埃博拉病毒选择性抑制内皮细胞对干扰素的反应，但不抑制白细胞介素-1β的反应

摘要

丝状病毒是一种被包裹的负链单链RNA病毒，其基因组不分段，属于该家族丝状病毒科按顺序单核糖核酸丝状病毒引起一种暴发性发热性出血性疾病，对人类和其他灵长类动物具有高度致死性(2,12). 扎伊尔埃博拉病毒（EZ）是所有已知丝状病毒中死亡率最高的病毒，几乎90%的感染者死亡(19)并在本报告中使用。

在丝状病毒感染期间，病毒在肝脏、脾脏、淋巴结和肺部生长到高滴度。这些器官在疾病过程中严重受损(11,25)，但也许最引人注目的观察结果是，致命丝状病毒感染患者死亡时病毒血症很高，感染部位缺乏单核吞噬细胞浸润，几乎没有体液或T细胞介导反应的证据(28). 此外，当在感染猴身上预防性使用干扰素（IFN）时，丝状病毒对其抗病毒特性的影响具有抵抗力(1,7,28). 在感染期间，机体未能产生免疫反应的机制尚不清楚。

感染人类和其他灵长类动物活检的免疫组织化学表明内皮细胞严重感染EZ(13,14). 虽然内皮细胞通过表达病毒或细胞因子诱导的许多免疫调节基因在宿主抗病毒反应中发挥重要作用(10,30)EZ感染的内皮细胞附近缺乏炎症浸润，表明感染在某种程度上破坏了正常的宿主抗病毒反应。由于干扰素通过诱导许多基因在宿主抗病毒反应中特别重要，例如编码主要组织相容性复合体I类（MHC I）蛋白的基因，2′-5′寡聚腺苷酸合成酶[2′-5′（A）_N个]和IFN调节因子1（IRF-1），我们检测了EZ感染对内皮细胞中IFN信号的影响。

如前所述，分离并培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）(17). HUVEC感染EZ的感染倍数（MOI）为1.0。如前所述，通过流式细胞术分析测量MHC I蛋白水平(17). 感染后24小时（p.I.），MHC I蛋白表达的基本水平保持不变，但在72小时p.I.时，表达降至基本水平的约50%（数据未显示），并保持在96小时p.I..的水平（图。​（图1A1A和B）。由于EZ感染抑制了基础MHC I蛋白的表达，我们询问EZ感染是否也阻断了IFN对MHC I的诱导。治疗前用EZ感染细胞72小时。之所以选择这一时间，是因为细胞的病毒感染已经确立，这可以通过高水平的病毒RNA和蛋白质以及子代病毒的对数期释放来证明（数据未显示）。IFN-γ治疗（Genzyme Diagnostics，Cambridge，Mass.）诱导模拟感染细胞中MHC I蛋白增加三倍（图。​（图1A1A和B）。在加入IFN-γ前72小时感染EZ完全阻断了这种诱导，导致MHC蛋白表达水平低于模拟感染的未诱导细胞。此外，EZ感染完全阻断了IFN-α诱导MHC I（IFN-α-2b来自新泽西州凯尼尔沃思的先灵公司），单独或与IFN-γ联合使用（图。​（图1C）。1C） ●●●●。我们发现，在使用干扰素治疗前24小时感染EZ并没有阻止通过同时添加IFN-α、IFN-γ或IFN-α和IFN-γ诱导MHC I（数据未显示）。EZ抑制HUVEC中基础MHC I蛋白表达的能力与另一种负链RNA病毒麻疹病毒形成鲜明对比。HUVEC感染野生型麻疹病毒株NJ-2(16,29)与IFN-α孵育相比，诱导的MHC I蛋白表达水平更高（图。​（图1D）。1D） ●●●●。因此，EZ感染细胞中MHC I蛋白基础表达的减少和IFN诱导的缺乏是EZ独有的，并不是感染负链RNA病毒的一般功能。

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图1

EZ感染对MHC I蛋白表达的影响。通过流式细胞术分析，在MOI为1.0时感染EZ的HUVEC中测定MHC I蛋白表达水平(17)并于96 h p.i.收获（A）MHC i诱导直方图。模拟感染96小时（MHC I显示为黑色，非反应性抗体[抗鼠免疫球蛋白G]显示为灰色）；EZ、EZ感染96 h；模拟+IFN-γ，模拟感染96小时，最后24小时每毫升150 U IFN-γ；EZ+IFN-γ，EZ感染96小时，然后每毫升150 U IFN-γ治疗最后24小时。虚线表示模拟感染96小时的细胞中MHC I蛋白的平均免疫荧光。（B）A组MHC I蛋白质相对平均免疫荧光的图形表示。（C）IFN-α（1000 U/ml）、IFN-γ（150 U/ml。Con，控制。（D） HUVEC感染麻疹病毒24小时，MOI为1.0。用流式细胞术检测MHC I蛋白水平，并给出相应的平均免疫荧光值。相对平均免疫荧光是代表异硫氰酸荧光素在线性范围内的荧光强度的相对数。

