前线公共卫生。2023; 11: 1247294.
SIRT1介导的BDNF–TrkB信号通路在氟中毒脑损伤及学习记忆效应机制中的探讨
,1,2,† ,三,† ,1,† ,2 ,2 ,2 ,2 ,2 ,三 ,4 ,1,5,* ,1,*和1,4,* 王飞青(Feiqing Wang)
1天津大学医学工程与转化医学研究院,天津,中国
2贵州中医药大学第一附属医院医学研究中心,贵州省贵阳市
李彦菊
三中国贵州省贵阳市贵州医科大学附属医院血液科
东辛汤
1天津大学医学工程与转化医学研究院,天津,中国
杨波(Bo Yang)
2贵州中医药大学第一附属医院医学研究中心,贵州省贵阳市
Tingting Tian(田婷婷)
2贵州中医药大学第一附属医院医学研究中心,贵州省贵阳市
蒙县田
2贵州中医药大学第一附属医院医学研究中心,贵州省贵阳市
那蒙(Na Meng)
2贵州中医药大学第一附属医院医学研究中心,贵州省贵阳市
魏燮
2贵州中医药大学第一附属医院医学研究中心,贵州省贵阳市
张菊科(Chike Zhang)
三中国贵州省贵阳市贵州医科大学附属医院血液科
何志旭
4国家和贵州省细胞工程与生物医学技术联合工程实验室,贵州省贵阳市
朱晓东
1天津大学医学工程与转化医学研究院,天津,中国
5天津医科大学总医院神经研究所,天津,中国
董明
1天津大学医学工程与转化医学研究院,天津,中国
杨柳
1天津大学医学工程与转化医学研究院,中国天津
4国家和贵州细胞工程与生物医学技术联合工程实验室,中国贵州省贵阳市
1天津大学医学工程与转化医学研究院,天津,中国
2贵州中医药大学第一附属医院医学研究中心,贵州省贵阳市
三中国贵州省贵阳市贵州医科大学附属医院血液科
4国家和贵州省细胞工程与生物医学技术联合工程实验室,贵州省贵阳市
5天津医科大学总医院神经研究所,天津,中国
通讯作者。 编辑:Leonardo Oliveira Bittencourt,巴西帕拉联邦大学
审核人:埃及开罗大学Asmaa ShamsElden;巴西帕拉联邦大学Luanna Melo Pereira Fernandes
†这些作者对这项工作做出了同样的贡献
收到日期:2023年6月25日;2023年8月16日验收。
版权©2023王、李、唐、杨、田、田、孟、谢、张、何、朱、明和刘。 这是一篇根据知识共享署名许可证(CC BY)条款发布的开放存取文章。允许在其他论坛上使用、分发或复制,但前提是原创作者和版权所有人得到了认可,并且根据公认的学术惯例引用了本期刊中的原始出版物。不允许使用、分发或复制不符合这些条款的内容。
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摘要
介绍
氟化物被认为是一种严重影响生物体和生态系统的环境污染物,其危害是一个永恒的公共卫生问题。氟的毒性作用包括细胞器损伤、氧化应激、细胞周期破坏、炎症因子分泌、凋亡诱导和突触神经传递破坏。为了揭示氟中毒性脑损伤的机制,我们分析了SIRT1介导的BDNF–TrkB信号通路级联反应在氟中毒性大脑损伤中的分子机制和学习记忆功能体内实验。
方法
本研究使用50 mg/L、100 mg/L和150 mg/L氟化物构建饮水型氟中毒大鼠模型,并观察大鼠氟斑牙的发生情况。随后,我们测定了大鼠血液、尿液和骨骼中的氟含量,并测量了大鼠的学习和记忆能力。此外,还检测了氧化应激产物、炎症因子水平、乙酰胆碱酯酶(AchE)和胆碱乙酰转移酶(ChAT)活性。观察大鼠骨骼和脑组织的病理结构变化。用免疫印迹法测定SIRT1、BDNF、TrkB和凋亡蛋白水平。
结果
