核酸研究。2000年5月15日；28(10): 2164–2170.
突触体融合无线粒体DNA细胞克隆培养细胞中神经元线粒体DNA变体
杰弗里·奥尔森
分子医学和1美国佐治亚州亚特兰大市埃默里大学医学院神经外科，邮编30329
分子医学和1美国佐治亚州亚特兰大市埃默里大学医学院神经外科，邮编30329
一收件人：美国佐治亚州30322亚特兰大市克利夫顿路东北1462号420室分子医学中心，电话：+1 404 727 8368；传真：+1 404 727 8367；电子邮件：dwallace@gen.emory.edu现住址：澳大利亚墨尔本菲茨罗伊3065维多利亚游行41号圣文森特医院突变研究中心伊恩·特朗斯
收稿日期：1999年12月28日；2000年3月23日修订；2000年3月23日验收。
摘要
利用突触体杂交证实人脑中存在异质线粒体DNA序列变异。突触体包含一到多个线粒体，当与mtDNA-缺陷（ρ°）小鼠或人类细胞系融合时，可产生活的杂交细胞系。利用线粒体DNA COIII、ND3和tRNA的序列多态性证实了小鼠突触体杂交mtDNA的脑起源精氨酸基因。人类突触体杂交后代的大脑起源是用一种罕见的线粒体DNA证实的姆博I多态性。一名35岁女性大脑中的突触体融合导致71个突触体杂交。对这些杂交克隆的mtDNA控制区进行测序显示，核苷酸对（nps）301和309之间的聚C轨道中的Cs数量存在差异。3%的杂交克隆含有10个Cs的mtDNA，76%含有9个Cs，18%含有8个Cs和3%含有7个Cs。直接从患者脑组织中对线粒体DNA控制区进行PCR扩增、克隆和测序，获得了类似的结果，但从含有9个Cs的线粒体DNA的突触体杂交同质体中扩增和克隆控制区时，没有得到类似的结果。因此，我们在无需PCR的情况下从成人大脑中克隆恢复了mtDNA控制区长度变体，并在活培养细胞中建立了mtDNA变体。这证实了人类神经元中存在一些线粒体DNA异质性，并为研究其功能意义提供了机会。
简介
有人提出，随着年龄的增长，体细胞线粒体DNA突变在有丝分裂后组织中积累，可能是衰老和神经退行性疾病进展的重要因素(1). 在人类中进行的各种研究已经报道了与年龄相关的两种mtDNA缺失的积累(2–9)和碱替代(10–14)突变。在一项广泛的研究中，在35-40%的人脑mtDNA的对照区检测到碱基取代和小插入-缺失突变。最常见的变异是核苷酸对（nps）71（G）和309（C）处核苷酸同聚延伸的小插入-缺失突变。在nps 301和309之间的Cs范围内，据报告，30%的mtDNA失去了一个C，给出了9个Cs，而主要是10个Cs。此外，这种变异程度随着年龄的增长而增加，因为与28岁的大脑相比，96岁和99岁的大脑变异增加了7.7倍。相比之下，在tRNA周围编码序列的300-np区域中未发现体细胞mtDNA变异亮氨酸（UUR）基因(13).
关于体细胞线粒体DNA变异研究的一个关注点是，在检测异质性突变之前，线粒体DNA是从组织中进行PCR-扩增的。使用热稳定DNA聚合酶进行PCR扩增容易出错，因此可能在扩增过程中引入突变。为了避免这种担忧，我们开发了一种体细胞遗传程序，用于从小鼠和人脑中分离和克隆神经元线粒体DNA。含有脑线粒体的突触体与缺乏线粒体DNA的人和小鼠细胞（ρ°细胞）融合(15).
