利用重组病毒嵌合物鉴定水泡性口炎病毒M蛋白的晚期结构域功能

摘要

逆转录病毒的组装和出芽机制与被包裹的负链RNA病毒至少有一个非常明显的区别。前者由单个大前体蛋白Gag驱动（图。​（图1A），1A） 从质膜上出芽后，病毒蛋白酶（PR）对其进行处理，形成病毒粒子的结构蛋白（MA、CA和NC）(6,27). 相反，组装和释放负链RNA病毒，如水泡性口炎病毒（VSV）弹状病毒科家族，由结构蛋白（在本例中为M和N蛋白）驱动，在质膜上组装之前，这些蛋白被单独翻译(28). 尽管存在这种明显的差异，但组装过程非常相似，因为病毒成分在组装时通过基质蛋白（逆转录病毒中的MA；横纹病毒中的M）附着在质膜上，完整的结构通过膜上的芽生而释放。然而，对于所有包膜病毒，病毒-细胞分离的实际机制仍不明确。

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图1

Gag蛋白和M-Gag嵌合体的结构。（A） RSV野生型Gag蛋白的结构。被病毒蛋白酶（PR）切割以产生成熟病毒蛋白的裂解位点用残数标记。黑色条表示RSV Gag中三个组装域的位置：M，膜结合域；五十、 后期域；一、 交互作用域。定义L结构域核心的PPPPY序列位于p2b肽（灰色）内。M-GagS、M-GagN和M-GagM蛋白是由VSV M蛋白（M74，阴影框）N末端的74个氨基酸与Gag蛋白不同长度融合而成的嵌合体。M74片段融合到Gag中的残基显示在每个分子下方。外源氨基酸插入M-GagS（A-L-V）和M-GagN（A-P-R-Q）的融合点，但未插入M-Gag S。（B） M-GagN嵌合体及其Src衍生物的氨基末端序列。M-GagN的末端序列与VSV M蛋白的末端序列相同。与膜结合有关的八个赖氨酸残基用加号表示。PPPY图案已装箱。在SrcM-GagN分子中，M蛋白的氨基末端序列保持不变。添加包含v的前10个密码子的序列-型钢混凝土至嵌合M-堵住pSV中的基因。M-GagN有望产生所示的蛋白质。由于肉豆蔻酸（以之字形表示）与Src肽中的亚末端甘氨酸相连，预计N-末端蛋氨酸将被共翻译去除。

通过缺失分析（图。​（图1A）。1A） ●●●●。这些包括每个Gag蛋白的氨基末端基质（MA）序列中的膜靶向和结合信号（M域）(25,32,37)以及Gag蛋白之间相互作用的一个或多个区域（相互作用或I域），这些区域是分子紧密堆积到膜上高密度结构所必需的。粒子的有效释放需要Gag中第三个元素的作用，Gag是一个被称为晚期（L）结构域的短序列，因为这些区域内的突变会导致组装释放途径的晚期阻滞(18,30)。

对后期结构域活性至关重要的RSV序列位于Gag氨基末端附近的p2b区域，其中最关键的残基被映射到PPPPY基序。RSV PPPPY序列的功能同源物已在人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）和visna病毒Gag蛋白的P（S/T）APP序列、马传染性贫血病毒（EIAV）的YPDL序列以及Mason-Pfizer猴病毒（M-PMV）的PPPY序列中得到证实(10,18,21,30,33,34). 这些区域中的每一个区域的突变都会导致粒子释放的急剧减少，尽管序列相似性很小，表明存在共同的功能。更令人惊讶的是，不同病毒的L结构域在其各自Gag蛋白的不同位置发现：RSV的氨基末端附近，HIV和EIAV的Gag羧基末端。然而，来自HIV、EIAV和visna病毒的序列的功能相似性已经被证明，它们都可以替代RSV的L结构域，并允许形成具有萌芽竞争力的嵌合颗粒(18,21,33). 越来越多的证据表明，这些晚期结构域是促进病毒释放的细胞因子的结合位点(8,11)。

