经常性从头开始层粘连蛋白A的点突变导致Hutchinson–Gilford早衰综合征

摘要

早衰是HGPS（人类孟德尔在线遗传（OMIM）176670）临床和细胞培养的标志^1,2患有HGPS的儿童出生时通常表现正常，但一年内开始出现发育不良、牙列发育迟缓、脱发和皮肤硬化性改变等特征。死亡平均发生在13岁，至少90%的患者死于进行性冠状动脉和脑血管动脉粥样硬化²虽然HGPS遗传的普遍假设是散发的常染色体显性遗传^5,6常染色体隐性遗传的可能性^7,8引导我们进行全基因组扫描，寻找纯合子证据⁹对来自我们其中一人（W.T.B.）认为代表经典HGPS的12个个体的12个DNA样本进行全基因组扫描，包括403个多态性微卫星标记，平均间距为9.2 cM。尽管在整个样本集中没有发现纯合性的证据，但发现两个HGPS样本具有1q染色体的单亲异二体（UPD）(图1a). 两例UPD患者中一例的光谱核型和G显带显示核型正常（数据未显示）。

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图1

HGPS基因在染色体1q上4.82-Mb区间的定位。一，两名HGPS患者成纤维细胞中1q号染色体的单亲等位体（填充符号）。显示了标记及其基因型的子集。NA，不可用b条，装箱间隔是先证者C8803中仅从母亲继承的区域。c（c），FISH分析与BAC探针RP11-110J1（绿色）和RP11-91G5（红色）杂交的C8803成纤维细胞中期扩散。d日，候选区域的摘要地图。微卫星标记用箭头表示；水平条表示样本C8803上用于FISH的BAC探针。LMNA公司是4.82-Mb候选区间中约80个已知基因之一。

早期的报告¹⁰描述了一对患有HGPS的单卵双胞胎的异常核型。该报告描述了一种镶嵌细胞群体，其中70%的细胞含有平衡的反向插入（46，XY，inv-ins（1；1）（q32；q44q23）），而其余细胞具有明显正常的核型。我们从同一个人（样本标识C8803）及其父母那里获得了成纤维细胞培养物。出乎意料的是，微卫星标记的基因分型确定了一个大约6兆碱基（Mb）的区间，其中所有测试的父系等位基因都完全缺失(图1b). 我们用荧光法证实，这种缺失也存在于具有明显正常核型的细胞中就地与细菌人工染色体（BAC）杂交（FISH）(图1c). 将所有这些信息与总共44个附加微卫星标记的基因型结合起来，我们确定HGPS基因必须位于近端染色体1q上4.82Mb的区间内(图1d).

候选区间包含大约80个已知基因。我们的注意力立刻被吸引到了其中一个LMNA公司编码两种蛋白质产物（层粘连蛋白A和层粘连蛋白质C）的基因，代表内核膜层的主要成分。中的突变LMNA公司已发现六种不同的隐性和显性疾病的病因，包括Emery–Dreifuss 2型肌营养不良症（扩张型心肌病的一种形式）、Dunnigan型家族性部分脂肪营养不良症、肢体带状肌营养不良1B型、Charcot–Marie–Tooth疾病2B1型、，和下颌骨发育不良（参见参考文献中对椎板病的综述^三,4). 该基因包含12个外显子，覆盖约25千个基因组DNA碱基。层粘连蛋白A由外显子1-12编码，层粘连蛋白质C由外显字1-10编码。外显子10内的一个剪接位点，位于层粘连蛋白C终止密码子的上游，与外显子11和12剪接在一起，编码层粘连蛋白质A^11,12.

聚合酶链反应（PCR）扩增LMNA公司基因（包括外显子-内含子边界），然后直接测序，在23例典型HGPS患者的样本中进行。在这些样本中，18个样本的第11外显子中存在杂合子碱基替换（G608G（GGC>GGT））LMNA公司基因已鉴定(图2a). 在HGPS样本AG10801中，在同一密码子内发现了不同的杂合碱基替换（G608S（GGC>AGC））(图2a). 在HGPS样本AG10677中，我们在外显子2（E145K（GAG>AAG））内发现了杂合碱基替换。在8例父母双方都有DNA的病例中，父母中没有G608G突变，这证实了从头开始突变。同样，在AG10801或AG10677的亲本中分别未发现G608S和E145K突变。因此，在研究的23例经典HGPS病例中，只有3例没有LMNA公司发现突变(表1)：两例UPD病例（AG10578和HGADFN005）和6-Mb父系缺失样本（C8803）。