突触体来源于神经元突触束，在脑组织均质化过程中，突触束被夹断，形成膜结合的细胞质颗粒，其中包括线粒体。当与ρ°细胞融合时，大脑mtDNA被正常的DNA复制系统复制和扩增。因此，它们被忠实地复制并保持在生物活性状态。
在小鼠中，通过将脑匀浆与ρ°细胞融合，可以从大脑中回收线粒体DNA，一些杂交种据报道含有微量的缺失线粒体DNA，通过PCR扩增检测到(16). 然而，没有从供体小鼠中获得含有突变mtDNAs的稳定杂交。
在本研究中，我们报道了从小鼠和人脑中回收的神经元mtDNA，并表明24%来自人脑的杂交mtDNA在nps 301和309之间的控制区poly C轨迹长度不同。这证实了大脑中至少存在一些线粒体DNA异质性，并为表征其生化意义提供了机会。
材料和方法
细胞系和培养条件
通过暴露LM（TK）产生小鼠ρ°细胞系–)细胞转化为溴化乙锭（EtBr），如前所述(17,18)和人类(19)单元格。四个ρ°LM（TK–)通过暴露5×10分离克隆6在含有4.5 mg/ml葡萄糖、10%胎牛血清（FCS）和50µg/ml尿苷的DMEM中，将单个烧瓶中的细胞暴露于250 ng/ml EtBr中28天。10岁时克隆了一等分的细胞4细胞/培养皿置于含有100 ng/ml EtBr的相同培养基中。在额外的9周（EtBr治疗开始后13周）后，对5个克隆进行环隔离并测试尿苷依赖性。发现所有五个克隆都依赖尿苷和丙酮酸，如人类ρ°细胞所示(19). Southern杂交分析证实这些克隆缺乏可检测的线粒体DNA。ρ°LM（TK）的种群倍增率–)细胞长约72小时，比亲代细胞系长约10小时。ρ°细胞比含有mtDNA的细胞更呈梭形（ρ+)对映体、ρ°克隆与去核小鼠RAG细胞的融合以及在含有30µg/ml溴脱氧尿苷（BrdU）的无尿苷培养基中的选择产生频率为～10–4这些杂交后代的生长速度和形态与亲本LM（TK）相同–)行。人类143B-TK的ρ°导数–细胞系已在前面描述过(20).
突触体分离
小鼠研究用快速Percoll逐步颗粒法分离突触体(21). 对于小鼠，使用无菌技术从C57BL/6NNia雄性（NIA、Jefferson、AZ）中取出整个大脑，并立即转移到冷冻的SED分离培养基（0.32M蔗糖、1mM EDTA和0.25mM DTT，用稀HCl调节pH至7.4）中。冷却10分钟后，用剪刀将组织切碎，并在Dounce均质机中使用松散和紧密研杵各10次，在9 vol SED中均质。10%的匀浆在1000下离心克10分钟，去除细胞核和未破碎细胞，上清液用SED 1:1稀释。将两毫升上清液分层放置在六种梯度上，每种梯度由2毫升23、15、10和3%Percoll组成，用SED制备。梯度在32500下离心克5分钟（RC5B带SS-34转子，20 000转/分，4°C），不包括加速和制动时间。将23/15%Percoll界面处的部分抽吸合并，用0.3 M甘露醇（pH 7.4）稀释10倍，并在15000下离心克然后将松散的颗粒用于与ρ°细胞的电融合。
人体研究。从接受肿瘤切除手术的患者身上采集了三份新鲜人脑皮层样品，含量从0.2克到1.5克不等。外科医生将大体正常的组织从中央肿瘤块周围分离出来，并进行突触体融合处理。在另外三个实验中，在死亡后7-13小时获取尸检皮层样本。
杂交种的融合与选择
洗涤后的突触体部分与2×10结合6ρ°细胞，用0.3 M甘露醇（pH 7）清洗一次。将混合物在相同的培养基中培养至0.6 ml，并进行电融合(22). 在含有5%透析胎牛血清和50µg/ml BrdU的无尿苷DMEM中选择杂种。杂交克隆在6-8天后可见，在10-14天后分离。
小鼠线粒体DNA序列测定
从C57BL/6NNia大脑LM（TK）中提取基因组DNA–)细胞和小鼠突触体杂交采用蛋白酶K消化，然后苯酚-氯仿萃取和乙醇沉淀。使用附录中列出的mtDNA特异性引物对mtDNA测序区域进行PCR扩增。使用Centrion 100分离器（Amicon，Beverly，MA）纯化片段，并使用AmpliTaq FS DNA聚合酶和荧光染料终止剂化学，按照制造商推荐的方案进行循环测序（Prism Ready反应循环测序试剂盒，Applied Biosystems，加利福尼亚州福斯特市）和ABI Prism 377 DNA测序仪。
