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公共科学图书馆计算生物学。2023年6月；19（6）：e101232。
2023年6月16日在线发布。 数字对象标识：10.1371/journal.pcbi.1011232
预防性维修识别码：项目经理10310025
PMID：37327241

全细胞建模E类.大肠杆菌菌落可以量化抗生素反应中的单细胞异质性

克里斯托弗·斯科尔尼克,概念化,数据管理,形式化分析,调查,方法,软件,验证,可视化,写作-初稿,写作–审查和编辑,#1 肖恩·蔡（Sean Y.Cheah）,概念化,数据管理,形式化分析,调查,方法,软件,验证,可视化,写作-初稿,写作–审查和编辑,#1 Mica Y.Yang（米卡·杨）,概念化,数据管理,形式化分析,资金获取,调查,方法,软件,验证,可视化,写作-初稿,写作–审查和编辑,#1 马修斯·沃尔夫,数据管理,形式化分析,调查,方法,软件,验证,写作–审查和编辑,1 瑞安·斯潘格勒,概念化,方法,软件,写作–审查和编辑,1,¤ 李·塔尔曼,方法,写作–审查和编辑,2 杰里·莫里森,软件,写作–审查和编辑,1 肖恩·皮尔斯,资金获取,方法,写作–审查和编辑,2 埃兰·阿格蒙,概念化,形式化分析,资金获取,方法,项目管理,软件,监督,验证,写作-初稿,写作–审查和编辑,通讯作者1,三,*和马库斯·W·科弗特,概念化,资金获取,方法,项目管理,资源,软件,监督,写作-初稿,写作–审查和编辑通讯作者1,*
丹尼尔·A·比尔德，编辑器
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摘要

抗生素耐药性给人类健康带来越来越大的风险，因为目前的抗生素对日益耐药的病原菌正在失去效力。特别令人关注的是多重耐药菌株的出现，这在革兰氏阴性菌（如大肠杆菌大量工作已经证实，抗生素耐药机制取决于表型异质性，而表型异质性可能由抗生素耐药基因的随机表达介导。这种分子水平的表达和由此产生的人口水平之间的联系是复杂的和多尺度的。因此，为了更好地理解抗生素耐药性，需要建立新的机制模型，将单细胞表型动力学与人群水平的异质性作为一个整体来反映。在这项工作中，我们试图在“全细胞”建模经验的基础上，将单细胞建模和人口规模建模联系起来，这是一种将生物过程的数学和机械描述结合在一起的方法，用于重现整个细胞的实验观察行为。为了将全细胞建模扩展到“全细胞”规模，我们嵌入了全细胞的多个实例E类.大肠杆菌在动态空间环境模型中进行建模，使我们能够在云中运行大型并行模拟，其中包含先前全细胞模型的所有分子细节以及在共享环境中菌落生长的许多交互效果。模拟结果用于探索E类.大肠杆菌四环素和氨苄西林这两种具有不同作用机制的抗生素，使我们能够识别亚世代表达的基因，如β-内酰胺酶ampC，这大大促成了稳态周质氨苄西兰中细胞的显著差异，是决定细胞存活的重要因素。

作者摘要

抗药性细菌对人类健康构成威胁，使目前的感染治疗效果下降，甚至过时。计算模型已被用于研究各种规模的抗生素耐药性相关现象，从抗生素分子跨越细胞屏障的扩散到医院内耐药性的传播。然而，这些模型无法捕捉同时发生在多个尺度上的现象。通过组合个人详细数学模型的多个实例大肠杆菌细胞在共享的空间环境中，我们能够模拟细菌菌落与单细胞分子机制的细节。我们使用这个模型来研究E类.大肠杆菌对两种作用方式截然不同的抗生素，评估这些反应如何受到基因和蛋白表达的细胞间变异的影响。这项工作对理解抗生素引起的紧急群体反应具有指导意义，并可能为更广泛地模拟群体紧急现象提供有价值的方法。

介绍

抗生素耐药性给人类健康带来越来越大的风险，因为目前的抗生素对日益耐药的病原菌正在失去效力。抗生素耐药表型的流行长期以来被认为是一场危机[1,2]. 特别值得关注的是出现了耐多药菌株，这种菌株在革兰氏阴性菌（如大肠杆菌[2]. 大量工作已经证实，抗生素耐药机制取决于表型异质性，而表型异质性可能由抗生素耐药基因的随机表达介导[三,4]. 除细胞异质性外，细菌还表现出复杂的种群级行为，如押注对冲[三,5]，群体感应[6]和远程电信号[7]. 其中一些行为已经被证明可以在生物膜等大量细菌中调节抗生素反应[8]. 因此，为了更好地理解抗生素耐药性，需要新的机制模型来反映单细胞表型动态以及作为一个整体的种群水平异质性。

为了满足这一需求，系统生物学和计算建模工作的范围和规模迅速扩大。早期的研究使用了多种数学方法来量化抗生素在细菌膜上的传输，包括常微分方程[9]和图形方法[10]. 最近，通量平衡分析（FBA）模型被用于确定与抗生素耐药性相关的代谢变化[11,12]. 人口动态[13]和基于代理[14]这些方法被用来描述人群水平的抗生素耐药机制，例如由于厚生物膜中营养物质的消耗而导致生长缓慢[15]. 在最大的空间尺度上，细菌本身被抽象出来，以便于对大规模现象进行建模，包括医院中抗生素耐药细菌的传播[16]抗菌药物耐药性的经济影响[17]. 虽然所有这些模型都已成功用于在目标尺度上进行预测，但它们受到空间分辨率有限的限制，无法对较小或较大的作用机制得出有意义的结论。

在这项工作中，我们试图在“全细胞”建模经验的基础上，将单细胞建模和人口规模建模联系起来，这是一种将生物过程的数学和机械描述结合在一起的方法，用于重现实验观察到的全细胞行为[18]. 自概念提出以来的几十年里，全细胞模型从其起源于常微分方程开始，已经发生了巨大的变化[19]，以基于约束的方法的形式出现了两个显著的创新[20]和基因调控逻辑[21]. 整个单元建模工作最终以大规模混合仿真模型告终生殖支原体解释了每个注释基因的已知功能[18]. 从那时起，科学家们投入了大量的精力来制作一个完整的细胞模型大肠杆菌[22]. 最新发布的模型包括43%特征明确的基因的功能，并包含12个详细的子模型，这些子模型共同捕获了广泛的细胞动力学，包括代谢、染色体复制、转录和翻译[23]. 该模型根据各种异构数据进行了基准测试，并成功预测了模拟后的实验结果[22].