氟暴露组大鼠均出现氟斑牙;学习和记忆能力下降;与对照组相比,尿氟、骨氟、血氟、氧化应激产物和炎症因子水平较高。氟暴露大鼠脑组织AchE和ChAT活性异常,海马神经元排列稀疏,细胞边界模糊,星形胶质细胞明显减少,细胞肿胀。此外,暴露于氟化物的大鼠脑组织中没有核仁,也含有折叠的神经元膜、变形的线粒体、无嵴、空泡形成以及致密和染色质过深。与对照组相比,氟暴露组SIRT1、BDNF和TrkB蛋白水平较低,凋亡蛋白水平较高,这与氟剂量密切相关。研究结果表明,过量的氟化物会导致大脑损伤,并影响学习和记忆能力。
讨论
目前,对氟中毒引起的组织损伤尚无有效的治疗方法。因此,控制氟摄入量是防治氟中毒损害的有效方法。
关键词:氟中毒、脑损伤、氧化应激、炎症因子、SIRT1/BDNF/TrkB、学习记忆能力
1.简介
氟中毒是一种由长期摄入过量氟化物引起的全身性疾病。氟中毒发生在全球50多个国家和地区,包括中国、印度、孟加拉国、阿尔及利亚、泰国、伊朗、阿根廷、美国、加拿大、越南、墨西哥、斯里兰卡、摩洛哥、埃及和南非(1). 氟中毒是一个全球公共卫生问题,全世界有2.6亿多人从高氟浓度的水源获得饮用水(2). 中国受到氟中毒的严重影响,几乎所有省份和自治区都有不同程度的氟中毒,受威胁的人口达1.1亿(三,4). 因此,氟中毒目前是中国的一个重要健康问题。
氟中毒不仅严重损害骨骼和牙齿,还对肝脏、肾脏、胃肠道、神经系统、心血管系统、内分泌系统和生殖系统等非骨组织造成不同程度的损害(5–7). 由于缺乏有效的氟中毒治疗药物,氟中毒地区的人们仍然易患氟中毒。因此,目前医学研究的重点是氟中毒的发病机制和预防措施。
氟是一种化学性质极为活跃的元素。过量摄入氟化物可能会直接攻击氧气,干扰氧气代谢,并导致氧自由基增加(8,9). 同时,氟化物还会降低抗氧化酶活性和非酶促抗氧化物质含量,所有这些都会导致过量的氧自由基产生(10,11). 氟自由基可以攻击不饱和脂肪酸的共价键,导致脂质过氧化,增加体内的自由基(12). 氟中毒引起的自由基代谢失衡和大量氧化应激产物的积累导致器官功能障碍是一个永恒的研究热点。氧化应激损伤也促进体内炎症因子的产生(13,14). 目前,氧化应激炎症因子水平已被确定为体内氟中毒损害的生物标志物(15).
氟可以通过血脑屏障进入大脑,长期摄入过量氟会导致氟在大脑中蓄积,影响脑细胞的正常生理功能(16). 氟化物积累会损害神经系统,包括神经病理学改变、胆碱能神经系统异常、神经细胞膜结构改变、神经递质受体改变、神经细胞凋亡和智力下降(17). 几个国家证实了地方性氟中毒地区儿童智力的变化(18). 过量的氟化物会对任何年龄段的人产生有害影响,这种毒性损害是不可逆转的,尤其是对发育中的儿童具有神经毒性(19).
氟化物也是信号转导途径中的重要物质(20). 脑细胞凋亡可以通过减少沉默信息调节器1(SIRT1)和脑源性神经营养因子(BDNF)的表达来诱导,SIRT1调节下游BDNF(21). SIRT1通过去乙酰化参与氧化应激、炎症反应、神经保护和其他效应(22). BDNF主要分布于中枢神经系统,参与神经生存和保护,BDNF水平升高可改善学习和记忆功能障碍(23). BDNF与受体酪氨酸蛋白激酶B(TrkB)作为配体结合后,激活细胞内TrkB及其下游信号蛋白磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B途径(24). PI3K–Akt途径激活激活有丝分裂原活化蛋白激酶-核因子κB(MAPK–NF-κB)的多重级联反应。这些途径控制神经细胞的生存、生长和分化(25). BDNF–TrkB保护大脑组织细胞免受损伤,并参与学习和记忆形成。目前,对氟中毒和脑损伤相关机制的研究很少。因此,我们分析了SIRT1介导的BDNF–TrkB信号通路与氟中毒脑损伤、学习记忆的关系,为氟中毒脑损害的防治提供了新的思路和理论依据。本研究的流程图如下所示.