为了鉴定线粒体DNA序列多态性，共测序6.7 kb的C57BL/6NNia线粒体DNA，包括控制区、ND1基因的一部分以及COIII、ND3、ND4L、ND4和ND5基因。将这些序列与已发表的小鼠LA9 mtDNA序列进行比较(23)和LM（TK–)和LA9（Emory）小鼠mtDNA序列（表). 有趣的是，这三种mtDNA都被证明是不同的，尽管这两种小鼠都是LA9(24)和LM（TK–) (24)来源于相同的小鼠L929细胞(25). CS7BL/6NNia小鼠和LM（TK）之间的一级序列差异–)mtDNA包括np 9348处的G→a转变、np 9461处的T→C转变和tRNA中两个As的插入精氨酸nps 9818和9825之间的基因。然后使用这些变体分析杂交mtDNA。
表1。
小鼠突触体杂交中线粒体DNA序列变异的遗传
| 核苷酸位置 | 基因 | LA9线粒体DNA一参考序列 | LM（油箱–)n个= 1 | C57BL/6NNia型n个= 2 | 胞质杂种n个= 63 |
|---|
| 9348 | COIII公司 | A类 | A类 | 克 | 克 |
| 9461 | ND3号机组 | C类 | C类 | T型 | T型 |
| 9818–9825 | TRNA公司精氨酸 | 8安 | 10安 | 8安 | 8安 |
要筛选从头开始使用nps 15184到150的引物对小鼠突触体杂交细胞中的mtDNA突变进行PCR-扩增，该杂交细胞是一个1261-np片段，包含整个小鼠mtDNA控制区域。使用7对内部引物产生重叠片段，用于直接循环测序。
突触体杂交克隆中人类mtDNA控制区的序列分析
从每个人类突触体杂交后代中提取基因组DNA。对来自nps 15838至1064的线粒体DNA的1795-np区域进行PCR扩增，并使用重叠引物对整个控制区域（1121bp）进行循环测序。对大多数目标序列的两条链进行测序，并使用独立引物通过额外的序列分析解决歧义（见附录）。为71个独立的杂交克隆测定了整个控制区mtDNA序列。
人脑和突触体杂交mtDNAs的克隆
从35岁女性受试者的冰冻脑匀浆液中扩增出一段来自nps 242至636的线粒体DNA的394 bp片段，该匀浆液与用于分离突触体的匀浆液相同。该区域包含从np 301到309的可变poly C轨迹。将得到的DNA片段克隆到载体pCR2.1中，并转化为INVαF′细胞（TA克隆试剂盒，Invitrogen，Carlsbad，CA）。分离白色菌落，PCR扩增mtDNA片段，并使用用于扩增394bp片段的相同引物确定序列。共对102个克隆到质粒pCR21中的脑线粒体DNA进行了测序。
作为确定PCR扩增是否产生增加的mtDNA控制区序列变异的对照实验，对一个在nps 301和309之间含有9个Cs的杂交克隆的mtDNA进行PCR扩增并克隆到pCR2.1中。对得到的DNA克隆进行测序和比较。共有148个“对照”杂交克隆在np 301–309区域进行了测序。
引物延伸试验
从35岁女性受试者的大脑DNA以及她选择的突触体杂交后代和通过凝胶提取纯化的DNA（加利福尼亚州巴伦西亚市齐根市）中，扩增出一个包含控制区可变多聚C轨道的nps 242至770的528-np mtDNA片段。通过引物延伸反应使用32对应于nps 340–321（5′-GTGTTAAGTGGTTGGCCA-3′）的P标记寡核苷酸，延伸至聚C区的12 np范围内。每个反应混合物包含100 ng纯化PCR产物；3.2 pmol底漆；2.5 U热序列酶（Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ）；0.3 mM dNTP-mix含有dATP、dGTP、dCTP；和3 mM ddTTP，后者在poly C轨道后的基座处终止延伸。引物延伸产物使用Centri-Sep柱（普林斯顿分离公司，新泽西州阿德尔菲亚）纯化，并在7 M尿素，8%聚丙烯酰胺凝胶上分离。凝胶电泳2小时，通过暴露于X射线胶片5–8小时显示引物延伸产物32使用范围为37至40个nps的P标记寡核苷酸作为尺寸标准。
结果
突触体作为小鼠杂交后代中可行的线粒体DNA供体