通过检测EZ对白细胞介素-1β（IL-1β）的反应性的影响，探讨了抑制细胞因子反应性的选择性，白细胞介素-1β是一种独立于IFN信号通路传递信号的细胞因子。IL-6不是由IFN-α或IFN-γ诱导的，而是由IL-1β诱导的(31). 如前所述，通过夹心酶联免疫吸附试验测定IL-6水平(17). 图​图22表明IL-1β（Boehringer Mannheim，Indianapolis）在模拟感染细胞和EZ感染细胞中诱导高水平IL-6蛋白。因此，EZ并不抑制所有信号转导，而是选择性地抑制IFN的基因诱导，而不是IL-1β。此外，IL-1β诱导IL-6蛋白的能力表明，感染EZ不会阻止从头开始的蛋白合成。

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图2

EZ感染对IL-6蛋白诱导的影响。从用IL-1β（100 U/ml）处理96小时培养的最后24小时的HUVEC中收集条件培养基，与模拟感染（固体棒）或EZ感染（斑点棒）的细胞进行孵育。采用夹心酶联免疫吸附试验测定IL-6。数值表示为平均值±标准偏差。样品测试一式两份。

Northern印迹分析进一步表明，EZ感染抑制了IFN对许多基因的诱导，而对IL-1β的反应似乎不受影响。当在未感染的细胞中单独或联合添加IFN-α和IFN-γ时，MHC I mRNA被诱导到高水平，而EZ感染抑制了这些诱导超过80%（图。​（图3）。三). IFN-α或IFN-γ诱导其他基因，包括编码IRF-1和2′-5′（A）的基因_N个也发现在EZ感染细胞中受到强烈抑制。与EZ抑制IFN基因诱导的能力相反，EZ感染并没有抑制对IL-1β的反应，如未感染和EZ感染细胞中ICAM-1和IL-6的诱导水平相当（图。​（图3，三，第9和第10车道）。在所有感染样本中检测到EZ糖蛋白基因mRNA的相似水平，从而证实感染水平相似。

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图3

EZ感染对基因诱导的影响。在用IFN-α（1000 U/ml）、IFN-γ（100 U/ml(17). 所有条带均与每个基因的已知mRNA大小一致。GAPDH探针证实了车道之间类似的RNA负载。

对干扰素的反应是通过激活转录因子来实现的，这些转录因子通过DNA调控区中发现的干扰素应答序列识别并进行相互作用(三,6,9,20). I型和II型干扰素各自具有使用不同受体的信号通路。对于类型和II型干扰素，配体结合启动酪氨酸磷酸化级联反应，从而激活转录因子和基因诱导。I型干扰素导致形成转录因子ISGF-3（由磷酸化的STAT-2和STAT-1α以及DNA结合蛋白p48组成），该转录因子与干扰素刺激的反应元件（ISREs）结合，而II型干扰物导致形成γ活化因子（GAF），其由磷酸化STAT-1β同源二聚体组成，与称为γ激活序列（GAS）的特定DNA识别序列结合并驱动基因转录。IFN-γ还可以诱导形成结合ISRE的STAT-1-STAT-1-p48复合物(5). 此外，在ISRE中发现了一个相关的元素，即干扰素调节因子结合位点（IRF-E），它竞争性地结合了IRF家族成员(6)包括转录因子IRF-1，其从头合成由HUVEC中的IFN-α和IFN-γ诱导（图。​（图3）。三). 为了确定EZ感染是否影响与ISRE或GAS元素结合的复合物的形成，以响应IFN-α和IFN-γ，进行凝胶位移分析。在模拟感染细胞中，IFN-α和IFN-γ均诱导形成与ISRE结合的几种特定复合物（图。​（图4A，4A、 通道4和通道6），而这些复合物不是由感染EZ的细胞中的IFN-α和IFN-γ诱导的（图。​（图4A，4A、 车道5和7）。虽然结合到ISRE的配合物的组成没有特征化，但这些配合物的特异性通过非放射性标记的ISRE（而不是无关序列）的能力得到了证实，这些配合物能够专门竞争由IFN-α和IFN-γ诱导的配合物结合（图。​（图4A，4A、 车道8和9）。在模拟感染细胞中，IFN-γ（而非IFN-α）诱导了单个特定复合物与GAS元素的结合（图。​（图4B）。4B） ●●●●。在EZ感染细胞中，这种复合物是由IFN-γ诱导的，但水平要低得多。对STAT-1α抗体（来自肯塔基州列克星敦的Transduction Laboratories）的超移分析表明，该复合物由STAT-1β组成。因此，在感染EZ的HUVEC中，细胞无法形成与ISRE结合的复合物以响应IFN-α或IFN-γ，并且形成极低水平的复合物，与GAS结合以响应IFN-γ。与EZ抑制干扰素诱导基因的能力相反，对IL-1β的反应是完整的。IL-1β激活潜在转录因子NF-κB，这是一种参与IL-6和ICAM-1诱导表达的转录因子(8). 凝胶位移分析表明，IL-1β在模拟感染细胞或EZ感染细胞中激活NF-κB至相似水平（图。​（图4C，4C、 车道4和车道5）。这些数据进一步证明了抑制干扰素诱导信号的选择性，而不是IL-1β诱导信号。

