通过多梳群反应元件的基因间转录抵消沉默

这个制造-7PRE在通过元素构成转录时被激活

测试是否通过工厂-7元素对该PRE的表观遗传状态有任何影响，我们使用肌动蛋白5c启动子。我们评估了迷你白pFA中的标记(图2A-D)和pFAas(图2E-H)在所有可能的重组步骤之前和之后的转基因飞线。当工厂-7转基因的PRE转录自肌动蛋白5c启动子、pFAs和pFAas成虫孵化出深橙色或红色眼睛(图2A、E). 在所有获得的转基因株系中（每个pFAs和pFAas构建体≥20个独立株系），我们从未观察到迷你白这种情况下的基因，表明工厂-7PRE切换到激活模式。我们通过工厂-7胚胎和第三恒星幼虫组织中的RNA原位杂交以预期模式发生(伯恩等人，1989年; 数据未显示）。相反，在切除肌动蛋白5c转基因启动子迷你白基因几乎完全被抑制了(图2B，F). 因此，在没有转录的情况下工厂-7PRE处于压抑状态，导致记者沉默。当工厂-7元素从转基因中移除迷你白该基因在肌动蛋白5c发起人(图2C、G). 切除肌动蛋白5c来自转基因的启动子导致眼睛色素沉着的适度减少(图2D，H)，表明启动子与标记基因的邻近具有激活作用。pFAs和pFAas转基因系的表现非常相似，表明工厂-7转基因的PRE与观察到的效果无关。

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图2。

工厂-7通过PRE构成转录激活。所示为pFAs和pFAas转基因系在所有可能的重组步骤之前和之后的成年蝇眼的照片。(A、 E类)的表达式迷你白标记，当工厂-7PRE是从肌动蛋白5c启动子。(B、 F类)眼部色素沉着工厂-7PRE，但缺少肌动蛋白5c转基因启动子。(C、 G公司)迷你白在没有工厂-7当肌动蛋白5c启动子位于标记基因附近。(D、 H（H）)眼睛色素沉着程度工厂-7也不是肌动蛋白5c启动子位于转基因上。(我)迷你白Cre前后通过光度色素测量确定的表达水平/液氧磷和/或Flp/FRT公司在四个独立的转基因株系中进行重组。所示为三次独立测量的平均值。

通过工厂-7PRE上的迷你白表达水平，我们对四个独立的转基因株系进行了光度色素测定(图2I). 转录后眼睛色素沉着增加工厂-7来自肌动蛋白5c启动子差异很大，从2.9倍到19.3倍不等，这取决于转基因的插入位点。相比之下迷你白仅仅由于肌动蛋白5c仅启动子保持相对恒定（1.9-3.2倍）。果蝇眼部色素沉着水平的比较工厂-7带有肌动蛋白5c启动子，但转基因上没有PRE，表明工厂-7PRE通过转录导致迷你白标记。我们得出结论，构成转录通过工厂-7PRE导致该元素稳定的表观遗传激活。

表观遗传激活需要转录通过工厂-7之前

这个肌动蛋白5CpFAs和pFAs转基因中使用的启动子是一个强启动子。因此，可以想象制造-7元素可能通过在其附近招募转录激活物来实现。为了检测转录机制是否确实必须通过PRE才能触发表观遗传激活，我们在工厂-7元素和肌动蛋白5C发起人(图3，pFTA）。我们选择的终止信号源自果蝇hsp70基因(斯特鲁尔和巴斯勒1993). 在获得的六个转基因pFTA系中，有两个系迷你白基因几乎完全沉默，表明在这种情况下工厂-7PRE处于被压抑状态(图3A). 相反，在用Cre从转基因中切除终止序列后/液氧磷重组工厂-7PRE再次稳定激活，如迷你白标记(图3B). RNA原位杂交表明，在pFTA-1转基因株系中工厂-7PRE来自肌动蛋白5C启动子被有效终止，而终止序列被删除后，工厂-7RNA再次被检测到(图3A′、B′). 我们测试了另外两个pFTA转基因株系，其中迷你白基因未被抑制和检测工厂-7即使存在终止信号（数据未显示），也表明在转基因的这些插入位点，转录没有有效终止。此外，恢复的转基因pFTA株系总数低得令人惊讶，这表明真正的转基因株系可能由于完全抑制迷你白转化标记。