为了将全细胞建模扩展到“全社区”规模，我们利用基于代理建模的原则嵌入了全细胞的多个实例E类.大肠杆菌在共享空间环境中建模。我们使用Vivarium软件库实现了这一点[24]这使我们能够在云中运行大型并行模拟，其中包含先前全细胞模型的所有分子细节，同时添加了在共享动态环境中生长的群体的许多交互效果。所得到的多尺度模型用于探索E类.大肠杆菌两种抗生素，四环素和氨苄西林。这两种抗生素都被广泛用于治疗感染，产生了许多抗生素耐药性菌株E类.大肠杆菌尽管如此，四环素衍生物和氨苄西林仍然具有临床相关性，这在很大程度上要归功于旨在克服已知耐药机制的研究[25,26]. 通过模拟四环素和氨苄西林在E类.大肠杆菌，我们旨在进一步了解这些抗生素的耐药性，并支持未来抗生素的发展。

结果

异质性和相互作用效应激发了全群落模型

我们最初被要求将细胞尺度模型扩展到菌落，以响应在模拟单个细菌细胞生长时所做的观察。特别是，在拟合每个基因的转录概率时[22]为了重述实验测量的转录物丰度，我们注意到两种不同性质的基因表达模式(图1A). 第一种模式是预期的（左侧面板，ompF（ompF）); 这类基因表现出我们所称的指数表达，平均每代有一个以上的转录事件，并且稳定的指数蛋白质产生。

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抗生素应答基因的亚世代表达需要一个多尺度的人群水平抗生素应答模型。

（A） 将mRNA计数置于代表“指数”表达的基因的相应单体计数之上（左，ompF（ompF）)右边是代表“亚世代”表达的基因（右边，马尔（marR）). 数据取自在添加1 mM葡萄糖的最小M9培养基上生长的模拟菌落（种子0）中的代表性谱系（细胞011001001及其祖先）。（B） 预测为亚世代（蓝色）或指数（灰色）表达的所有基因（外环）和抗生素反应基因（内环）的比例。如果在基线葡萄糖模拟中平均每代发生<1次表达事件（种子10000），则基因被视为亚代表达。（C） 扩展的示意图E类.大肠杆菌该模型可以模拟抗生素反应和菌落生长。原始的全细胞模型[22]补充了8个基因的新功能、63个新参数和13个新方程。然后将扩展的全细胞模型放置在一个空间环境中，该空间环境支持传播到由共享资源和物理交互的多个全细胞模型实例组成的群体中。这些全种群模型为单个细胞提供了丰富的时间序列数据，为整个群体提供了空间数据。

相比之下，第二种动态基因表达模式在mRNA和蛋白质表达方面产生了显著的差异，并且在平均每代转录不到一次的基因中也可以看到这种差异（右图，马尔（marR）). 这些基因的蛋白产物在数量上急剧增加，与每个罕见的转录事件相吻合。这些增加通常伴随着几代主要由于细胞分裂（而不是衰退）导致的细胞蛋白质损失。这种亚代表达模式在某些基因中已被实验观察到，包括E类.大肠杆菌[27,28]，但我们感到惊讶的是，超过一半的基因都是以这种方式表达的(图1B，外圆）[22]. 从单个细胞的角度来看，这一发现似乎是反事实的：为什么重要的基因产物不能在每一代都表达，以便在需要时可以得到？答案可以从整个群体或人群的角度来看：亚代表达允许大多数细胞将其资源转向更紧迫的细胞需求，而少数细胞则避免出现意料之外的环境压力或意外收获[三].

在这项研究的背景下，我们特别感兴趣的发现是，许多已知的抗生素耐药基因表现出一种亚代表达模式(图1B，内圈）。这些基因的高度随机表达使它们成为抗生素异质耐药性现象背后的潜在罪魁祸首，其中同基因细菌的亚群对特定抗生素的敏感性差异很大[29]. 而大多数关于异源耐药性的报道都集中在革兰氏阳性菌上，如金黄色葡萄球菌[30–32]，一部分研究发现革兰氏阴性菌也有类似行为，包括E类.大肠杆菌[33–37]. 因此，我们决定通过实现以下机制来使用我们的多单元模型E类.大肠杆菌目的是研究细胞异质性对人群水平表型的影响，如异质性耐药性。

解释种群异质性的一种方法是运行一系列非交互的单细胞模拟，其中包括初始细胞及其所有最终后代。这种方法将捕获随机基因表达和细胞分裂的变异性，以及任何下游影响。然而，许多研究组已经表明，抗生素的反应不仅涉及表型异质性，还涉及整个研究组的细胞间相互作用。易受影响时E类.大肠杆菌与仅占总种群6%的耐药菌株共同培养，整个菌落获得了对β-内酰胺头孢曼多的保护，表明来自耐药细胞的高β-内糖酶活性为敏感细胞提供了保护[38]. 在生物膜中，外周细胞的高营养消耗加上向内部区域的扩散减少，导致饥饿诱导的生长停滞，直接增加抗生素耐受性[39,40]. 有趣的是，对抗生素和其他毒素的耐受性取决于生物膜的年龄[41]甚至细菌生长环境的结构刚性[42]. 考虑到这些和其他相互作用的影响，我们很快就清楚需要建立一个人口规模的模型来充分模拟抗生素的反应。