到目前为止，还没有确认其他种类病毒中与逆转录病毒L结构域相关的元素。然而，在缺乏其他VSV蛋白的情况下M的表达导致蛋白质被包装并以低密度颗粒释放(12)与截短的RSV-Gag蛋白释放的类似，该蛋白仅包含膜结合和晚期结构域(29). 因此，M蛋白可能具有与这些逆转录病毒组装域相同的功能。事实上，之前已经在VSV M蛋白中定义了HIV-1膜结合结构域的同源物，这两个结构域的功能非常相似，既利用了疏水区，也利用了氨基酸末端附近带正电的氨基酸簇(14,15,25,35–37). 现已在VSV的M蛋白和几个与RSV的L结构域序列相似的相关病毒中鉴定出候选的弹状病毒L结构域(11). 在本研究中，我们证明了VSV M蛋白中的PPPY基序确实是逆转录病毒L结构域的功能同源物，这是首次描述逆转录病毒外的这种活性。这些发现表明，病毒细胞分离的机制在这两个非常不同的病毒群之间是保守的。

材料和方法

结果

VSV:LGIA的基质（M）蛋白中存在一个与RSV L结构域核心基序极为相似的富含脯氨酸的序列PPPY（购买力平价）VSV M蛋白中的EED；塔萨PPPPY（PPPPY）RSV p2b肽中的VG。狂犬病病毒的M蛋白以及埃博拉病毒和马尔堡病毒中都存在相关的基序(11). 通过与RSV-Gag的L结构域相类比，弹状病毒PPPY序列在促进颗粒释放方面的功能似乎是可能的，但由于几个原因无法假设。PPPY基序出现在非病毒蛋白质中，它们显然不起芽生作用。VSV序列比RSV L结构域短一个脯氨酸，脯氨酸基序两侧的序列差异很大。最后，除了逆转录病毒的蛋白外，没有任何病毒蛋白具有类似于L结构域的活性。为了评估弹状病毒PPPY序列可能的L域活性，我们构建了嵌合蛋白，其中VSV M蛋白（M74）的前74个氨基酸取代了RSV Gag的不同部分（图。​（图1A）。1A） ●●●●。

M74序列包含PPPY基序和与膜结合有关的氨基末端碱基区。与全长M蛋白一样，M74已被证明能够释放低密度的膜包裹颗粒(12). 因此，我们假设M74片段可能替代RSV Gag蛋白的M和L结构域，并支持正常密度的类病毒颗粒的组装和释放。幸运的是，这个M74片段不会引起全长M蛋白所观察到的细胞病变效应(35). 将M74序列插入RSV-Gag蛋白的前100、232和418个残基，以分别创建嵌合体M-GagS、M-GagN和M-GagB（图。​（图1A）。1A） ●●●●。在所有三个嵌合体中，RSV膜结合域已被移除，使得颗粒释放依赖于M74序列中可能存在的任何此类活动。含有M-GagN和M-GagB蛋白的颗粒释放缺乏RSV L结构域，这与M74序列中存在类似于RSV L域的功能元件一致。这种颗粒预计具有逆转录病毒的密度特征，因为在每种情况下都保留了RSV I结构域。

在用于Gag蛋白组装研究的出芽试验中测量了每个嵌合蛋白的组装和出芽能力(31)（图。​（图2）。2). 表达Gag蛋白或其中一个嵌合体的COS-1细胞被标记为[³⁵S] 蛋氨酸作用2.5小时，然后用抗RSV血清免疫沉淀法评估培养基中的Gag相关蛋白。在野生型Gag的情况下，在细胞裂解液中检测到全长蛋白和裂解中间产物（图。​（图2，2，裂解物通道1）。病毒蛋白酶对培养基中积累的Gag作用形成的裂解产物（图。​（图2，2，媒体通道1）。这种材料已被证明包含在类似真实感染病毒的颗粒中，这些颗粒的大小、形状、密度、释放速率、蛋白水解成熟度，以及当病毒RNA和逆转录酶与Gag蛋白结合表达时包装病毒RNA和反转录酶的能力(1,5,13,23,29,31). 作为阴性对照，我们加入了一种突变的Gag蛋白，该蛋白具有缺陷的膜结合域；它没有向媒体释放任何可检测到的物质（媒体通道2）。

