介绍DOTUR，一个用于定义操作分类学单位和估算物种丰富度的计算机程序

摘要

微生物生态学的一个突出挑战是基于16S rRNA基因序列估计物种丰富度。可用于解决这一挑战的计算方法有限。序列通常分为操作分类单元（OTU）或门型，两者都由电泳模式定义(9,12,18)或DNA序列(1,21). 通过电泳模式筛选独特的16S rRNA基因可能会因具有相同模式的差异超过3%的序列或具有不同模式的差异小于3%的序列而变得复杂(9,22). 核苷酸序列提供了更精确的分析。同一性大于97%的序列通常归属于同一物种，同一性>95%的序列通常归类于同一属，而同一性>80%的序列则通常归属于相同的门，尽管这些区别存在争议(1,2,11,13,21,24,29). 遗传距离近似等于身份百分比的倒数。这些临界值只是历史分类与现代16S rRNA基因测序的最佳匹配，而不是经过严格验证的层次结构。

有几种方法可以根据序列数据快速将序列分配给OTU(26). 调查人员通常手动分析距离矩阵中小于截止水平的值。当三个或多个序列之间的距离关系不可传递时，这种方法会产生问题，这会强制创建一个可能无法一致执行的决策规则。此外，手动将决策规则应用于大距离矩阵可能过于笨拙、繁琐和耗时，难以准确。

为了快速准确地将序列分配给OTU，我们开发了DOTUR（基于距离的OTU和Richness；源代码可从以下作者处获得：http://www.plantpath.wisc.edu/fac/joh/dotur.html)一株PHYLIP(http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html)-生成的距离矩阵用作DOTUR的输入文件，DOTUR为OTU分配每个可能距离的序列。DOTUR然后计算用于构建观测OTU、多样性指数和丰富度估计器的随机稀疏度和收集器曲线的值。本文通过分析和比较从土壤和海水中构建的16S rRNA基因文库，展示了DOTUR的灵巧性，这些文库已与以前的报告中的其他方法进行了研究。

材料和方法

结果

序列分配的验证和评估。

为了测试DOTUR，我们分析了用改良的苏格兰土壤构建的克隆文库(21)（表​（表1；1; 图。​图1）。1). 使用ClustalW校准序列(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/unix/clustalw/)，并且我们构造了一个Jukes-Cantor校正距离矩阵(10)使用PHYLIP的DNADIST程序。我们应用了DOTUR中实现的最近邻、平均邻和最远邻分配算法，并对每种分配算法分别观察到114、115和116个OTU（表​（表1）。1). 使用最远邻算法在3%的距离处观察到的频率分布与McCag等人描述的分布相同(21)，表明DOTUR进行了适当的分配。

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图1。

使用最远邻分配算法和未改进的苏格兰土壤16S rRNA基因库对不同距离水平进行DOTUR分析得出的稀疏曲线（A）和谱系穿透时间图（B）。误差条代表95%置信区间。

表1。

苏格兰和亚马逊河土壤16S rRNA基因采集的频率分布和丰富度估计的各种技术比较^一

16S rRNA基因库来源	分析方法	序列总数	唯一OTU数量	带有n的OTU数量x序列b条
				n个1	n个2	n个三	n个4	n个5	n个6
苏格兰土壤	麦凯格	137	114	98	12	2	1	1	0
	休斯	137	113	96	13	2	1	1	0
	FastGroup（快速分组）	137	131	127	三	0	1	0	0
	神经网络	137	112	96	12	2	0	1	1
	AN公司	137	113	97	12	2	0	2	0
	FN公司	137	114	98	12	2	1	1	0
亚马逊土壤	FN公司	98	84	75	6	1	2	0	0

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^一使用3%的距离水平定义OTU。McCag等人改良的苏格兰土壤16S rRNA基因库的频率分布(21)根据McCag等人的秩丰度数据确定(21)和Hughes等人(14)，来自Seguritan和Rowher的FastGroup程序的输出(26)，并使用DOTUR中实现的三种分配算法。相比之下，亚马逊土壤图书馆(2)使用DOTUR中的最远邻居算法进行了分析。NN，最近邻分配算法；AN，平均邻域分配算法；FN，最远邻分配算法。

^b条n个₁，单件数量；n个₂，双子数；等。

以前曾尝试将此数据集中的序列分配给OTU。苏格兰土壤研究的作者在3%的距离水平上确定了114个（表​（表1；1;21)，然而也有113份报告(14). 这些分析说明了DOTUR如何提供比手动序列计数更好的准确性，并且随着克隆库大小的增加，这种准确性水平将变得更加重要。我们还使用了FastGroup计划(26)，它选择一个参考序列，与其他每个序列进行比较。如果查询序列在指定的相似度百分比范围内，则它将加入组。此方法与最近邻方法类似，但FastGroup将每个查询序列与单个引用序列进行比较，而不是与OTU中的所有序列进行比较。该分析在3%的距离水平上产生了131个OTU。这种方法的问题是，结果可能会出现偏差，这取决于程序选择哪个序列作为参考。在这种情况下，赋值似乎过于保守。