我们开始重建现有的E类.大肠杆菌全细胞模型[22]使用Vivarium，这是一种软件工具，有助于将不同的机械模型集成到一个有凝聚力的整体中(图1C) [24]. Vivarium帮助我们在全细胞模型中添加了几个新的子模型，每个子模型都包含了E类.大肠杆菌氨苄西林或四环素的单细胞反应图1C，顶部）。然后利用基于Vivarium的模拟的层次结构将多个全细胞模型组合成一个全种群模型(图1C，中间）。模拟结果包含了丰富的异质、多尺度数据——从特定物种的分子活动和随时间的变化，到随着一个细胞成长为更加多样化的种群而出现的多细胞表型(图1C，底部）。此外，我们的模型通过为每个子细胞分配一个唯一的条形码来保留细胞之间的系统发育关系信息，条形码是通过在其母细胞的条形码上附加一个0或1生成的，从0开始表示第一个细胞，再到01和00表示其两个子细胞，等等。有关模型构造和此处显示的所有模拟的详细信息，请参见S1文本; 完整的源代码可以在我们的Github网站上找到(https://github.com/CovertLab/vivarium-ecoli网站).

模拟菌落表现出表型异质性

我们的第一个目标是为群体规模模拟创建一个基线，并确保我们的模型按预期运行。对于这一对照，我们进行了7.2小时的模拟，初始条件是单个细胞在添加1 mM葡萄糖的最小M9培养基中生长。菌落的生长被模拟了大约八代；典型的模拟如所示图2A.

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基线基因表达的时空异质性。

（A） 模拟的快照E类.大肠杆菌殖民地。环境中的葡萄糖浓度以不同的灰度表示。蓝色细胞来自单个具有代表性的细胞谱系（细胞011000000及其祖先），相同谱系的时间序列数据在面板B、C和D中也以蓝色突出显示。蓝线来自谱系，其成员在面板A的快照中为蓝色。（C-D）四个与抗生素耐药性相关的基因的mRNA浓度的时间序列图置于相应的单体浓度图（均以毫摩尔为单位）之上。蓝色线来自A组中成员为蓝色的谱系。彩色标记表示平均蛋白质[51]和mRNA[52]真实细胞（橙色）和模拟细胞（蓝色）的浓度。（E-F）模拟结束时拍摄的菌落快照，单体浓度（与面板C中的列标签相同）使用不同深浅的蓝色进行描述。最终菌落中所有细胞的浓度分布直方图位于其相应快照的下方。注释：显示的所有数据均来自于在添加1 mM葡萄糖的最小M9培养基上用10000粒种子进行约7.2小时（26000秒）的模拟运行。

随着模拟的进行，我们观察到菌落中的细胞数量大致有规律地增加一倍，形成一个圆形的、无组织的细胞团(图2A). 随着菌落大小的增加，环境中的葡萄糖以越来越快的速度消耗殆尽，这与实际生长菌落的情况如出一辙。有趣的是，尽管葡萄糖摄入量存在显著的细胞间差异（变异系数或CV=0.15，S1A图)，由于扩散的快速时间尺度，环境中不同区域的葡萄糖浓度几乎没有变化(S1B图). 这与之前的实验一致，该实验表明，异养生物膜底部的氧气仅在深度至少200μm处完全耗尽，远大于我们最大的微菌落直径≈15μm[43].

然后，我们将模拟结果与用于基准测试原始数据集的两个大规模数据集进行了比较E类.大肠杆菌模型[22]：55%预测值的细胞蛋白浓度E类.大肠杆菌基因[44]以及中心碳代谢中一系列反应的代谢通量[45]. 与我们最初发布的全细胞模型相比，我们发现在这两种情况下，模拟结果和实验结果之间的相关性大致相同或更好(S2图). 接下来，我们注意到E类.大肠杆菌菌株B/r（44分钟），其生理和生长测量用于参数化模型[46]，在我们模型的倍增时间分布范围内（50.89±4.61分钟，平均值±SD，S3A图). 有趣的是，倍增时间的微小变化足以在四代人的时间跨度内使细胞分裂明显地逐渐失去同步(图2B)：单元格进入第4代（8个单元格），开始时间的标准偏差为2.57分钟，第9代的开始时间单调增加到8.81分钟(S3B图).

我们还能够记录整个群体中各种基因的单细胞表达。例如，我们显示了mRNA的表达(图2C)和蛋白质表达(图2D)随时间变化的轨迹，以及空间(图2E)和装箱分布(图2F)四个关键抗生素耐药基因的蛋白表达。从左到右，ompF（ompF）抗生素进入周质的初级外膜孔蛋白代码[47],tolC（通行费）转化为许多药物外排复合物共同的外膜通道[48],放大器C是一种内源性β-内酰胺酶基因，其蛋白质水解β-内肽抗生素[49]、和马尔（marR）是多重抗生素耐药性的阻遏物(三月)赋予低水平抗生素耐药性的操纵子E类.大肠杆菌[50].

与其他指数表达基因一样，mRNA表达相对稳定且不为零ompF（ompF）和tolC（通行费）基因。在所示的典型模拟中图2,ompF（ompF）在整个模拟过程中，所有细胞中的mRNA保持非零，平均细胞为零tolC（通行费）mRNA的寿命仅为6.91%。考虑到OmpF孔蛋白的多功能性，这与我们的预期相符，众所周知，OmpF孔蛋白可促进小的非抗生素溶质的非特异性扩散[47]和TolC通道，形成可在多种底物上运行的外排复合物[48]——这表明所有细胞可能都需要这两种基因产物，而不是抗生素混合策略的一部分。

相反，马尔（marR）和放大器C表现出亚世代表达的关键特征：平均91.4%的细胞寿命中没有放大器CmRNA，86.0%的寿命没有马尔（marR）信使核糖核酸。其中59.0%的细胞没有放大器CmRNA贯穿其整个生命周期，41.8%始终为零马尔（marR）抄本。直觉上，这两个基因的低表达可以通过其蛋白产物的高度特异性功能来解释：AmpC是一种保护措施，仅在存在β-内酰胺类药物时才有用，而MarR控制主要对抗生素应激反应的操纵子的表达。相反，没有一种细胞在整个细胞周期中不转录更广泛有用的ompF（ompF）或tolC（通行费）基因。因此，在模拟结束时，OmpF和TolC单体的数量变化远小于AmpC和MarR单体的计数（CV=1.2，0.85）（CV=0.14，0.24）(图2F). 有趣的是，虽然MarR的异质性已经通过在表达三月操纵子活化剂MarA[三]，关于放大器C以及它潜在的子代表达的含义，我们将在后面的章节中探讨这一主题。