2.方法和材料
2.1. 动物模型的构建
我们使用了中国贵阳贵州医科大学动物实验中心提供的无致病性雄性Sprague-Dawley大鼠(100-120 g,断奶后两周)[证书编号SCXK(Qian)2021-0001]。将大鼠关在环境温度为20–25°C、湿度为60%±20%的房间内,并暴露于12小时的光-暗循环中。
氟化物暴露剂量设计参考了亚慢性毒性实验要求,其中最高剂量通常为试验物质中位致死剂量(LD50)的5-20%。氟化物的LD50浓度为1500 mg/L。根据先前的实验结果和文献,本研究中的氟化钠暴露剂量为50 mg/L、100 mg/L和150 mg/L(Zhanwang Chemical Reagents,Wuxi,China)。大鼠适应性喂养1周,随机分为4组(共80只,每组20只):对照组(纯净水)、低氟组(50 mg/L氟化钠水)、中氟组(100 mg/L氟化钠水)和高氟组(150 mg/L氟化物水)。大鼠的生长和发育记录了90天的氟暴露。然后,在麻醉诱导后处死大鼠,快速采集血液和脑组织,并将其储存在−80°C下。所有动物实验均获得贵州中医药大学附属第一医院动物伦理委员会批准(批准文号:AHQU20210515A)。
2.2. 测试指标
2.2.1. 体重
在处死大鼠之前,使用电子天平(中国北京华智科学仪器公司)连续10天称量它们的体重,并记录它们的体重。
2.2.2. 氟斑牙
每周观察大鼠牙齿的变化,以确定损伤程度,并在牙齿被杀死前对其进行拍照。根据中国《氟斑牙诊断标准》(WS-T208-2011),氟斑牙分为四个等级:正常(釉质半透明、乳白色,表面光滑有光泽)、,轻度(牙齿表面小而白垩的不透明区域,牙齿表面的某些部分磨损,上颌前牙偶尔模糊和着色),中度(整个牙齿表面覆盖着白垩不透明区,可以看到独立的蜂窝状缺陷,牙齿有明显磨损),严重[釉质表面严重受损,明显发育不全,釉质缺损融合(呈带状或片状),牙齿表面颜色广泛,颜色从棕色到近黑色不等,牙齿经常呈现侵蚀状外观]。
2.2.3. 学习记忆能力评估
莫里斯水迷宫实验在实验结束前7天进行,分为定向导航实验和空间探索实验。水箱直径120 cm,高50 cm,水深30 cm,水温保持在26°C±1°C。池壁上标记了四个等距点[北(N)、东(E)、南(S)、西(W)]作为实验起点。游泳池分为四个象限(西北、西北、东南、英格兰),其中任何一个象限位于平台中心(平台与池壁中心的距离相等)。平台无色透明(直径:12厘米,高度:29厘米),被淹没在水下1厘米。将两袋奶粉溶解在每个实验用水中,使平台隐形。水池周围粘贴了丰富的参考线索(如三角形、正方形、圆形、菱形和各种象限中的其他几何形状),并保持不变,供老鼠用来定位平台。实验期间保持了安静和持续照明。
在航行实验中,将大鼠从面向池壁的不同象限放置在水中,观察大鼠从入口点找到平台所需的时间(逃逸潜伏期)和航行轨迹。如果大鼠在60秒内没有找到平台,则人工将其引至平台并在那里停留15秒。此时,孵化期计算为60s、 计算机连续五天智能记录检测结果(中国科学院药学研究所MWM图像自动采集与处理系统,中国北京)。
在空间探索实验的第6天(测试大鼠对原始平台的记忆),移除平台,将大鼠从平台的相对象限放入水中。记录大鼠在60 s内穿过平台的次数以及它们停留在平台所在象限的时间。
2.2.4. 骨骼病理学
在杀死大鼠后,取右股骨头。仔细取出肌肉组织,然后用磷酸盐缓冲盐水清洗股骨,并将其固定在4%多聚甲醛溶液中24小时。随后,从多聚甲醛溶剂中取出股骨,用蒸馏水清洗三次,转移到含有EDTA的脱钙溶液中,并处理3-4周。脱钙溶液软化或对针头没有抵抗力后,将骨组织从脱钙溶液中取出。然后,用蒸馏水清洗骨组织3-4分钟,脱水,石蜡包埋,切片,染色(苏木精-伊红,HE)。在光学显微镜下(德国威兹拉莱卡),放大200倍观察骨组织的形态学变化。
2.2.5. 尿氟水平
在杀死大鼠之前,在代谢笼中收集24小时内排出的尿液。然后,将10 mL尿液置于尿沉渣管中并离心(1500×克,5分钟,室温)。收集上清液,并使用氟离子选择电极(中国上海精密科学仪器公司)测量氟含量。
