何，其靶基因都将高度活跃，尽管STARS有望通过其对MRTF-A和-B的作用进一步增加这些基因的表达，MRTF-A-和-B也在心肌中表达，与心肌蛋白形成异二聚体。
STARS通过MRTF调节SRF活性的能力对横纹肌的发育和疾病也有一些有趣的影响。例如，Rho信号刺激心肌和骨骼肌细胞的分化，MRTF-B已被证明是骨骼肌分化所必需的(28,30,37,38). 因此，STARS在肌发生过程中的上调可能为增强MRTF/SRF靶基因的激活和加强分化过程提供了前馈机制。此外，肌节的扰动可导致心肌细胞病理性肥大，并激活胎儿心脏基因，其中许多基因受SRF调节（参考文献综述23). 肌节结构和功能的变化触发细胞核基因表达变化的机制尚不清楚。STARS通过MRTF将肌动蛋白动力学与转录相互连接的能力提供了解释这些观察结果的潜在机制。值得注意的是，最近有报道称STARS在病理性肥大期间在心脏中上调(19). 因此，STARS-MRTF/SRF调节回路的扰动具有潜在的有趣的治疗意义。