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图2

第11外显子的点突变LMNA公司导致HGPS。一，正常对照组和两名HGPS患者的序列追踪。b条，关于外显子11中隐秘剪接供体位点激活的假设。c（c），使用RT-PCR演示异常剪接产物，显示两个HGPS先证者中由于隐性剪接位点的激活而产生489 bp的异常产物。右侧的备选车道缺乏逆转录酶。d日，使用针对层粘连蛋白a/C的单克隆抗体进行Western blot。第1、5、8和9道来自AG03506、AG03344、AG11498和AG01972；它们都携带G608G（GGC>GGT）。4号车道来自AG10801，承载G608S（GGC>AGC）；车道2和3来自AG03506的父母；车道6和7分别来自AG03259的父亲和AG06917的母亲。第1-5道来自淋巴母细胞系；泳道6-9来自成纤维细胞。来自HeLa细胞的蛋白质样本位于10号通道。

这个从头开始在20例经典型HGPS患者中有18例出现了相同的精确点突变，这是一个令人惊讶的发现，但并非没有先例。常见的HGPS突变是CpG二核苷酸背景下的C-T突变，它代表脊椎动物基因组中最易变的碱基，因为甲基化的C可以脱氨基为T并被错配。在E145K病例和四分之四的G608G HGPS病例中，父母DNA可用，外显子10（H566H）或外显子7（D446D）的沉默多态性具有信息性，我们能够确定新突变是父系起源（数据未显示）。软骨发育不全也有类似现象¹³，其中几乎所有散发病例都是由于FGFR3基因中的父系CpG到TpG突变，导致明显的功能丧失突变。

最常见的突变，G608G（GGC>GGT），是一种沉默的替代。同一密码子中的第二个突变G608S（GGC>AGC）导致了丝氨酸对甘氨酸的保守替代。这些平淡的外表怎么可能从头开始突变可能导致HGPS？对608密码子周围正常序列的检查表明，观察到的两个HGPS突变都提高了与一致剪接供体的匹配性(图2b)这表明它们可能激活了一个隐秘的剪接位点。为了验证这一假设，使用跨越外显子7和8连接处的正向引物和外显子12处的反向引物进行逆转录PCR（RT）。在来自未受影响个体的RNA中，预期产物出现(图2c). 在来自HGPS突变细胞系的RNA样本中，出现了一个额外的较小的RT-PCR产物。这些片段的序列显示，第11外显子内的150个核苷酸缺失。随着阅读框架的维持，这种异常转录物有望编码层粘连蛋白a C端附近50个氨基酸内部缺失的蛋白质。层粘连C不会受到影响。对从含有更常见密码子608突变的原代成纤维细胞提取的RNA进行RT-PCR获得的正常全长片段的克隆和测序表明，23个克隆中有7个携带突变序列。因此，外显子11内隐秘剪接位点的激活并不完全。为了确定突变信使RNA是否真的被翻译成蛋白质，使用抗层粘连蛋白a/C的单克隆抗体进行了蛋白质印迹(图2d). 除了层粘连蛋白A和层粘连蛋白质C的正常带外，在四条对应于经典HGPS病例样本的通道中还存在另一条带，但在其父母中不存在。在含有经典HGPS患者AG11498（携带G608G（GGC>GGT））蛋白样品的通道中，不可见异常带，但这可能是由于在这个特定的成纤维细胞系中表达了极少量的层粘连蛋白A。

虽然HGPS的主要原因似乎是外显子11中异常剪接供体的产生，但发现了从头开始单个患者（AG10677）外显子2的点突变值得关注。回顾过去，这位患者¹⁴具有非典型的临床特征（包括头上持续存在粗糙的毛发，手臂和腿部有大量皮下组织，以及从4岁开始的严重中风），这可能与典型的HGPS有细微区别。

这两个UPD案例呈现出一个有趣的两难境地：如果LMNA公司这两种情况的基因序列都正常，为什么他们有HGPS？必须考虑压印的可能性；然而，以前的1号染色体父系和母系完全等位基因不支持该染色体上存在任何印迹位点^15,16在母亲和兄弟姐妹的DNA样本可用的情况下(图1a)，我们可以得出结论，这种现象导致了一条染色体具有部分父系和部分母系等位基因。这一定是由受精后事件引起的，可能是同源物之间的有丝分裂交叉。我们假设这些病例实际上代表了HGPS早衰表型的“躯体拯救”事件。在这个假设下，这些成纤维细胞来源的个体最初在低分子量核酸。也许作为体内事件，或者可能作为在体外在成纤维细胞培养中，发生了有丝分裂交叉，产生了一个具有片段UPD的细胞，该细胞复制了野生型等位基因LMNA公司并失去HGPS突变。这样一个细胞可能会比它的邻居有增长优势。要证明这一假设，就需要接触死亡UPD患者的多个组织，但不幸的是，这些组织尚不可用。