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图2

从表达M-Gag嵌合体的细胞中释放颗粒。野生型Gag蛋白和三个M-Gag嵌合体在COS-1细胞中表达(31). 对每个嵌合体的两个独立克隆进行测试。使用主要识别Gag蛋白及其裂解产物的抗RSV血清，通过放射免疫沉淀分析细胞裂解物和表达细胞培养基中存在的Gag相关蛋白。标记蛋白在12%聚丙烯酰胺凝胶上通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。左侧标记了细胞裂解物中全长Gag蛋白和CA、MA和PR蛋白的位置。全长M-Gag嵌合体用圆点标记。具有缺陷膜结合域的突变Gag蛋白作为芽接的阴性对照（第2道）。来自未转染细胞的样本被装载到第9车道。

在细胞裂解液中很容易检测到每个嵌合M-Gag蛋白，其中未分离的蛋白（图中用圆点标记）。​图2，2观察到3到8道）以及多重解理产物。标记5分钟后分析的全长细胞相关蛋白的电泳迁移率与计算得出的M-GagS、M-GagN和M-GagB蛋白的73、59和39 kDa质量一致（未显示）。显然，所有三种嵌合体都能够从细胞中释放（培养基泳道3至8），这表明L结构域活性存在于每种细胞中。成熟CA和PR蛋白积聚在表达M-GagN和M-GagS的细胞培养基中（3、4、7和8道）。尽管在一些实验中M-GagS嵌合体中CA物种的比例出现了偏差，但病毒蛋白酶的切割模式似乎是正常的（图。​（图2，2，媒体通道7和8）。这种模式以前曾在某些带有改变的L结构域的RSV突变体中发现，并表明CA蛋白在其C末端通过裂解而成熟的速度有所减缓(33). 在M-GagB表达细胞的培养基（第5和第6道）中观察到PR，但没有观察到CA蛋白。这是意料之中的，因为这个嵌合体中大多数CA序列都不存在。在M-GagS裂解液或培养基样品中未观察到一个预测的裂解产物，即M74与MA的C末端片段的融合（图。​（图2，2，第7和第8车道）。这可能是由于在该蛋白的融合接合处存在一个意料之外的PR裂解位点，或者由于干扰了抗RSV血清识别的MA表位。在M-GagN和M-GagB样品中未发现基质相关蛋白（图。​（图2，2（第3至8道），因为RSV MA区域在这些嵌合体中被完全删除。

嵌合蛋白的蛋白水解过程表明，它们被包装成实际的病毒样颗粒。利用先前发表的方法，通过分析M-GagN嵌合体在等密度蔗糖梯度中的浮力密度，证实了这一点(1). M-GagN颗粒的测量密度为1.15 g/ml（图。​（图3）三)与真实逆转录病毒和COS-1细胞中野生型Gag表达产生的颗粒的报告密度范围重叠（1.15至1.18 g/ml）(1,7,32). 因此，很明显，M74序列能够取代Gag蛋白的MA-p2b区域，补偿膜结合和后期域样活性的损失。

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图3

通过添加Src膜结合信号增强M-GagN嵌合体的出芽活性。（A） 将SrcM-GagN蛋白的颗粒组装和释放与野生型Gag蛋白和M-GagS和M-Gag N嵌合体的颗粒组装与释放进行比较。抗RSV血清用于免疫沉淀。（B） 比较了不同蛋白质释放颗粒的相对水平。按照图的图例所述进行表达和标记。​图2，2，但抗CA血清用于免疫沉淀。通过对干燥凝胶的磷光成像仪分析，测量2.5小时标记期间（底部面板）培养基中积累的CA蛋白。这些计数是针对标记仅5分钟的平行板裂解液中存在的Gag或M-Gag前体的数量（顶面板）以及前体中蛋氨酸残留的数量进行标准化的。然后，相对于野生型Gag蛋白，表达每个嵌合体的释放。所示凝胶代表一个典型的实验。包含野生型VSV L结构域的嵌合体表示为PPPY（购买力平价）车道走向；其他嵌合体携带指示的突变序列。在三个独立实验中，平均相对释放量（±标准误差）如下：Gag，1.00；M-间隙NPPPY公司, 0.157 ± 0.052; M-GagN应用，0.014±0.004；SrcM GagN PPPA，0.057±0.016；SrcM-GagN公司PPPY（购买力平价）, 0.348 ± 0.075.