2.2.6. 骨氟水平
杀死大鼠后,取下右股骨,并取出肌肉和脂肪。然后,在105°C的烘箱中干燥股骨。高温灰化后,使用氟离子选择电极(精密科学仪器)测量股骨中的氟含量。
2.2.7. 血清氟化物水平
麻醉诱导后从大鼠股动脉采集血液。将样品置于冰上30分钟,离心(1500×克,10min,室温),血清低温保存。使用氟离子选择电极(精密科学仪器)测定血液中的氟含量。
2.2.8. 血液中的氧化产物水平
麻醉诱导后从大鼠股动脉采集血液,置于冰上30分钟,离心(1500×克,10min,室温),血清低温保存。采用5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)法测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平。总抗氧化能力(T-AOC)由铁测定3+还原方法。用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性。采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量。检测试剂盒来自建城生物工程研究所(中国南京),具体实验步骤严格按照制造商的说明进行。
2.2.9. 大脑中的炎症因子水平
老鼠被杀后,脑组织很快被切除。以1:9的质量体积比加入生理盐水溶液,并将整个脑组织均匀地放在冰块上。将混合物彻底混合并离心(1500×克,10 min,室温),并抽吸上清液。采用双抗体一步法夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)测定白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6水平。检测试剂盒来自建城生物工程研究所,具体实验步骤严格按照制造商的说明进行。
2.2.10. 脑内乙酰胆碱酯酶(AchE)和胆碱乙酰转移酶(ChAT)活性
老鼠被杀后,脑组织很快被切除。以1:9的质量体积比加入生理盐水溶液,并在冰块上使海马组织匀浆。离心后,除去0.8mL上清液,加入1.4mL纯化水,充分混合。然后,添加0.2 mL硫酸毒扁豆碱(1.54 mmol/L),并缓慢滴加0.8 mL三氯乙酸(1.84 mol/L)。将混合物彻底混合并离心(1500×克,10 min,室温),并使用波长为540 nm、直径为1 cm的紫外可见分光光度计测定上清液的吸光度,其中纯化水用作零点。严格按照试剂手册的具体步骤要求,采用比色法检测脑组织中的AchE和ChAT。检测试剂盒来自建城生物工程研究所。
2.2.11. 大脑的病理形态学
大鼠被杀后,脑组织被迅速移除,并在聚甲醛溶液中固定2天。随后,将组织脱水,包埋在石蜡中,切片,并用HE染色。在光学显微镜(Leica)下,放大200倍观察脑组织的形态学变化。
2.2.12. 脑超微结构
老鼠被杀死后,含有海马体的脑组织被迅速移除并放在冰上。然后,用锋利的刀片切除约1mm的脑组织,并立即将其浸入4°C的固定液(3%戊二醛、1.5%聚甲醛、0.1M磷酸盐缓冲液,pH 7.2)中数天或≥2小时。超薄(70-80nm)切片在浸泡和树脂包埋后制备(Epon 812;Solarbio,中国北京)。切片用二氧化铀醋酸盐和柠檬酸铅染色,并在透射电子显微镜下拍照(H-600;日本东京日立)。
2.2.13. 蛋白质印迹