从小鼠大脑中分离的突触体的电子显微照片显示，膜结合囊泡的均匀部分包裹着一到几个形态正常的线粒体（图。). 这些突触体与LM（TK）融合–)ρ°细胞系、LMEB4和在含有BrdU但缺乏尿苷的培养基中选择的杂交。当从在SED培养基中快速冷冻的新鲜处死小鼠脑中分离突触体时，杂交后代的产量一直很高，每2×10约200个克隆6ρ°细胞或~1/104ρ°单元格。当死后立即取出大脑，并在分离突触体之前在SED中冰冻4小时，也能获得高产量。然而，延迟大脑的切除，使尸体在4°C下保持4或24小时，会导致杂交频率急剧下降（100倍）。
小鼠大脑突触体部分的电子显微照片。完整的突触体占主导地位，其中大多数线粒体剖面为一到几个完整的。该组分是从一只6周龄的动物身上分离出来的，在加工前，尸体在4°C下存放4小时。放大倍数=×28 500。
通过检测nps 9348和9461的核苷酸多态性以及nps 9818到9825的poly-A轨道中As的数量，证实了小鼠突触体杂交mtDNA的脑起源，这两个位点在C57BL/6NNia脑供体mtDNA和LM（TK）之间存在差异–)受体mtDNA。共对63个突触体杂交种进行了这些标记物的测试，包括18个来自1.5月龄小鼠大脑的杂交种和45个来自34月龄小鼠脑的杂交种。所有突触体杂交都发现有C57BL/6NNia mtDNA的变异，而不是LM（TK）的特征–)mtDNA（表). 对杂种的控制区进行测序，没有发现其他序列变异。因此，在小鼠突触体杂交中，LM（TK–)ρ°细胞总是以C57Bl/6NNia脑mtDNA重新填充，证实小鼠mtDNA可以通过杂交融合从脑组织中恢复。
突触体融合在人脑中显示MtDNA异质性
人类突触体杂交体是从新获得的手术标本中分离的突触体中制备的，并与143B-TK融合–ρ°细胞，在含有BrdU但缺乏尿苷的培养基中选择Cybridges。在一项使用一名35岁女性0.2g额叶皮层的实验中，获得了约200个克隆，或约1/104ρ°单元格。然而，在另外两个使用1.1或1.5克大脑的实验中，分别获得了五个和三个克隆。三次尝试使用尸检样本分离突触体杂交后代只得到一个克隆。
使用姆博np15397处的I限制性片段长度多态性（RFLP）（图。). 在包含nps 15005–15701的PCR片段中，人脑供体mtDNA缺乏这一点姆博我定位并给出234-np姆博I片段，而亲本143B-TK的mtDNA–细胞有这个位点，因此234-np片段被切割成195-np和39-np片段。对三个独立的突触体杂交克隆进行了检测，发现它们只含有来自大脑的线粒体DNA（图。). 因此，人类突触体杂交后代也会被大脑mtDNA重新填充。
人类突触体杂交mtDNA的脑起源。用聚合酶链式反应（PCR）扩增了从nps 15005到15701的线粒体DNA区域，并用姆博I和限制性片段在3%琼脂糖凝胶中电泳。大脑和杂交克隆的限制模式与143B-TK不同–细胞mtDNA由于np15397处的核苷酸多态性，a→G转换。大多数人类mtDNA缺乏这个位点，产生234个np片段，而143B-TK片段–mtDNA有该位点，并给出195和39个np片段（如右图所示）。脑中np 15397位点和cybridge mtDNA的存在证实了cybridges mtDNA来源于脑组织。143B-TK的两条车道–细胞系显示亲本系（左）和一个亚克隆，随后产生ρ°克隆（右）。该mtDNA PCR产物无法从143B-TK的DNA中扩增–ρ°克隆。
突触体克隆揭示了人脑线粒体DNA的异质性
对来自这名35岁女性大脑的71个突触体cybridges的mtDNA控制区的序列分析显示，nps 301和309之间的poly C轨道中的Cs数量存在克隆变异。在71个突触体杂交组合中，大多数（76%）含有9个Cs的线粒体DNA，比剑桥参考序列多出2个Cs(26). 由于已知该poly C区域的长度在个体之间有所不同(27)，9个C基因型可能代表该女性的生殖系序列。其余24%的杂交克隆的Cs数量不同，其中3%有10个Cs（比参考序列多3个，+3），18%有8个Cs，3%有7个Cs。
通过直接从受试者大脑DNA中扩增、克隆和测序mtDNA控制区，证明nps 301-309处的Cs数量分布反映了大脑中预先存在的mtDNA序列变异。这基本上揭示了多C长度变体的分布与杂交种相同，其中73%具有9个，4%具有10个，19%具有8个，4%有7个C。为了证实Cs的这种分布不是由PCR或克隆伪影引起的，用PCR扩增了同一区域，并从一个仅含有模式九C mtDNA序列的突触体杂交克隆中克隆了该区域。这导致只有4%的变异克隆，其中1%有10个，96%有9个，3%有8个C（表).