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图3。

表观遗传激活需要转录通过工厂-7之前。在pFTA构造中热休克蛋白703′UTR转录终止信号（txterm）插入工厂-7元素和肌动蛋白5c启动子。在pFLA转基因中制造-7PRE与肌动蛋白5cλDNA启动子的长度与热休克蛋白703′UTR缺少终止序列。终止信号和λDNA两侧为液氧磷站点工厂-7PRE由FRT公司序列。(A、 B类)迷你白肿瘤切除前后pFTA细胞系中的表达热休克蛋白70分别来自转基因的3′UTR。(A类′,B′）原位杂交检测工厂-7RNA显示来自肌动蛋白5c启动子在到达PRE之前被有效终止。(C、 D类)眼睛色素沉着水平保持不变，与转基因中λDNA的存在或缺失无关。C′,D类′）RNA原位杂交证实增加工厂-7元素和肌动蛋白5c启动子不通过PRE影响转录。

我们在pFTA线中观察到的抑制可能只是由于PRE和肌动蛋白5C启动子。为了测试这一点，我们建立了对照转基因系，其中工厂-7元素和肌动蛋白5C启动子由λDNA分离，λDNA的长度与热休克蛋白703′UTR终端缺少终端信号。在获得的10个转基因株系中，我们从未观察到迷你白压制(图3C). 正如预期的那样，Cre从转基因中切除λDNA/液氧磷重组对报告者的表达没有影响(图3D). 原位杂交表明工厂-7PRE在这些苍蝇中转录(图3C′、D′)从而证实pFTA系中的抑制是由终止子序列特异性引起的。

这些结果表明工厂-7元素确实需要转录机制通过PRE，这表明在PRE附近招募转录激活物不足以克服沉默。此外，这些数据表明迷你白由肌动蛋白5CpFAs和pFAas系中转基因的启动子(图2A、E)是激活的结果工厂-7PRE并不是由于肌动蛋白5C启动子与迷你白基因。

表观遗传激活的维持需要在整个胚胎发生过程中进行转录

为了更好地理解PRE表观遗传激活的机制，我们希望测试转录是否只触发建立，或者是否在整个发育过程中也需要保持激活状态。为此，我们使用中描述的构建物pFH和pFH来培育转基因果蝇图1.在这些苍蝇中工厂-7PRE是从合子的0.7kb片段转录而来的驼背(血红蛋白)启动子，仅在早期胚胎发生期间激活(Schröder等人，1988年). 该启动子的转录开始于细胞分裂周期11-12，即BX-C的PRE内源性转录物出现之前不久(Schröder等人，1988年；桑切斯·埃雷罗和阿卡姆1989). 最小合子的活性血红蛋白启动子随着原肠胚形成的开始而停止。RNA原位杂交证实工厂-7转基因上的PRE以预期的模式转录（数据未显示）。相比之下肌动蛋白5cpFAs和pFAas线，它们从未表现出对迷你白重组前，报告者以配对敏感的方式沉默了50%的基因（pFHs，n个=12）和55%（pFHas，n个＝11）。这些是携带受抑制PRE的转基因报告株中预期的配对敏感抑制的典型比率(Kassis 2002年)，表明工厂-7元件未稳定激活。的确，切除颧骨前后眼睛色素沉着的比较血红蛋白来自转基因的启动子表明转录通过制造-7该启动子不足以激活PRE(图4，参见A、B、E、F）。当工厂-7PRE从转基因中移除迷你白该基因不再沉默，并表达到转基因插入位点的典型水平(图4C、G). 如果没有工厂-7PRE，去除合子血红蛋白启动子对迷你白记者(图4，参见C和D、G和H）。