老鼠被杀死后,含有海马体的脑组织被迅速移除。使用蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、苯甲基磺酰氟(Solarbio)和放射免疫沉淀分析裂解缓冲液从海马提取总蛋白。使用Solarbio系统在6-12%的凝胶上通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量的蛋白质。然后,将蛋白质转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(0.45μM;Millipore,Bedford,MA,USA),在室温下用5%脱脂牛奶封闭1小时。然后用抗以下蛋白的初级抗体(1:1000稀释,均来自中国上海Beyotime Biotechnology)对PVDF膜进行检测:BDNF、TrkB、SIRT1、BAX、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、caspase-3、叉头盒蛋白O1(FOXO1A)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、NF-κB、PI3K、Akt和MAPK。然后,用山羊抗兔和山羊抗鼠辣根过氧化物酶偶联二级抗体(1,5000稀释;中国武汉博斯特生物技术公司)对膜进行检测,并在4°C下培养过夜。第二天,用Tris缓冲盐水-Tween 20(Solarbio)冲洗PVDF膜三次,并在室温下用山羊抗兔或山羊抗鼠辣根过氧化物酶结合二级抗体孵育2小时。最后,将超灵敏电化学发光试剂与免疫反应蛋白带上的底物(Boster Biotechnology)一起使用。根据GAPDH水平标准化的灰度值,使用ImageJ(美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院)对蛋白质带进行量化。
2.3. 统计分析
使用Prism 8.3.1(GraphPad,加利福尼亚州圣地亚哥,美国)进行统计评估。数据为平均值±标准偏差。采用单因素方差分析进行组间比较,并进一步进行多重比较。方差均匀的采用LSD-t检验,方差不均匀的采用Dunnett T3分析。第页 < 0.05被认为是显著的。
3.结果
3.1. 氟中毒大鼠模型的建立
氟暴露大鼠的体重比对照大鼠大,但这些差异不显著(第页 > 0.05) (). 对照组大鼠没有患氟斑牙,而所有接触氟的大鼠都有。随着氟暴露剂量的增加,氟斑牙主要为中重度。氟暴露组(50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L)中轻度、中度和重度氟斑牙的比例分别为5%、70%和25%(n个 = 1, 14, 5), 0, 35, 65% (n个 = 0、7、13)和0、10、90%(n个 = 分别为0、2、18)(,). 光镜检查显示,对照组大鼠股骨小梁排列有序,连接良好,数量适中,厚度均匀。与对照组相比,氟暴露大鼠的股骨小梁骨紊乱、增厚,间距较小。此外,随着氟剂量的增加,骨损伤逐渐加重().
氟中毒动物模型的建立。(A)大鼠体重(n=10)。(B)氟斑牙大鼠数量(n个 = 20).(C)大鼠氟斑牙程度。(D)大鼠股骨HE染色病理切片(比例尺=100μm,×40,n个 = 10).
3.2. 氟化物含量
与对照组相比,氟暴露组的尿液、骨骼和血清中的氟含量显著高于对照组(第页 < 0.05). 此外,随着氟摄入量的增加,暴露大鼠尿液、骨骼和血液中的氟含量逐渐增加,且差异具有统计学意义(第页 < 0.05) ().
体内氟含量。(A)尿氟水平。(B)骨骼中的氟含量。(C)血清氟含量**第页 < 0.05与对照组*第页 < 0.05 vs.氟化物组,n个 = 10
3.3. 学习和记忆能力
采用MWM实验检测脑损伤大鼠的学习记忆能力。定位导航试验表明,与对照大鼠相比,氟暴露大鼠的逃避潜伏期显著延长(第页 < 0.05) (). 空间探索实验表明,与对照组大鼠相比,接触氟化物的大鼠首次穿越平台所需时间显著延长,穿越平台的次数显著减少,穿越平台区域所需时间明显缩短(第页 < 0.05) (,). 在氟暴露大鼠中,初始平台穿越时间逐渐延长,平台穿越次数和原平台区域象限停留时间随着氟暴露剂量的增加而逐渐减少。中、高、低氟组之间的差异具有统计学意义(第页 < 0.05),证明了剂量-效应关系().