当我们将DOTUR生成的数据与基于稀薄理论、手动计算和EstimateS输出的预期数据进行比较时(http://viceroy.eeb.uconn.edu/estimates网站)，结果相似。DOTUR比EstimateS快得多（数据未显示）。此外，DOTUR执行了排序分配程序，而EstimateS无法执行。当DOTUR计算每个距离级别的各种丰富性和多样性参数时，它会生成单独的文件，可用于生成沿袭时间图，该图描述了不同进化距离中存在的OTU数量（图。​（图1B）。1B年). 此类分析已在其他地方进行了描述(20,23).

DOTUR在亚马逊土壤克隆库中的应用。

Hughes等人(14)提出了一个挑衅性的问题：“微生物的多样性太大，无法计数吗？”博内曼和特里普特的论文被引用最多，支持“是”的答案(2)，他们从两个亚马逊雨林土壤中取样了98种细菌16S rRNA基因，并得出结论，这98种细菌序列是独特的。使用DOTUR，我们识别了两对相同的序列（GenBank登录号U686617型和{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“U68641”，“term_id”：“2258226”}}U68641型和{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“U68620”，“term_id”：“2258205”}}U68620型和{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“U68618”，“term_id”：“2258203”}}U68618型)在合并的亚马逊数据集中。当OTU的定义是唯一性时，实际上有94个单光子和2个双光子，而不是98个单光子。

使用合并的亚马逊克隆文库进行DOTUR分析，我们发现OTU中序列的频率分布在其他距离上与改良的苏格兰克隆文库中的频率分布相似（表​（表1）1)（图。​（图2）。2). 当唯一性决定进入OTU时，由改进的苏格兰序列生成的稀疏曲线表明，如果只对98个序列进行采样，那么作者将有95%的机会识别出93到97个OTU。当进入OTU的距离小于3%时，98个序列后的CI在80到89个OTU之间。当OTU定义为唯一性时，从亚马逊图书馆观察到的OTU数量为94，当OTU定义设置为3%时，观察到的OTU数量为84。因此，不可能有把握地得出结论，即“外来的”亚马逊东部土壤和“普通的”苏格兰农业土壤之间的丰富度存在差异，因为在98个序列取样后，从亚马逊土壤中观察到的OTU数量在苏格兰土壤的95%CI范围内。然而，随着进一步测序，可能会观察到两个库之间的丰富性差异。尽管这两个样本的丰富度可能相同，但文库中可能包含不同组成的16S rRNA基因。

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图2。

使用最远邻分配算法和亚马逊土壤16S rRNA基因库对不同距离水平进行DOTUR分析得出的稀疏曲线（A）和谱系穿透时间图（B）。误差条代表95%置信区间。

DOTUR在马尾藻海宏基因组序列中的应用。

最近，Venter等人(31)发布了一个广泛的测序项目，该项目包括近200万个测序读取，以及来自1.5-m复合物中未培养生物的总计1.7 Gbp^三马尾藻海的样本。我们从GenBank FTPserver获得了每个序列读数(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/TraceDB/environmental_sequence公司/)并对每一个进行通用16S rRNA寡核苷酸筛选(8)和一个改良的通用RNA聚合酶基因(rpoB（转/分）)寡核苷酸(16). 对于每个基因，我们提取了探针序列周围的300 bp，以便每个序列在基因内大致相同的位置开始和结束，并使最终基因库中的基因片段数量最大化。有690个16S rRNA部分基因片段和507个rpoB（转/分）最终序列集合中的片段。

我们将DOTUR应用于上述两个基因片段集合（图。​（图3三和​和4）。4). 我们鉴定了114种16S rRNA和304种rpoB（转/分）使用Venter等人的6%物种差异定义(31)用于蛋白质编码序列。DOTUR分析表明，当我们改变rpoB（转/分）物种定义介于19%和21%之间的差异，95%置信区间为基于两个基因的最终丰富度估计重叠。通过稀疏分析，我们发现用途BOTU在16S rRNA物种片段稀疏曲线的95%置信区间内（取样507个序列时在90到104个物种之间）rpoB（转/分）物种定义差异在22%和23%之间，16S rRNA物种定义差异为3%。通过使用相同的方法，如果我们假设6%的差异适用于通过以下方式定义物种rpoB（转/分）序列，一个物种的所有成员都需要具有相同的16S rRNA序列rpoB（转/分）和16S rRNA丰度估计有重叠的95%CI。