表2。
人类突触体杂交后代和大脑中多C轨迹长度的变化
| 编号C介于np 301和309之间 | 突触体杂交 | 大脑克隆 | 控制克隆 |
|---|
| | | 克隆数量 | (%) | 克隆数量 | (%) | 克隆数量 | (%) |
|---|
| 7 | (+0)一 | 2 | (2.8) | 4 | (3.9) | 0 | |
| 8 | (+1)一 | 13 | (18.2) | 19 | (18.6) | 5 | (3.4) |
| 9 | (+2)一 | 54 | (76.1) | 74 | (72.5) | 142 | (95.9) |
| 10 | (+3)一 | 2 | (2.8) | 4 | (3.9) | 1 | (0.7) |
| 11 | (+4)一 | 0 | (0) | 1 | (1.0) | 0 | (0) |
通过引物延伸分析证实了不同突触体杂交克隆之间np 301–309 poly C轨道的长度变化。在Cs序列附近退火一个引物，并延伸穿过Cs到第一个A，其中延伸通过加入ddTTP终止。然后通过凝胶电泳测定所得片段的长度。引物延伸分析显示，每个杂交克隆都含有一个主要的mtDNA，其np 301–309 poly-C轨道由七个Cs（0）、八个Cs+1、九个Cs+2或10Cs（+3）组成（图。). 因此，每个杂交克隆都给出了该克隆mtDNA序列预测的引物延伸片段长度。
通过引物延伸确认人类突触体杂交中np 301–309 poly C轨道长度的变化。通道1–11代表来自35岁女性大脑的单个突触体杂交克隆的mtDNA的引物延伸产物。下图中的数字表示克隆中包含的相对于剑桥序列的额外Cs数。大脑供体的生殖系mtDNA可能含有9个Cs（比剑桥序列或+2多2个），如第10和11道的杂交后代所示。
讨论
突触体杂交使我们能够在不进行PCR扩增的情况下从新鲜人脑组织中恢复体细胞线粒体DNA突变。在一名35岁女性脑组织中分离出的突触体杂交后代中，我们发现nps 301和309之间的Cs数量有24%的差异，相对于9个Cs的优势种系数量，因此很可能是种系数量。我们的结果与一篇已发表的论文一致，该论文报告称，通过PCR扩增、克隆和测序直接从人脑DNA获得的线粒体DNA控制区克隆中，约30%的Cs数量在nps 301和309之间存在变异(13). 因此，突触体杂交和PCR扩增都证实了大脑中线粒体DNA控制区长度变异的异质性。
虽然这项研究证明人类大脑中确实存在线粒体DNA序列变异，但其水平却低得惊人。除了np 301–309长度多态性外，在检测的71个人类和63个小鼠突触体cybridges中没有发现其他控制区序列变体。这与5.6×10形成了鲜明对比–4在老年受试者大脑中发现的控制区mtDNA核苷酸变体的频率(13)以及在老年人成纤维细胞mtDNA控制区发现的特定核苷酸变体的流行(14)均通过PCR扩增、变性梯度凝胶电泳、克隆和测序进行分析。64岁以上受试者一半以上的成纤维细胞中均未发现T414C变异体(14)也不是百岁老人成纤维细胞中发现的T146C和T195C变体(14)和一个96岁老人的大脑(13)在我们的任何突触体杂交中都观察到了。然而，由于我们的人脑突触体来源于一名35岁的供体，显然需要进行更广泛的突触体杂交研究，以准确评估随着年龄增长而在人类和哺乳动物大脑中积累的体细胞mtDNA突变的频率和性质。
为了最大化突触束mtDNA的采样，我们检查了与脑样本采集和处理相关的几个参数。我们发现，虽然突触体杂交体很容易从新鲜大脑中获得，但很难从死后的大脑标本中分离出活的突触体。小鼠系统证实了这一点，当小鼠大脑在死后4小时恢复时，杂交频率急剧下降。然而，如果立即移除脑组织并将其置于冰镇隔离介质中，则在移除脑组织后4小时内可以成功分离和融合突触体。