氟中毒对大鼠学习记忆能力的影响。(A)逃生延迟。(B)穿越了时代月台。(C)停留时间**第页 < 0.05与对照组*第页 < 0.05 vs.氟化物组,n个 = 10
3.4. 血清中的氧化因子
与对照组相比,氟暴露组的血清GSH-Px、T-AOC和SOD活性显著降低(第页 < 0.05) (–). 氟暴露大鼠的血清MDA含量显著高于对照大鼠(第页 < 0.05) (). 在氟暴露组中,血清GSH-Px、T-AOC和SOD水平随着氟剂量的增加而逐渐降低,而MDA水平则逐渐升高,具有统计学显著性差异().
氟中毒对大鼠血清氧化水平的影响。(A)GSH-Px水平。(B)T-AOC水平。(C)SOD水平。(D)MDA水平**第页 < 0.05与对照组*第页 < 0.05 vs.氟化物组,n个 = 10
3.5. 脑组织中的炎症因子水平
与对照组大鼠相比,氟暴露大鼠脑组织IL-1β和IL-6水平显著升高(第页 < 0.05) (,). 在氟暴露组中,IL-1β和IL-6随着氟暴露剂量的增加而逐渐增加,具有统计学意义(第页 < 0.05). 结果表明,IL-1β和IL-6的逐渐增加与氟暴露剂量呈正相关().
氟中毒对大鼠脑组织炎症因子的影响。(A)IL-1β水平。(B)IL-6水平**第页 < 0.05与对照组*第页 < 0.05 vs.氟化物组,n个 = 10
3.6. 脑组织中AchE和ChAT活性
与对照组相比,氟暴露大鼠脑组织显著增加AchE活性,显著降低ChAT活性(第页 < 0.05). 在氟暴露组中,脑组织AchE和ChAT活性与氟暴露剂量密切相关().
氟中毒对大鼠脑组织AchE和ChAT活性的影响。(A)AchE水平。(B)ChAT水平**第页 < 0.05与对照组相比*第页 < 0.05 vs.氟化物组,n个 = 10
3.7. 脑组织结构
HE染色显示,对照组大鼠海马神经元排列致密有序,形态规则,细胞边界清晰,细胞质丰富,星形胶质细胞规则,核仁清晰。相反,氟暴露大鼠海马神经元排列稀疏,细胞边界不清,星形胶质细胞数量明显减少,细胞肿胀,核仁消失(). 透射电镜显示,对照组神经元细胞核形状规则,细胞核膜双层结构清晰,核染色质分布均匀,几个细胞器分布正常。然而,氟处理组神经元膜折叠,线粒体变形,嵴缺失,空泡形成,染色质固缩和深染().
氟中毒对大鼠脑组织结构的影响。(A)脑组织HE染色显示病理形态(比例尺=20μm,×200,比例尺=100μm,x40,n个 = 10).(B)脑组织超微结构(比例尺=2μm,×6000,n个 = 10).
3.8. 神经营养素信号通路的表达
我们分析了氟中毒大鼠脑组织中SIRT1介导的BDNF–TrkB通路。Western blotting显示氟中毒大鼠脑组织SIRT1、BDNF、TrkB、PI3K、Akt、MAPK和NF-κB蛋白表达显著降低()凋亡蛋白(Bcl-2、BAX、Caspase-3、P53、FOXO1A)的表达显著增加(). 结果表明,SIRT1介导BDNF–TrkB信号通路,参与氟中毒所致脑损伤的机制,并与氟暴露剂量密切相关。
SIRT1介导BDNF–TrkB信号通路的蛋白表达(n个 = 10).
氟中毒大鼠脑损伤中凋亡蛋白的表达(n个 = 10).