尽管嵌合体被释放，但M-GagN和M-GagS嵌合体细胞外CA蛋白的积累量比野生型Gag蛋白低6到10倍（图。​（图2，2，媒体通道1和3至8）。M-GagB产生细胞培养基中PR蛋白的积累表明，M-GagB的释放与其他两个嵌合体类似（图。​（图2，2，媒体通道5和6）。由于含有RSV和VSV脯氨酸基序的M-GagS蛋白的表现似乎并不比M-GagN或M-GagB好，我们预测嵌合体的释放受到M74中次优膜结合活性的限制。这种解释与报道一致，即G糖蛋白（在我们的系统中未表达）是VSV和狂犬病病毒中最大出芽活性所必需的(16,24)M74片段外的VSV M区有助于M与膜的疏水相互作用(35)。

为了测试嵌合体中VSV膜结合活性是否受到限制，我们附加了病毒v-Src（pp60）的质膜结合信号^{v（v）-型钢混凝土})M-GagN上的癌蛋白（图。​（图1B）。1B） ●●●●。已知v-Src的氨基末端8至10个氨基酸即使在正常胞质蛋白上也能赋予强的质膜结合(19)并可替代整个RSV M域，以实现粒子组装和释放(32). 当置于SrcM-GagN嵌合体的氨基末端时（图。​（图1B），1B） 与M-GagN相比，v-Src肽确实显著促进了颗粒释放（图。​（图3A）。三A） ●●●●。SrcM-GagN的释放水平是野生型Gag蛋白的平均释放水平的三倍以内，在一些实验中几乎无法与野生型Gag的释放水平区分开来（图。​（图3B）。三B） ●●●●。我们得出结论，M-Gag嵌合体中的M74序列并不是RSV M域的完全有效替代物。Gag和M-Gag嵌合体之间的差异也可能表明VSV序列的完整功能需要G糖蛋白的存在，否则嵌合体中的L结构域不能完全进入。无论如何，在没有RSV脯氨酸基序的情况下，SrcM-GagN的有效释放表明M74序列中存在有效的L结构域活性。

为了测试M74中的颗粒释放活性是否映射到PPPY基序，在此序列中创建了丙氨酸取代。M-GagN的PPPY基序中的点突变对出芽有显著影响，尽管没有改变细胞裂解物中前体蛋白和裂解中间体的水平（图。​（图4，4，将车道8至11与车道12进行比较）。与未经修饰的M-GagN蛋白（第12道）相比，M-GagM蛋白中第一脯氨酸残基（PPPY变为APPY，第10道和第11道）或酪氨酸（PPPY-PPPA，第8道和第9道）的改变将颗粒释放降低到几乎无法检测到的水平。在三个实验中，M-GagN丙氨酸突变体释放到培养基中的CA蛋白平均仅为野生型Gag蛋白的2%，相比之下，未修饰的M-Gag N仅为15%（图。​（图3B）。三B） ●●●●。与此形成鲜明对比的是，两个点突变都没有对M-GagS蛋白的释放产生任何抑制作用，该蛋白保留了RSV未改变的PPPPY序列（图。​（图4，4，将车道4至6与车道7进行比较）。

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图4

M-GagN的PPPY基序改变导致出芽活性急剧降低。带有野生型PPPY基序的M-GagN嵌合体的颗粒释放（区别为PPPY（购买力平价）与突变体相比，突变体中的肽通过酪氨酸（PPPA；显示两个独立克隆）或第一脯氨酸（APPY；两个克隆）的丙氨酸取代而改变。在M-GagS蛋白的背景下，也对M74的类似突变进行了评估。芽变的阴性对照是一种突变的Gag蛋白，它包含跨越p2b序列的大缺失（通道2）。将来自未转染细胞的样品装载在泳道1中。