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图3。

稀疏曲线（A）和Chao1丰富度使用马尾藻海宏基因组序列中的部分16S rRNA基因序列估计收集器曲线（B）。误差条代表95%置信区间。

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图4。

稀疏曲线（A）和Chao1丰富度使用偏微分估计采集器曲线（B）rpoB（转/分）马尾藻海宏基因组序列。误差条代表95%置信区间。

讨论

DOTUR通过使用所有可能的距离，快速、系统地将序列分配给OTU。在我们分析的两个克隆库中，DOTUR将序列分配给OTU比以前的方法更加准确和一致。DOTUR还协助评估测序工作的完整性和丰富度估计的可靠性。

DOTUR分析表明，不可能有信心地表明亚马逊图书馆的丰富度与改良的苏格兰土壤图书馆的丰富度不同。然而，尽管与1g土壤中估计的物种丰富度相比，这些文库中的每个序列都相对缺乏，预计将在数千种物种中(30)，进一步排序可能会显示库之间的丰富性差异。此外，其他地方描述的方法的应用可能表明，虽然这两个库的丰富程度相似，但它们的系统发育组成不同(20,25,27). 最后，物种丰富度或群落组成与生态机制之间的联系尚待确定。有可能两个社区的成员会有很大不同，但会进行类似的生物过程。

马尾藻海宏基因组序列的包含为DOTUR提供了一个有趣的应用，用于描述丰富度、比较用于基因的物种定义和系统发育信息，以及评估对估计值有信心所需的抽样水平。Venter等人(31)发现143种不同的16S rRNA，428种不同用途B我们发现114和303种不同的16S rRNA和rpoB（转/分）物种。这种差异可能是因为他们将分析限制在那些重叠至少40 bp的序列上，而我们要求所有序列重叠相同的300 bp。尽管在方法上存在这种差异，但他们通过使用用途B序列和我们预测了1040个物种的丰富度，使用了它们6%的差异物种定义，表明这些方法产生了可比较的结果。

由于DOTUR同时比较了多个OTU定义，我们能够使用16S rRNA和rpoB（转/分）基因序列。假设16S rRNA序列中3%的差异是物种的有效定义，那么蛋白质编码序列物种定义将接近20%。我们在蛋白质编码序列中发现了类似的结果rpoB（转/分）已被用作系统发育锚（数据未显示）。20%的值与之前使用蛋白质编码序列的物种定义相比，更符合6%。例如，DNA-DNA杂交分析中30%的差异用于区分物种。我们使用DOTUR解释了这两个基因进化速度的差异。一个潜在的担忧是，使用16S rRNA序列所做的任何估计都被夸大了，因为已知细菌的基因组中有该基因的多个拷贝。虽然据预测，大多数控制环境的生长缓慢的细菌平均每个基因组接近1个拷贝(15)单个基因组的多个拷贝必须有超过3%的差异才能对我们的分析产生影响。如果基因组内变异性大于3%，16S rRNA OTU的数量将减少，导致蛋白质编码序列的物种定义更低。任何选择用于区分物种的距离水平都是任意的，因此也会引起争议，但它将成为未来分析的有用基准。

当观测到的不同OTU数量小于总丰富度平方根的两倍时，Chao1丰富度估计器与测序努力密切相关。如果我们假设一克土壤中大约有4000种OTU(30)150毫升海水(7)那么，在丰富度和测序努力之间的相关性开始下降之前，需要分别对至少125个和17个不同的OTU进行采样。然而，我们不知道需要多少序列才能达到测序工作和丰富度之间没有相关性的条件。在土壤样品中，我们证明当使用3%的距离来定义OTU时，137个序列不足以可靠地估计丰富度。使用马尾藻海样本，该样本被认为含有十分之一的土壤丰富度(7)我们发现，总共690个序列几乎足以准确估计物种丰富度，并且当使用20%的差异来定义OTU时，也足以估计丰富度。很可能需要至少10000个序列来接近土壤中真实物种丰富度的估计值。为了评估采样进度，我们建议跟踪丰度估计采集器曲线并采样，直到300个序列的丰度没有瞬时2.5%的变化。

当报道苏格兰和亚马逊河流域的土壤序列时，测序是相当昂贵和费力的。利用成本较低且基本自动化的现有技术，我们有机会生成和测序大型16S rRNA基因库，其大小可能足以提供准确的丰富度估计和比较，即使在物种丰富的环境中，如土壤中。

致谢

参考文献