4.讨论
氟中毒引起多器官和系统损害的机制非常复杂,一直是研究关注的关键公共卫生问题。自然界中有各种氟化物暴露源,如食物、水、空气和牙膏,其中饮用水是最重要的来源(26). 食物和饮用水中的氟化物被胃肠道吸收,并通过全身循环输送到身体的各种组织。摄入的氟大部分沉积在牙齿和骨骼等钙化组织中,其余分布在富含血管的软组织和血液中(27). 肾脏是主要的氟排泄途径,可以清除50-70%的氟通过尿液排泄(28). 因此,氟斑牙、尿氟和骨氟浓度是氟中毒的重要指标。我们的结果表明,对照组没有氟斑牙,低氟组轻度至中度氟斑牙以及中氟组和高氟组重度氟斑牙。此外,氟暴露组的尿氟和骨氟水平显著高于对照组。尿氟和骨氟水平随着氟剂量的增加而增加。结果表明,氟牙症的损害程度、尿氟和骨氟含量与氟暴露剂量密切相关。此外,骨组织HE染色证明,骨损伤程度也与氟暴露剂量有关。因此,未来预防和治疗氟中毒的最有效手段是减少氟摄入量。
MWM由英国心理学家莫里斯于1981年发明,用于研究动物的学习和记忆(29). MWM已成为研究空间学习和记忆的标准模型,并已用于各种研究,特别是用于测量啮齿动物的空间记忆和工作记忆(30). 1937年,首次报道了地方性氟中毒患者的神经系统功能障碍表现。此后,其他研究发现,长期过量摄入氟化物会导致大脑皮层和皮层下区域脱髓鞘变化,导致甲状腺功能减退;这可能解释了高氟地区儿童智力水平下降的原因。在本研究中,我们构建了氟中毒动物模型,其中大鼠的学习记忆能力随着氟剂量的增加而降低,并且与氟剂量密切相关。长期过量摄入氟会直接影响大脑的学习记忆能力,严重影响氟中毒地区人群的健康。大多数研究报告称,长期高氟摄入儿童的智商显著低于正常氟摄入儿童(31).
生物系统进化过程中,细胞内形成了对抗活性氧毒性的保护机制。其中,SOD广泛存在于生物体中,具有重要的抗氧化作用(32). 氧化应激理论系统地解释了氟中毒引起的全身损伤的发病机制,国内外许多学者都承认这一点,是当前医学界的一个热点研究课题(33). 脑组织高度依赖氧气,富含易受自由基攻击的多不饱和脂肪酸,导致脂质过氧化和氧化应激损伤(34,35). 氟中毒增加氧化应激水平,导致细胞凋亡,氟中毒大鼠学习记忆能力下降与氧化应激水平增加有关(36,37). 因此,脑是氟中毒期间自由基损伤最明显的器官。在本研究中,氟中毒大鼠的抗氧化水平显著降低,过氧化物水平显著升高,这与氟暴露剂量有关。氧化应激、炎症和脑损伤的形成机制是相互因果的(38). 由于其氧化和抗氧化能力水平的紊乱,身体会发生受体介导的无菌炎症反应,并大量释放促炎因子,从而导致持续的过度炎症状态(39,40). 在这里,身体处于氧化应激炎症微环境中,促炎细胞因子加速了脑损伤过程(41). 我们检测了大鼠体内的炎症因子水平,并观察到氟暴露组中炎症因子水平显著增加,这表明氧化应激、炎症和过量摄入氟引起的脑损伤之间存在相互关系。
学习和记忆能力与中枢胆碱能系统密切相关,并被认为通过与大脑的相互作用与学习和记忆直接相关(42). 脑组织中化学物质的稳定性影响正常人的思维、学习、记忆和行为变化(43). 乙酰胆碱E是一种重要的中枢神经系统神经递质,是胆碱能神经递质乙酰胆碱的水解酶,直接参与神经功能调节、肌肉运动、大脑思维和记忆等重要功能(44). 氟中毒显著影响大鼠脑组织中α7烟碱型乙酰胆碱受体(n-AChR)和毒蕈碱型乙酰胆碱受体(m-AChR(45). 我们的数据表明,氟中毒显著影响AchE和ChAT活性。此外,我们的结果表明,氟中毒大鼠的学习、记忆和认知功能的变化与AchE和ChAT活性有关,并受氟暴露剂量的影响。
氟中毒对智力的影响可能涉及多个不同的途径,其影响机制非常复杂。氟化物穿过血脑屏障后,可以不同程度地影响和改变小脑、海马体和大脑皮层,从而影响智力发育(46,47). 超微结构病理结果表明,氟对血脑屏障有明显的破坏作用,主要表现为星形胶质细胞足水肿、线粒体变性和微血管内皮细胞功能低下。氟对血脑屏障的破坏作用可能会进一步增加其在脑组织中的积累,从而加剧氟对大脑的损伤。中枢神经系统的化学毒素损伤抑制脑细胞增殖和分化,抑制脑组织中的乙酰胆碱酯酶活性,导致神经递质合成减少,从而影响学习和记忆能力,这与我们的结果一致。