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图4。

表观遗传激活的维持需要持续转录。(A类-H（H）)迷你白在所有可能的重组步骤之前和之后，pFH和pFH均为转基因株系。(A、 E类)当工厂-7PRE由合子转录而来血红蛋白启动子。(B、 F类)的级别迷你白去除合子后的表达血红蛋白启动子。(C、 G公司)切除工厂-7元素导致释放迷你白标记。(D、 H（H）)进一步切除合子血红蛋白来自转基因的启动子不会改变迷你白基因。(我-N个)条件性活性Cre-EBD融合蛋白的表达导致眼睛色素沉着水平的变化。(我)在缺乏雌激素的情况下迷你白基因没有改变。(J型)通过将一龄幼虫转移到含有0.06 mg/mL雌激素的食物中来诱导Cre-EBD活性，导致20只成虫中有一只眼睛色素沉着（红圈）较低。(K（K）)当Cre-EBD公司和eyGAL4型转基因与pFA结合为转基因。(L（左）-N个)与中类似的条件我-K（K）对于缺少工厂-7PRE（在这些病例中未观察到克隆。

我们推断，这个转录的时间框架可能太短，无法牢固地建立表观遗传激活状态工厂-7之前。与此一致，BX-C中的内源性非编码PRE转录物也可以在胚胎发生后期检测到(Rank等人，2002年). 此外，在我们之前建立的转基因检测中工厂-7PRE可以通过一个反式-在胚胎中激活，但当反式-激活剂在胚胎发生的后期表达(卡瓦利和帕罗1998). 因此，可以想象，表观遗传激活的PRE状态的牢固建立需要更长的转录时间窗口，扩展到许多细胞分裂。

通过制造-7元素，我们在发育中眼睛的所有细胞中表达了条件活性Cre-EBD（雌激素结合域）融合蛋白UASP核心-EBD304在我们的pFAas-1转基因系中转基因。Cre-EBD融合蛋白只有在雌激素存在的情况下才有活性，这使我们能够控制切除肿瘤的时间肌动蛋白5C转基因启动子(海德曼和莱纳2001). 因此，我们限制了工厂-7通过将刚孵化的幼虫转移到含有雌激素的食物上，在pFAas-1系中从发育开始到胚胎发生完成后不久的转录。这表示通过工厂-7而不是由肌动蛋白5c启动子，在整个发育过程中都是活跃的，但比短暂活跃合子的时间更长血红蛋白发起人。

我们通过对从测试的成虫头部回收的DNA进行基因组PCR，验证了雌激素处理的幼虫中发生了重组（数据未显示）。在表达Cre-EBD融合蛋白但未经雌激素处理的对照pFAas组中，我们在所分析的五分之二的苍蝇中检测到背景重组。当一龄幼虫被转移到含有雌激素的食物上时，表现出重组的苍蝇数量增加到五分之四。虽然PCR是在饱和条件下进行的，但发生背景重组的病例中PCR产物的数量远远低于雌激素处理个体中获得的数量，这表明发生背景重组细胞的数量非常低。在对UASP核心-EBD304没有观察到雌激素诱导的依赖性重组，而在雌激素诱导后，100%的治疗个体都获得了重组产物(海德曼和莱纳2001). 在该研究中，在一龄幼虫阶段，即使在雌激素处理仅3小时后，发生重组的成年眼睛克隆也覆盖了大多数细胞。因此，我们预计在将一龄幼虫转移到含有雌激素的食物上后，大多数眼细胞会发生重组。