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图4

EZ感染对与ISRE、GAS和NF-κB元件结合的影响。HUVECs以1.0的MOI模拟感染或EZ感染75小时，并用IFN-α、IFN-γ或IL-1β处理最后3小时。如前所述进行凝胶位移分析(17,33)通过使用来自ISG54基因的ISRE（A）、来自IRF-1基因的GAS元件（B）或来自IL-6启动子的NF-κB结合位点（C）作为探针，使用核提取物。A组中的特异性和非特异性竞争对手DNA[IL-6 NF-κB位点，B组中的小鼠免疫球蛋白κ轻链基因NF-κ的B位点，以及（IRF-E）₂在C组中添加30倍过量的]，并使用A组中的模拟IFN-α样品、B组中的仿IFN-γ样品和C组中用100μg/ml聚（I-C）（新泽西州皮斯卡塔韦市法玛西亚生物技术公司）处理的模拟感染样品进行测试。用单克隆抗体（Ab）进行超移分析（B）STAT-1α的N末端区域。结合复合物通过4%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并通过放射自显影术进行可视化(17,33).

EZ抑制对这两类干扰素反应的机制尚待确定，但抑制作用明显发生在与ISRE或GAS特异结合的核复合物形成之前。IFN-α和IFN-γ共享几个信号分子，包括Jak-1和STAT-1α(6,20). EZ感染可能消除或抑制Jak-1或STAT-1α的功能，这将有效阻断大多数（如果不是全部的话）IFN信号传导，但其他抑制机制也是可能的。因为IL-1β不通过Jak/STAT通路的任何成分传递信号(4)，抑制该途径对IL-1β的基因诱导没有影响。与干扰素信号抑制相关的时滞表明，EZ通过一个活跃的过程抑制这些功能，该过程涉及抑制性RNA或蛋白质种类的产生或细胞基因的调节。

干扰素通过其诱导MHC I、PKR和2′-5′（a）的能力，是细胞抗病毒反应的介质_N个蛋白质和其他基因编码的蛋白质。由于IFN信号通路最终对病毒生存不利，许多DNA和RNA病毒已经进化出机制来消除特定的IFN诱导基因功能或IFN信号途径本身。病毒破坏的大多数靶点是干扰素诱导的效应蛋白。例如，腺病毒、痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、呼肠孤病毒和人类免疫缺陷病毒已经进化出破坏PKR功能的方法（有关综述，请参阅参考文献18和21). PKR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，经双链RNA激活后，会抑制蛋白质合成(21)并被认为通过其抑制剂IκB的磷酸化激活转录因子NF-κB(22,26). 这些活动有助于控制病毒感染。腺病毒(27)和巨细胞病毒(32)是众所周知的MHC I表达抑制剂。抑制MHC I会干扰细胞毒性T淋巴细胞反应的产生，因为MHC I是一种表面蛋白，可向CD8提供抗原⁺细胞毒性T细胞(15). 除了干扰干扰素诱导的效应蛋白外，腺病毒E1A蛋白还通过减少可用STAT-1α和p48的数量来干扰干扰物信号转导(23,24). 埃博拉病毒现在可以被添加到破坏干扰素信号通路的病毒列表中。尽管抑制位置尚未确定，但它发生在识别ISRE、GAS或IRF-E序列的核复合体形成之前。HUVEC的EZ感染通过干扰IFN-应答基因的诱导，在全球范围内影响对IFN-α和IFN-γ的应答，从而破坏宿主抗病毒防御。

EZ在内皮细胞中复制和产生子代病毒的能力，同时抑制基础MHC I表达和抑制抗病毒基因对IFN的反应表达，可能在EZ感染引起的疾病的发病机制中发挥作用。因为病毒感染不会导致MHC I的诱导，所以细胞无法向免疫系统发出信号，使其对EZ感染产生免疫反应。此外，通过抑制IFN信号传导，IFN不能上调编码PKR和2′-5′-（A）的基因_N个，这对受感染细胞的抗病毒防御至关重要。这些抗病毒途径的中断可能对疾病的发病机制和埃博拉病毒感染致命病例中的免疫抑制起到重要作用。

鸣谢

参考文献