在最近的一份报告中(16)，小鼠ρ°细胞与核后颗粒融合（17000克×20min），并使用聚乙二醇促进融合。本研究的杂交种产量比我们的低约100倍。使用我们的方法获得更高的杂交产量可能是由于使用了同质突触体部分和/或使用了电融合而不是PEG。
突触体方法用于评估大脑中体细胞线粒体DNA变异程度的一个巨大优势是，它允许突变线粒体DNA在培养细胞中克隆繁殖。这使得线粒体DNA保持其生物活性形式，从而可以表征体细胞线粒体DNA突变的生化后果。
因此，突触体杂交为我们提供了一个独特的机会来确定哺乳动物和人脑中随年龄增长而积累的体细胞mtDNA突变的数量和功能后果。
附录
PCR扩增条件
小鼠mtDNA的扩增是通过在94°C下进行1分钟的初始变性和30个94°C变性周期30秒，然后在55–65°C下退火45秒，在72°C下延伸45–120秒来实现的。
人类mtDNA的扩增使用94°C变性温度1分钟和35个94°C周期变性45秒，然后在49–55°C退火45秒，在72°C延伸45–120秒。
对于测序，使用片段引物或上述内部引物。
A.用于扩增小鼠突触体杂交mtDNA的引物
| 底漆对 | 底漆坐标 | 引物序列 |
|---|
| | (5′→3′) | |
|---|
| 1 | 15184–15216 | 5′-CTACTTCTGAGTACATAAATTTACATAGTAC-3′ |
| | 150–125 | 5′-TAAGGATTTTACACCGGTCTATA-3′ |
| 2 | 14877–14898 | 5′-CACAGACTAGAGACCCA-3′ |
| | 150–125 | 5′-TAAGGATTTTACACCGGTCTATA-3′ |
| 三 | 2716–2790 | 5′-ccttttcccagaggttcaacct-3′ |
| | 4033–4009 | 5′-AATTGCTAGTAGGCTGAATTCTAGG-3′ |
| 4 | 8861–8880 | 5′-ATTCATCGTCTCGGAAGTAT-3′ |
| | 11840–11821 | 5′-GTACAGTGGGAAGTTGATGT-3′ |
| 5 | 11697–11706 | 5′-TAGTATCCATTGGTCTTAGGAACCAA-3′ |
| | 14207–14183 | 5′-GGCAGGTAGGTCAATGATGAGG-3′ |
| 6 | 8861–8880 | 5′-ATTCATCGTCTCGGAAGTAT-3′ |
| | 10381–10362 | 5′-GGCAGTAATCAGGCTGTTAA-3′ |
B.用于小鼠突触体杂交mtDNA测序的引物
| 底漆 | 底漆坐标 | 引物序列 |
|---|
| | (5′→3′) | |
|---|
| 1 | 15431–15459 | 5′-CATAGTACAACAGTACTATTATGTATC-3′ |
| 2 | 15771–15791 | 5′-ACTTATCAGACACATCTGTTC-3′ |
| 三 | 16285–16257 | 5′-TTATTGCGTAATAGAGTATGAGTT-3′ |
| 4 | 13853–13834 | 5′-CTGCTATAGCTACTGAGAA-3′ |
| 5 | 15630–15611 | 5′-GACTGTATGTATGCAG-3′ |
| 6 | 15407–15438 | 5′-CTACTTCTGAGTAATAAATTTACATAGTAC-3′） |
| 7 | 15630–15611 | 5′-GACTGTATGTATGCAG-3′ |
| 8 | 15771–15791 | 5′-ACTTATCAGACACATCTGTTC-3′ |
| 9 | 222–201 | 5′-TGTGGCTAGGCAGAGAGAGGTCTTA-3′） |
| 10 | 3351–3370 | 5′-ACAGAAGAGAATCAGAATT-3′ |