我们也没有发现LMNA公司6-Mb缺失患者的基因(图1b). 我们认为这也可能是由于一次躯体救援事件——特别是，我们假设该患者最初是密码子608的杂合子LMNA公司突变，但在这种情况下，“拯救”涉及包含突变等位基因的6Mb的内部缺失，与1号染色体更复杂的镶嵌重排有关。最近的一项研究报告了一例经典HGPS，其中发现染色体1q23的明显间质缺失¹⁷我们从该患者身上获得了细胞和DNA，令人惊讶的是，存在典型的杂合G608G突变（数据未显示）。此外，我们还无法通过高分辨率染色体显带或FISH与跨越1q23–1q24区域的BACs确认存在间质缺失。这可能是另一个躯体拯救的例子，涉及原始报告中分析的细胞克隆中的间质缺失，但在同一患者的其他样本中没有出现。

先前对层粘连蛋白A的生化功能进行的广泛研究表明，这可能是一种致病机制。拉明A通常作为前体分子（前拉明A）合成。在C末端是一个CAAX-box基序，它受到法尼基化作用的影响。之后，发生内部蛋白水解裂解，去除最后18个编码氨基酸^18–20我们预测，第11密码子HGPS突变和随后的异常剪接将产生一个前层胺A，该前层胺仍保留CAAX盒，但缺少内蛋白裂解位点。也有证据表明，层粘连蛋白A的细胞周期依赖性磷酸化对其正常功能很重要，并且在异常的HGPS蛋白中至少有一个磷酸化位点（Ser 625）被删除²¹由于层粘连蛋白A在内核膜内形成多蛋白复合物，这种未完全加工的前层粘连素A很可能是显性阴性。

值得注意的是，最近在小鼠Zmpste24金属蛋白酶敲除中发现了前层蛋白A加工缺陷^22,23Zmpste24被认为参与前层蛋白A的蛋白水解过程，可能代表实际的内蛋白酶。Zmpste24的纯合敲除具有与HGPS患者的临床特征相似的表型，包括生长迟缓、心脏功能障碍导致的过早死亡（20周）和脱发。然而，还存在其他特征，如明显的骨质疏松症²³对这些动物细胞的免疫荧光实验显示，细胞核细长且不规则，核膜突出。老鼠击倒了Lmna公司该基因此前也有报道²⁴，表现出严重的产后生长迟缓、肌营养不良和类似的核异常。

为了探讨HGPS中结构核膜异常的可能性，用两种不同的抗层粘连蛋白A/C单克隆抗体对5例常见G608G突变的经典HGPS患者以及未受影响的父母的原代成纤维细胞进行了免疫荧光研究。来自受影响患者（AG11498）和未受影响父母（AG06299）的代表性数据如所示图3在48%的HGPS细胞中，我们发现核膜形状不规则(图3e–小时). 来自未受影响控件的单元格(图3a–d日)显示出这种表型的细胞显著减少（<6%）。为了确定这一结果不是HGPS和对照成纤维细胞培养物状态二次差异的人为结果，对来自与免疫荧光研究所用细胞相同的烧瓶的细胞进行了细胞周期差异（通过荧光激活细胞分析）和凋亡程度的监测。来自经典HGPS患者和未受影响的父母的细胞之间没有显著差异。

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图3

使用针对层粘连蛋白a/C的抗体JOL2，对患有典型HGPS的未受影响母亲和儿童的初级皮肤成纤维细胞进行免疫荧光。抗体XB10获得相同的结果（数据未显示）。一–d日，来自未受影响的母亲AG06299。e（电子）–小时，来自典型HGPS患者AG11498的结果。一,e（电子），抗层粘连蛋白A/C抗体。b条,（f）DAPI染色显示细胞核的位置。c（c）,克，抗体染色线粒体，显示胞浆分布。d日,小时，合并的图像一–c（c）(d日)和e（电子）–克(小时).

HGPS现在可以被添加到人类遗传疾病的长长列表中，这些疾病是由LMNA公司基因^三,4。由于大多数HGPS病例似乎有从头开始在同一密码子突变后，分子诊断应该几乎立即可行。这对于在出现完整临床表型之前对幼儿进行诊断尤其有用。分子诊断方法也可以在产前领域提供保证，现在可以解决父母体细胞嵌合体和未来妊娠疾病复发的可能性。最后，HGPS分子基础的发现表明其可能在LMNA公司在正常老化过程方面。寻找该基因中可能与异常长寿相关的常见变异将很重要，也许还需要探索是否存在LMNA公司在一生中积累，在衰老中起一定作用。□

方法

补充材料

致谢

脚注

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