我们的全群落方法还能够在物理空间中定位细胞，并表征空间组织中的涌现模式，否则这可能是反直觉的。例如，人们可能已经预料到，具有较新共同祖先的细胞在群体中必然会彼此更接近。然而，虽然子细胞最初总是在分裂后端对端地放置，但布朗运动导致这些细胞随着时间的推移随机地彼此漂移。我们惊讶地发现，虽然亲缘关系较低的细胞在空间上更可能相隔更远（Spearman r=0.45，p≈0），但系统发育相关性的方差（量化为二元系统发育树中两个细胞之间最短路径的边数）随着距离的增加而显著增加(S4图). 因此，虽然紧密相关的细胞在空间上总是很近，但在空间上很近并不能保证两个细胞是紧密相关的(S4图).

菌落形成中固有的不可预测性在最终蛋白质浓度快照中得到了反映和放大(图2E). 我们观察到高表达和低表达细胞的混合物，而不是表型相似的细胞的明显集群，这一观察结果通过空间自相关分析得到了证实(S1表). 此外，OmpF、TolC、MarR或AmpC中任何一种平均浓度较高的细胞，对其他任何一种都不一定具有较高的平均浓度，这进一步增加了细胞的异质性(S5图). 这表明，至少在缺乏协同调节（例如操纵子结构）的情况下，仅仅获得相同的转录和翻译资源并不等于在不同基因之间普遍高或低表达。

总之，这些结果让我们相信，我们菌落中的单个细胞模拟与实验测量和生物直觉一致，并且模拟整体上显示了菌落中与抗生素耐药性相关的某些基因的异质性。

四环素以剂量依赖的方式均匀抑制模拟菌落的生长

在葡萄糖模拟的鼓励下，我们接下来想确定全克隆模型对四环素的反应，四环素是一种与核糖体结合并抑制蛋白质合成的抑菌抗生素。与杀菌抗生素（如氨苄西林）不同，四环素不会直接导致细胞死亡或溶解，而是减缓菌落生长(图3A). 这种生长抑制的程度取决于几个因素，主要是进入细胞质并与核糖体结合的四环素的数量，以及四环素抗性基因的表达[53–55].

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四环素作用的时空动力学E类.大肠杆菌聚居地。

（A-C）四环素从菌落规模的扩散到单细胞规模的转运到分子规模的基因表达调控的反应示意图。（D） 在MIC（1.5 mg/L）添加四环素后的代表性菌落模拟快照。每个单元格的颜色表示日志2在典型的基线葡萄糖模拟中，瞬时生长速率与细胞平均瞬时生长速率的倍数变化。以细胞0011111结尾的细胞谱系以蓝色勾勒，并在面板E-K中绘制为蓝色痕迹。（E）Per-cell干质量开始时，单个细胞生长在含有1mM葡萄糖且不含四环素的M9最小培养基中约3.2小时（11550秒），此时，在MIC处添加四环素，模拟又持续了约4小时（14550秒）。（F-H）在四环素添加周围的分钟内，从左到右，周质四环素、细胞质四环素和活性核糖体的每细胞浓度。（I-K）整个7.2小时（26000秒）模拟中micF-ompF RNA双工体、ompF mRNA和ompF单体从左到右的Per-cell浓度。（五十） 代表性模拟的整个菌落质量涉及六种不同浓度的四环素（蓝色MIC）。同样的模拟数据也用于创建M组。（M）四环素暴露第一（左）和第四（右）小时内所有细胞的平均活性核糖体浓度和瞬时倍增率，颜色对应不同的四环素浓度（MIC为蓝色）。边缘核密度估计值进行了标准化，使得每条彩色曲线下的面积为1。注释：显示的所有数据均来自于模拟，其中种子0用快照初始化3.2小时（11550秒）后进入基线葡萄糖模拟（也是种子0），然后用不同水平的外源四环素再继续4小时（14550秒）。

四环素净流入E类.大肠杆菌细胞质由四环素在外膜和内膜上的扩散速率以及主动外排速率控制[9] (图3B). 四环素被认为在通过内膜被动扩散之前通过OmpF孔蛋白穿过外膜[9]. 一旦进入细胞质，四环素就会通过多药外排泵AcrAB-TolC主动泵出细胞，后者直接将四环素从细胞质穿梭穿过两个细胞膜到达外部环境[9]. 在我们的模型中，扩散流入和主动流出之间的相互作用被表示为一个常微分方程（ODE）系统，用先前确定的膜渗透性和动力学常数进行参数化[9]. 值得注意的是，虽然四环素通过内膜的渗透性保持不变，但外膜渗透性可以根据OmpF孔蛋白浓度线性变化，上下限取自先前报告的估计值[9]. 完整的方程式和参数见S1文本.

一旦进入细胞质，四环素可以与30S核糖体亚基上靠近完全组装核糖体a位点的区域结合，防止多肽伸长[56] (图3B). 为了简单起见，我们假设四环素与氨酰化tRNAs竞争A位点的占据，并且两种底物的结合处于化学平衡。这种平衡的结合常数是从以前公布的一系列值中选择的[57–59]生成一个模拟的剂量-反应曲线，与在体外测量(S6A图) [60].