我们比较了接触和不接触雌激素的苍蝇的眼睛颜色，以确定切除雌激素的效果肌动蛋白5c胚胎发生末期的启动子。对照果蝇在缺乏雌激素的食物中表现出预期的高表达迷你白在两种基因都存在的情况下肌动蛋白5c发起人和工厂-7转基因PRE与eyGAL4型驾驶员和UASP核心-EBD304构造(图4I). 当将一龄幼虫转移到含有0.06 mg/mL雌激素的食物上时，大多数成虫的眼睛颜色与对照苍蝇相似（数据未显示）。在10到20个案例中，其中一个案例中获得了眼睛中有小的浅色克隆的苍蝇，这表明迷你白基因变得有弹性了(图4J). 从形式上来说，我们不能排除这种罕见的低频率迷你白表达可能是由一些非特异性重组事件引起的。然而，这些克隆的色素沉着程度与pFAas-1转基因果蝇缺乏肌动蛋白5C启动子与UASP核心-EBD304和eyGAL4型转基因(图4K). 当幼虫被转移到含有0.03毫克/毫升或0.09毫克/毫升雌激素的食物中时，我们获得了类似的结果，这与之前的研究一致UASP核心-EBD304转基因，其中Cre重组酶活性在雌激素浓度高于0.01 mg/mL时趋于稳定(海德曼和莱纳2001).

在控制中苍蝇，它没有携带工厂-7在转基因预处理中，我们没有观察到用雌激素诱导后眼睛中有小的浅色克隆的苍蝇，尽管眼睛的大区域显示出中间色素沉着(图4，参见L和M）。与缺乏肌动蛋白5c启动子提示这种较浅的色素沉着可能是由于迷你白通过删除肌动蛋白5c转基因启动子(图4N). 如上所述，在工厂-7PRE，Cre的诱导/液氧磷通过雌激素治疗的重组导致了具有和不具有低眼色素沉着克隆的苍蝇。基因组PCR表明，两种带有浅色克隆的果蝇都发生了重组(图4J)以及在没有克隆的情况下（数据未显示）。在后者中迷你白伴随着实质性重组的表达表明，尽管切除了肌动蛋白5c在大多数情况下，一龄幼虫的启动子工厂-7然而，PRE仍处于活动状态迷你白因此基因被强烈转录。这些数据表明，通常情况下，通过工厂-7在第一个幼虫期开始之前，转基因上的PRE足以建立和维持激活的PRE模式。然而，在极少数情况下，我们观察到迷你白表达，表明在这些细胞中，PRE的表观遗传激活不够稳定，因此变得重新激活。

苍蝇菌株和处理

此处使用的转基因株系为p[FAs]-1（第2染色体）、p[pFAs]-2（chr.3）、p[pFAas]-1（chr.3）、p[pFAas]-2（chr.3。使用24小时大的成年女性进行了描述和分析的定量色素测量(路透社和沃尔夫1981). Germline Cre公司/液氧磷和Flp/FRT公司重组是使用P[w个⁺、cre]（布卢明顿库存编号1092）和P[里⁺，hs飞行时间]（布卢明顿库存编号1929）。雌激素诱导Cre/液氧磷使用UASP核心-EBD304 II.6转基因系基本上是按照描述进行的(Heidmann和Lehner 2001年). 这个eyGAL4型驱动线由Stefan Schönfelder（海德堡大学；未解释）善意提供。通过单蝇基因组PCR验证重组(Gloor等人，1993年)使用整只苍蝇或成年苍蝇的头部（用于雌激素诱导的重组）作为模板。

我们感谢K.Basler提供的pBS669载体、P.Becker（慕尼黑路德维希·马克西米利安大学）提供的SF4细胞系、C.Lehner提供的UASP核心-EBD304II.6转基因系和S.Schönfelder提供eyGAL4型驱动线路。我们感谢A.Löwer和L.Ringrose对手稿的有益讨论和批判性阅读，感谢S.Schönfelder和M.Hild的讨论。S.S.得到了Boehringer Ingelheim Fonds Fellowship的支持，R.P.得到了Deutsche Forschungsgemeinschaft（SFB/Transregion 5）的资助。