最后，由于Src肽不能补偿突变RSV Gag蛋白中L结构域功能的丧失(30)，我们预测SrcM-GagN嵌合体的萌芽对PPPY基序的改变敏感。事实上，从PPPY到PPPA的基序突变使SrcM-GagN颗粒的释放减少了六倍，类似于在M-GagN中基序突变时看到的效果（图。​（图3B）。三B） ●●●●。这种效应的大小也与RSV Gag的RSV PPPPY基序中的类似点突变引起的效应相当(33). 综合点突变对M-GagN、Src-MGagN和M-GagS出芽的影响，有力地证明了VSV M蛋白具有与逆转录病毒晚期结构域功能同源的活性。

讨论

这些研究表明，含有VSV M蛋白PPPY基序的序列可以替代RSV Gag蛋白的L结构域，促进嵌合颗粒的释放。这些发现支持并扩展了最近的报道，即VSV M蛋白脯氨酸基序的完整性对于膜包裹低密度颗粒中细胞释放全长蛋白的能力很重要(11). 因此，现已证实VSV的M蛋白具有与Gag定向芽接所必需的三种活性相同的三种活动：膜结合活性(4)，蛋白质相互作用(9)和L域函数（本报告）。其他杆状病毒的M蛋白以及马尔堡病毒和埃博拉病毒的假定基质蛋白中的脯氨酸基序很可能是(11)将证明具有相同的活动。

首次提出L结构域作为寄主因子的结合位点，为芽变提供机制(8)基于RSV L结构域和包含WW结构域的蛋白质识别的蛋白质相互作用基序（XPPXY）之间的序列相似性(三,26). WW结构域是一种蛋白质相互作用模块，存在于参与细胞骨架功能、信号转导和调节事件的各种蛋白质中。一个例子，是相关蛋白或YAP(2)是一种信号转导蛋白，已被证明在体外与RSV-Gag蛋白的p2b区域相互作用(8). 类似地，VSV PPPY和狂犬病病毒PPEY序列现已通过体外配体印迹分析显示，可与YAP的WW结构域结合(11). RSV和VSV L结构域的体内功能配体是YAP还是其他多种细胞WW蛋白尚待确定。迄今为止，病毒L结构域与宿主因子之间相互作用的最有力证据来自对EIAV晚结构域的研究(22). EIAV p9中的YPDL序列现已通过体外结合试验和体内共定位证明与衔接蛋白复合物2（AP2）的AP50亚单位相互作用。

M-GagN和SrcM-GagM嵌合物中PPPY基序的突变证明了该基序在M蛋白出芽活性中的重要性。然而，所测试的突变中没有一个完全消除出芽。这种漏水表型与RSV和M-PMV晚期结构域突变体相似(18,30,33,34). 如果释放的阻塞确实发生在非常晚的一步，可能有些泄漏并不奇怪，因为一些颗粒可能会自发地从细胞表面脱落。另一方面，漏泄可能反映了病毒蛋白中的一些冗余，为假定的宿主因子提供了多个相互作用位点。或者，如果在出芽部位只需要极少数相关因子的分子，突变L结构域对其配体的亲和力降低或通过非特异性手段简单捕获一些宿主分子，则可能允许包含足够的因子来驱动一些出芽活性。

所有这些不同的病毒是否通过相同的细胞机制发挥作用，但通过与其中不同成分的相互作用发挥作用，尚待阐明。EIAV晚期结构域与RSV、VSV、HIV-1和visna病毒的显著序列差异当然意味着后者不与AP50直接结合。RSV和VSV的脯氨酸基序虽然序列非常相似，但也可能通过不同的WW域蛋白发挥作用，因为观察到最有效的嵌合蛋白（SrcM-GagN）不能与真正的Gag蛋白的释放效率相等。这个想法与发现一致，即细胞XPPXY基序在基序本身及其周围具有轻微序列差异，与细胞WW域的完全不同阵列发生反应(20). 显然，要阐明病毒萌芽的机制，需要对所涉及的宿主机制进行更全面的说明。比较与不同逆转录病毒和弹状病毒蛋白结合的宿主因子可能是实现这一目标的有效途径。

致谢

参考文献