众所周知，暴露于四环素也会通过诱导三月操纵子，其过度表达已被证明对多种抗生素产生耐药性E类.大肠杆菌[26,61]. 这个三月操纵子编码自动再表达子MarR、自动和通用转录激活子MarA以及功能不明确的小蛋白MarB[62]. 四环素被认为可以通过灭活MarR来增加MarA的表达，尽管这种机制的确切细节尚不清楚[63]. 我们将MarR失活建模为可逆反应，其速率取决于细胞质中四环素的浓度，将MarA的活性与失活MarR的比例进行缩放。随着其活性的增加，更多的MarA被允许与下游靶基因的启动子结合，暂时改变它们的转录概率。这种调节的幅度针对每个基因进行调整，以大致重述四环素暴露期间测量的mRNA倍变化(S6B图) [64]. 在MarA激活的基因中，有一个小的反义RNA微碳纤维[65]. 这种非编码RNA转录后抑制OmpF孔蛋白的产生，方法是通过与ompF（ompF）mRNA，在我们的模型中，这个过程被认为是快速和不可逆的。

利用我们模型中的这些机制，我们在补充有1 mM葡萄糖和1.5 mg/L（3.375μM）四环素的最小M9培养基上进行了模拟，很好地在报告的敏感性最低抑制浓度（MIC）范围内E类.大肠杆菌菌株[9,66,67]. 每个模拟都使用非抗生素模拟的保存快照（t=11550秒）进行初始化，并继续进行14450秒（约4小时）的模拟时间。

在我们所有的四环素模拟实验中，我们观察到整个菌落的瞬时倍增率（初始干质量/小时的倍增）显著降低，最终平均值接近未经处理的模拟细胞的三分之一（35.1±4.52%，平均值±SD）（在图3D和3E). 最终的菌落也明显小于在非抑制条件下生长的菌落，平均为63个细胞，而在基线模拟中为254个细胞。

由于添加四环素时，OmpF单体浓度的细胞差异很小，因此外膜渗透性的变化同样可以忽略不计（两者的CV=0.02）。因此，四环素以几乎相同的速度进入菌落中所有细胞的周质，在添加四环素的8秒内，周质四环素浓度的CV小于0.01(图3F). 我们推测，与外膜相比，内膜的通透性降低，再加上AcrAB-TolC泵的主动外排，与周质相比，可能会延迟细胞质中四环素的平衡。事实上，以平衡时间为四环素变化小于0.05 nM/秒的第一瞬间，周质浓度在78秒内达到稳定，而细胞质浓度在102秒内达到平衡。令人惊讶的是，在添加四环素的瞬间，周质AcrAB-TolC浓度的显著变化（CV=0.24）并没有转化为细胞质四环素平衡时间的差异，这表明内源性流出太慢，无法影响MIC的净流入(图3G). 虽然加入四环素后活性核糖体浓度确实下降，但在加入四环素时和两分钟后的变化都很小（CV=0.03和0.04；图3H). 考虑到最佳生长速率和核糖体合成之间的紧密耦合[68]这解释了早在图3D.

观察到四环素进入细胞并抑制蛋白质合成的速度相对较快，我们想知道三月随着时间的推移，调节子将帮助细胞产生有意义的抵抗力。在一个典型的模拟中，微通道-ompF在四环素暴露的前10分钟内，双工体的平均细胞质浓度达到0.078μM(图3I). 同时，大多数细胞的可翻译性急剧下降ompF（ompF）mRNA，其平均浓度在添加四环素的瞬间在5.23分钟内衰减至其值的一半(图3J). 尽管mRNA水平急剧下降，但OmpF蛋白单体的平均浓度在更长的时间范围内衰减，在立即引入四环素时需要1.54小时才能达到其值的一半(图3K). 结果，四环素的平均外膜通透性从添加四环素瞬间的97.4±1.91nm/s（平均值±SD）下降到4小时后的21.0±2.60nm/s（均值±SD）(S7A图).

由于外膜通透性的降低直接限制了四环素内流的速度，我们最初认为主动外排可能最终克服内流并减少或完全排出内部四环素。与我们的预期相反，观察到的外膜通透性下降了4.6倍，但随之而来的不是降低，而是细胞质中四环素稳态浓度的轻微但显著增加(S7B图). 这种增加伴随着AcrAB-TolC外排泵周质浓度的显著降低，这表明外排减少可能是这种积聚增加的根本原因(S7C图). 在我们的模型和之前的实验中，四环素暴露诱导了两者更大幅度的上调急性呼吸系统综合征和acrB公司比tolC（通行费）(S6B图) [64]. 这种不成比例的基因调控，加上蛋白质合成的抑制，导致AcrAB-TolC浓度的降低。事实上，在四环素的亚MIC水平下，mRNA上调和蛋白质合成抑制之间的平衡发生了改变，导致AcrAB-TolC的浓度逐渐下降(S7C图). 相反，在四环素浓度高于MIC时，AcrAB-TolC的浓度没有比MIC时下降得更快，表明mRNA和蛋白质表达之间达到了平衡。

在全球范围内，我们的模型对不同水平的外源四环素的反应表现出了广泛的动态范围(图3L). 值得注意的是，尽管MIC（以蓝色突出显示）在四小时后菌落质量显著减少，但它并没有完全抑制生长，较高浓度的四环素具有越来越强的抑制作用。由于MIC通常是作为隔夜培养后防止可见生长所需的抗生素的最低浓度来测量的[69]，我们推测E类.大肠杆菌可能能够在MIC下存活，但只是生长太慢，在通常的潜伏期后无法产生可见的生长。在不同四环素浓度下测量的实验生长曲线定性地证实了这一假设，其中较高浓度导致延迟期越来越长，而分光光度计没有记录到生长[70].

有趣的是，四环素的生长抑制强度随着时间的推移而增加，在各种四环素浓度的对数标度菌落质量迹线中都可以看到轻微的弯曲(图3L). 在四环素暴露的第一个小时内，模拟细胞暴露在较高四环素浓度下，平均活性核糖体浓度较低，生长速度也较低，这与预期相符(图3M，左）。然而，到四环素暴露的第四个小时，活性核糖体的浓度几乎普遍进一步降低，降低了加倍率，并证实抑制作用随着时间的推移而增加(图3M，右）。四环素对蛋白质合成的抑制产生了一个正反馈回路，其中RNA聚合酶和核糖体的产量减少，RNA和蛋白质合成逐渐减少(S8图).