| 11 | 3500–3481 | 5′-ATTGATAGTAGGTC-3′ |
| 12 | 9415–9442 | 5′-CTGACTTTCCAATTAGTAGATCTTGAATA-3′ |
| 13 | 11586–11561 | 5′-TCCTGTGTCAGATTCTAAT-3′ |
| 14 | 10261–10280 | 5′-TTAGTTAACCACCTAACA-3′ |
| 15 | 8950–8931 | 5′-CAGCCTCCTAGATCATGT-3′ |
| 16 | 9561–9538 | 5′-GATTTGCTTCTGAGTACAGATTA-3′ |
| 17 | 9203–9224 | 5′-GGCTACTGGATTCCATGGACTC-3′ |
| 18 | 9571–9590 | 5′-GCGGATTCGACCCTACAGC-3′ |
| 19 | 9943–9920 | 5′-AGCGAAATATAAGTGTCCTAGA-3′ |
| 20 | 9415–9442 | 5′-CTGACTTTCCAATTAGTAGATCTTGAATA-3′ |
| 21 | 14520–14545 | 5′-TTTATAGGCTACGTCTTCCATGAGG-3′ |
| 22 | 12251–12232 | 5′-GATGTGTGTAGCGCTCAG-3′ |
| 23 | 12804–12785 | 5′-GGATGTCTGTTCGTCTGCC-3′ |
| 24 | 13183–13159 | 5′-GGTATGTGAGACTGGAATGCTGG-3′ |
| 25 | 13641–13616 | 5′-GCGACATATAGTGTGCTACTG-3′ |
C.用于扩增人类突触体杂交mtDNA的引物
| 底漆对 | 底漆坐标 | 引物序列 |
|---|
| | (5′→3′) | |
|---|
| 1 | 15838–15857 | 5′-CCTAATACCAACTATCTCCC-3′ |
| | 1064–1045 | 5′-GTCTTAGCTATTTGTGTTC-3′ |
D.用于人类突触体杂交mtDNA测序的引物
| 底漆 | 底漆坐标 | 引物序列 |
|---|
| | (5′→3′) | |
|---|
| 1 | 240–221 | 5′-TATTATGTCCTACAAGC-3′ |
| 2 | 1–20 | 5′-GATCACAGGTCTATACCCT-3′ |
| 三 | 636–617 | 5′-TGATGTGGAGCCCGTCTAAAC-3′ |
| 4 | 429–408 | 5′-CTGTTAAAAGTGCATACCGCCA-3′ |
| 5 | 242–261 | 5′-caattgaatgttctgcacagc-3′ |
| 6 | 16225–16244 | 5′-AACTATACACATCAACTG-3′ |
| 7 | 16501–16843 | 5′-ATGTCGATACAGTTCAC-3′ |
| 8 | 16547–16527 | 5′-GGAACGTGTGGCTATTAGG-3′ |
E.用于生产人脑mtDNA细菌克隆的引物
| 用于克隆的模板片段： |
|---|
| 底漆对 | 底漆坐标 | 引物序列 |
|---|
| | (5′→3′) | |
|---|
| 1 | 242–261 | 5′-caattgaatgttctgcacagc-3′ |
| | 636–617 | 5′-TGATGTGGAGCCCGTCTAAAAC-3′ |
致谢
作者谨对斯蒂芬妮·莱特利尔和肖恩·利维的技术援助表示感谢。这项工作得到了NIH授予D.C.W.的AG13154、HL45572和NS21328拨款的支持。
参考文献
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