SIRT1是一种组蛋白去乙酰化酶,主要表达于脑组织中的海马神经元。SIRT1参与记忆形成、神经可塑性、轴突和神经元保护(48)并调节大脑中的炎症和氧化应激反应,发挥神经保护作用(49). SIRT1通过调节BDNF的表达增强BDNF转录激活,从而使其在学习、记忆和情绪调节中发挥重要作用(50). 动物实验表明SIRT1–BDNF信号通路的激活改善了血管性认知障碍大鼠的学习记忆功能(51). BDNF是神经营养素家族成员,是交感神经系统发育的关键因素,被称为大脑的肥料(52). BDNF帮助大脑产生新的神经连接,修复受损的脑细胞,保护健康的脑细胞(53). 在大脑中,BDNF主要存在于海马体、大脑皮层和基底前脑,与学习、记忆、回忆和深层思考有关。BDNF与其酪氨酸激酶受体TrkB结合激活PI3K、MAPK和NF-κB(54,55). BDNF和TrkB的结合激活各种细胞内信号级联反应,然后调节突触传递,促进细胞存活和增殖,具有神经保护作用(56,57). 本研究阐明了氟中毒引起的脑损伤和学习记忆能力下降是否与SIRT1介导的BDNF–TrkB诱导的细胞内信号级联反应有关。结果表明,氟中毒大鼠海马SIRT1和BDNF–TrkB蛋白水平显著降低,PI3K–Akt和MAPK–NF-κB水平显著降低,凋亡蛋白水平显著升高,从而引起脑损伤,影响大鼠的学习记忆能力。
5.结论
氟化物可以通过血脑屏障在大脑中积聚,严重影响大脑的记忆功能。本研究有助于更好地了解氟中毒对脑损伤的病理机制和学习记忆能力。大鼠摄入过量的氟化物导致过氧化物蓄积,导致受体介导的无菌炎症反应和大量促炎因子释放,直接损伤脑组织并影响AchE和ChAT活性。组织结构的病理变化证实了脑损伤的进展。蛋白质水平验证确定SIRT1介导BDNF–TrkB信号通路,导致级联反应,导致脑组织中凋亡蛋白水平增加。进一步分析表明,SIRT1介导的BDNF–TrkB蛋白水平的降低与氟中毒大鼠的脑损伤和学习记忆能力有关,并与氟暴露剂量呈负相关。目前,对氟中毒引起的组织损伤尚无有效的治疗方法。因此,控制氟摄入量是防治氟中毒损害的有效方法。
数据可用性声明
本研究中的数据集可以在在线存储库中找到。存储库的名称和登录号可以在文章/补充材料中找到。
道德声明
该动物研究由贵州中医药大学第一附属医院批准。这项研究是根据当地立法和机构要求进行的。
作者贡献
FW、XZ、DM、DT、YLi和YLiu构思并设计了这项研究,他们可以完全访问研究中的所有数据,并对数据的完整性和数据分析的准确性负责。FW、DT和YLi撰写了手稿。ZH、NM、WX和YLiu对手稿进行了批判性修订。CZ、BY、TT和MT进行了统计分析。所有作者都参与了这篇文章并批准了提交的版本。
基金
本研究得到贵州省自然科学基金资助[批准号:黔科河基金(2022)181];贵阳市自然科学基金[批准号(2022)4-3-2、(2022年)4-3-10和(2022日)4-3-11];贵州省中医药管理局项目基金(批准号:QZYYXG-2021-5)。该研究的资助者在研究设计、数据收集、数据分析、数据解释或报告撰写方面没有任何作用。
利益冲突
作者声明,该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。
出版商备注
本文中表达的所有声明仅为作者的声明,不一定代表其附属组织的声明,也不一定代表出版商、编辑和审稿人的声明。任何可能在本文中进行评估的产品,或制造商可能提出的索赔,都不受出版商的保证或认可。
致谢
我们要感谢Elixigen公司(加利福尼亚州亨廷顿海滩)以英语为母语的科学家编辑了我们的手稿。
工具书类
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