综上所述，我们在四环素补充培养基中的模拟结果表明，由于转录和翻译水平的正反馈，菌落水平的生长抑制可能会随着时间的推移自然复合，这证明了我们独特的多尺度方法的实用性。

氨苄西林选择性地杀死低浓度β-内酰胺酶的模拟细胞

接下来，我们考虑了氨苄西林，这是一种杀菌抗生素，可以抑制负责细胞壁合成和完整性的青霉素结合蛋白（PBP）的活性[71–74] (图4B). 周质中氨苄西林和其他β-内酰胺的存在干扰了PBP在细胞壁中交联肽聚糖链的能力，导致损伤的累积[75,76]. 严重受损的细胞随后溶解并释放其内部β-内酰胺酶到环境中，继续水解并灭活细胞外氨苄西林(图4A). 为了捕获氨苄西林诱导的损伤累积和最终溶解，因此我们需要模拟氨苄西林进/出周质的运输、氨苄西兰对PBP的结合和失活、细胞壁损伤的累积是氨苄西琳干扰细胞壁合成的函数，裂解触发从模拟中移除细胞，并将β-内酰胺酶释放到环境的反应扩散系统中。

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氨苄西林治疗的时空动力学E类.大肠杆菌聚居地。

（A-B）氨苄西林在菌落规模下的水解和细胞裂解示意图，以及氨苄西兰在细胞规模下的运输和细胞壁合成抑制示意图。（C） 在MIC（2 mg/L）处添加氨苄西林后的代表性菌落模拟快照。每个单元格的颜色表示日志2在基线葡萄糖模拟中，与细胞平均总间隙面积相比，总间隙面积（未被肽聚糖覆盖的面积）的倍数变化。以蓝色勾勒出细胞001111111结束的细胞谱系，并在面板D-J（D）中绘制为蓝色痕迹。Per-cell干质量开始时，单个细胞生长在含有1 mM葡萄糖且不含氨苄西林的M9最小培养基中约3.2小时（11550秒），此时，在MIC处添加氨苄西林，模拟继续约4小时（14550秒）。（E-G）从左到右，周质氨苄青霉素、AmpCβ-内酰胺酶和四环素添加周围分钟内活性PBP1A的每细胞浓度。（H-J）整个7.2小时（26000秒）模拟中细胞壁孔隙度、最大空穴面积和细胞壁拉伸的百分比浓度，从左到右。（K） 代表性模拟的整个菌落质量涉及六种不同浓度的氨苄西林（蓝色MIC）。这些模拟的数据也用于创建面板N。（L）AmpC、AcrAB-TolC、OmpF和PBP1A/B的Per-cell平均浓度标准化为z分数，并绘制为并列的核密度估计值，红色代表死亡的细胞，蓝色代表存活的细胞。星号表示统计显著性（p<0.01）。（M） AmpCβ-内酰胺酶浓度着色细胞的循环系统发育树。灰色区域的细胞死亡，红色环表示添加氨苄西林的时间。（N） 在五种不同浓度的氨苄西林（蓝色）中溶解之前，死亡细胞能够存活的平均代数。在数种氨苄西林浓度（橙色）下，培养物的光密度下降之前经过的代数[91].注释：显示的所有数据都来自于用快照将种子0初始化到基线葡萄糖模拟（也是种子0）3.2小时（11550秒）后运行的模拟，然后用不同水平的外部氨苄青霉素再持续4小时（14550秒）。

氨苄西林进入细胞的转运被建模为一个微分方程系统，该系统不仅包括通过AcrAB-TolC的扩散和主动外排，还包括β-内酰胺酶的水解(图4B). 氨苄西林通过外膜的流入是用菲克第一扩散定律模拟的。通过AcrAB-TolC的主动外排采用Hill方程进行建模，该方程由实验确定的K参数化M（M）和v最大值值[77]. 同样，使用以v为参数的Hill方程对水解进行建模最大值，KM（M）和文献中的希尔系数值[78]. 与四环素不同的是，氨苄西林在内质膜上的扩散被证明是微不足道的[77]因此，我们的模型中没有考虑。如前所述，相关参数包括在S1文本.

一旦进入周质，氨苄西林根据希尔方程模型共价灭活PBP。我们重点关注PBP1A和PBP1B，因为它们是负责细胞壁肽聚糖伸长和交联的主要PBP[71]. 我们使用实验测量的IC参数化了希尔方程模型50氨苄西林抑制PBP1B转肽酶活性[79]. 据我们所知，目前还没有直接测量氨苄西林对PBP1A转肽酶活性影响的数值。然而，已测量到PBP1A和PBP1B的氨苄西林结合亲和力在一个数量级内[74,80]. 假设氨苄西林抑制转肽的能力与其结合亲和力成正比，我们使用这一范围的文献值来估计IC50氨苄青霉素对PBP1A转肽酶活性的抑制作用在PBP1B测定值的一个数量级范围内，并且在MIC处模拟暴露于氨苄西林的单个细胞时也会导致死亡。

被氨苄西林结合的PBP被认为不能为我们的粗粒细胞壁模型提供交联肽聚糖。我们将细胞壁表示为圆柱形壳体表面上的二维晶格，由先前的测量指导，这些测量确定E类.大肠杆菌球囊大部分或全部为单层[81–83]. 晶格位置代表由一个肽聚糖单元覆盖的表面积，或者被交联肽聚糖占据，或者被视为“间隙”。肽聚糖链E类.大肠杆菌细胞壁基本平行，聚糖骨架沿细胞周长定向[81,84]. 因此，我们将PBP1A和PBP1B的细胞壁合成模拟为柱插入晶格，其中柱由交联肽聚糖链填充，其长度从符合实验数据的几何分布中取样(S9A图) [85]. 在每个时间步，我们通过未结合的PBP1A和PBP1B比例的加权平均值来衡量我们的代谢模型预测的新生肽聚糖的数量，以确定可以交联到晶格中的肽聚糖库。该池中的缺陷导致细胞壁合成无法与细胞生长同步，从而导致晶格中出现缺口。

细胞壁在其长轴方向上是弹性的[86]能够膨胀和收缩三倍而不会永久变形或破裂[87]. 当损伤累积时，细胞壁在膨胀压力下“破裂”，随后通过裂缝向外膨胀，最终内膜破裂[76,88,89]. 我们选择了细胞壁破裂时间的理论上限，方法是允许晶格根据需要拉伸以避免破裂，直至达到实验确定的最大可逆延伸，或最大孔洞扩展超过文献中预测的临界裂解阈值[87,89]. 细胞壁破裂后，我们通过从符合实验数据的指数分布中取样等待时间，计算了内膜膨胀的时间（约3.2分钟）(S9B图) [90]. 在延迟结束时，细胞被从模拟中移除，其所有内部氨苄西林和β-内酰胺酶单体被溢出到共享空间环境中，反应扩散系统模拟胞外酶活性。

与四环素一样，我们从基线葡萄糖模拟3.2小时（11550秒）的菌落快照开始氨苄西林模拟。我们注意到，在全球范围内，MIC（2 mg/L或5.724μM）将这些菌落暴露于氨苄西林，导致未被交联肽聚糖覆盖的细胞壁总面积显著但不均匀地增加(图4C)，随后细胞大量死亡(图4D). 细胞死亡并不集中在模拟氨苄西林暴露的开始或结束时，而是相对均匀地分散在整个过程中。值得注意的是，添加抗生素后，细胞的干质量生长轨迹没有明显变化。这表明，任何观察到的菌落质量生长抑制都必须主要通过细胞死亡发生。

在单细胞水平上，周质氨苄青霉素水平在几秒钟内迅速达到平衡。然而，与四环素不同，氨苄西林的稳态浓度因细胞而异（一分钟后CV=0.78）(图4E). 暴露于MIC 15分钟后，模拟的氨苄西林周质平均浓度为1.27μM，接近于相同暴露时间后活细胞中测得的1.7μM[77]. 这种变异伴随着亚世代表达的AmpC（水解氨苄西林的β-内酰胺酶）的高细胞间变异（一分钟后CV=0.83）(图4F). 周质氨苄西林浓度的这种变化反过来导致观察到的PBP抑制的广泛异质性（PBP1A活性部分的CV=0.39，PBP1B在一分钟后的CV=0.30）(图4G).

与氨苄西林和活性PBP水平达到稳定状态所需的秒数相比，细胞壁的损伤以分钟到小时的时间尺度累积(图4H–4J). 几乎所有死亡的细胞在裂解前都经历了孔隙度急剧增加和最大孔洞尺寸突然峰值(图4H和4I). 有趣的是，这两个测量值中的尖峰并不能保证死亡，一些细胞（如蓝色突出显示的血统细胞）至少可以暂时恢复。所有细胞，无论命运如何，随着暴露时间的延长，细胞壁都会越来越伸长(图4J).

为了测试氨苄西林反应的敏感性，我们模拟了菌落暴露于四种额外浓度的氨苄西兰，其MIC为四分之一到两倍(图4K). 与我们在不同四环素浓度下的模拟结果相比(图3L)氨苄西林暴露后的总菌落质量轨迹更加参差不齐，因为在氨苄西兰浓度较高时，细胞快速死亡和菌落较小导致每个单个细胞的损失都记录为总质量的急剧下降。

为了确定与氨苄西林耐药相关的最重要的细胞因子，我们检测了在氨苄西兰反应中起关键作用的五种蛋白质和蛋白质复合物的表达(图4L). 通过独立的双侧t检验，我们发现AmpC，即内源性β-内酰胺酶，是死亡细胞与活细胞中表达显著不同的唯一蛋白质（p<10−3). 鉴于细胞间变异性同样高(图4E和4F)，AmpC浓度可能通过控制周质氨苄西林浓度来影响细胞命运，这一假设得到了细胞平均AmpC和周质氨丙西林浓度之间强烈单调关系的支持(S10图). 相比之下，AcrAB-TolC多药外排泵、孔蛋白OmpF、PBPs 1A和1B的平均表达在存活和死亡细胞之间没有显著差异，这一发现被这些变量与氨苄西林周质浓度之间微弱或不存在的线性关系所证实(S10图).

我们还发现，亲缘关系密切的细胞，即那些有更近共同祖先的细胞，比亲缘关系较低的细胞更有可能获得同等的生存结果（即存活或死亡）（布隆伯格K=2.31，p=10−5). 这表明相关细胞具有共同的特征，这些特征会影响细胞存活。事实上，相关个体在AmpC浓度方面比随机个体更相似（Blomberg的K=0.708，p=3*10−5) (图4M). 自放大器C是一种亚世代表达的基因(图1C)在罕见的转录事件后，子细胞对AmpC的遗传可能保护这些密切相关的后代免受裂解。正如预期的那样，在添加氨苄西林之前AmpC表达较高的谱系（红圈内的八细胞期，图4M)更有可能有后代存活到模拟结束。相反，早期和模拟过程中AmpC表达水平较低的谱系（深色圆圈）极有可能在一代内灭绝。这再次证实了我们的结论，即AmpC的亚代表达支持了因氨苄西林暴露导致的细胞死亡的可变性。

最后，我们绘制了从抗生素添加到细胞裂解的平均代数，作为外部氨苄西林浓度的函数，从而可以直接比较我们的模拟输出与之前氨苄西兰诱导细胞死亡的测量结果(图4N) [91]. 比较表明，两者吻合良好，特别是考虑到我们模型的MIC低于实验测试应变的MIC。因此，我们的模型在较低浓度的氨苄西林下产生了更快的溶解，正如预期的更敏感的菌株一样。

简而言之，我们在含氨苄西林的培养基中的模拟显示出氨苄西兰的亚细胞水解与相关细胞甚至整个菌落的存活之间有着非常密切的联系，从而在广泛的空间和时间尺度上实现了机械桥接。

讨论

通过嵌入全细胞的多个实例E类.大肠杆菌模型转换为共享空间环境模型，我们首次能够将全细胞模型的分子机制转换为“全克隆”尺度。根据先前的结果验证模型后，我们研究了E类.大肠杆菌抗生素在多个时空尺度上的反应。在我们实现新功能的基因中，有些（例如。ompF（ompF）和tolC（通行费）)表现出高度、稳定的表达，而其他人（例如。马尔（marR）和放大器C)具有高细胞间变异性的尖峰表达。表型相似细胞的空间聚类很弱，很可能是由于最初相邻子细胞生长产生的热抖动和推力。在暴露于抑菌抗生素四环素的情况下，细胞的生长速度发生了浓度依赖性的下降，即使在浓度超过MIC的情况下也没有完全停止生长。尽管OmpF孔蛋白和AcrAB-TolC外排泵的表达异质，但周质和细胞质四环素的平衡时间和稳态浓度几乎没有变化。相反，AmpCβ-内酰胺酶浓度的随机变化在很大程度上导致稳态周质氨苄西林的细胞差异显著，并且很容易被确定为决定细胞存活的最重要因素。

有几个观察值得特别注意。首先，我们惊讶地发现，在不同的模拟中，相关细胞的相对位置差异很大。这一潜在事实，再加上姐妹细胞之间的固有差异，意味着在空间中很少有表型相似的细胞聚集。OmpF、TolC、MarR和AmpC单体表达的微弱且通常在统计上不显著的空间自相关证实了这一点(S1表). 特别是，尽管AmpC表达具有强烈的系统发育信号，但AmpC低表达的细胞并没有表现出形成紧密簇的强烈倾向，导致氨苄西林在我们的菌落中几乎随机死亡。这一发现对在这种规模的菌落上进行的显微镜实验有着有趣的启示，也就是说，因为从图像中天真地评估空间自相关可能不足以发现谱系的显著影响，即使它们存在。有趣的是，与我们模拟的扁平化、过度规划的微菌落不同，资源有限的生物膜先前被预测会经历自发的空间模式，这可能有助于合作表型[92,93]表明在我们的模型中可能没有考虑到细胞之间的粘附或其他交互作用。这种粘附作用在人体肠道中也至关重要，粘膜表面的粘附使共生菌和病原菌都能定植[94].

在我们的四环素模拟中，我们观察到一个潜在的正反馈回路，通过在中心法则的几乎所有步骤中减少活性机械来抑制生长。这就提出了一个问题：如果有的话，什么机制是真正的E类.大肠杆菌细胞可能会用来抵消这种抑制循环。一种可能性是围绕四磷酸鸟苷（ppGpp）诱导的rRNA和rpoA/B/C（编码RNA聚合酶亚单位）转录[95]. 虽然在氨基酸饥饿期间通常用于减缓生长，但众所周知，四环素与核糖体的结合也会抑制ppGpp的合成[96,97]. ppGpp水平的降低反过来会降低rRNA和RNA聚合酶的产生。虽然没有包括在这项工作中，但我们最近报道了全细胞模型的扩展版本，其中包括ppGpp介导的生长速度控制机制[98]. 我们相信，这些机制和其他计划机制的结合将使我们的模型能够更深入地了解E类.大肠杆菌对四环素的反应。

在我们的氨苄西林模拟实验中，我们没有预料到AmpC的表达会是活细胞和死细胞之间唯一的重要区别因素。事实上，体内在周质氨苄西林浓度高于0.8μM时，AcrAB-TolC外排泵的酶速率高于AmpCβ-内酰胺酶的酶速率[77,99]这表明外排对内源性氨苄西林抵抗的影响比水解作用更大。然而，尽管AcrAB-TolC表达存在显著的异质性，但与AmpC表达的变异性相比，它就相形见绌了。因此，大多数细胞的流出速率比水解速率更具可比性，水解速率的这些巨大差异成为氨苄西林胁迫下自然选择的基础。值得注意的是，我们模型中的所有AmpC表达均完全未被诱导，更令人惊讶的是，在氨苄西林浓度达到并包括MIC的情况下，一部分细胞能够存活并维持菌落数代生长。未来，值得通过实验测试AmpC的未诱导、亚代表达是否真的足以在培养物中的不同氨苄西林浓度下无限期维持菌落存活。

我们模型的未来改进可以朝着许多不同的方向进行。对于四环素，我们的模型目前并不代表完整的内部积累机制。先前的出版物提出，细胞外和细胞内隔间的pH值差异可能会导致累积量比仅由膜电位和浓度梯度解释的高出几倍[9,100]. 较高的四环素内部浓度可能会加强生长抑制水平，直至MIC完全停止生长。在使用氨苄西林的实验中，缺乏关键分裂机制的细胞通过细胞形状的逐渐丧失而不是典型的观察到的中间细胞损伤进行裂解，这强烈表明氨苄西兰诱导的死亡发生在分裂期间[101]. 事实上，发现氨苄西林与分裂相关的PBP结合[102]与大多数人相比具有更高的亲和力[74]包括PBP1A和PBP1B。展望未来，我们希望最终以遗传异质性和细胞间水平基因转移的形式纳入抗生素耐药性进化的其他机制[103]. 真实的E类.大肠杆菌细胞，表达增加acrAB公司与DNA错配修复基因的低表达相关多用途服务允许更快速的抗性表型自发进化[104]. 在我们的模型中，突变的积累可以简化为分裂时对基础转录率的小调节。此外，正如其他人所指出的那样[105]，暴露于抗生素的细胞会经历显著的代谢变化，并产生许多非微不足道的影响。随着对抗生素耐药性机制的认识不断增长，我们可以设想，我们的模型能够在没有明确编程的情况下重现这些代谢变化。

即使没有这些潜在的改进，通过使用Vivarium综合全细胞建模和基于代理的建模，这项工作也能够生成详细的、多尺度的和生物真实感的模拟，将蛋白质和代谢网络尺度上的分子机制和参数与小菌落尺度上的细胞机制相结合。未来的工作可能会向下扩展这种整合，以纳入蛋白质结构和动力学的分子尺度模型的知识[106]，向上，达到拥有多种微生物的更大种群规模[107,108]. 通过扩展我们的空间环境模型，我们可能能够研究肠道粘液的细菌利用率或在微流体装置中模拟实验。我们在这里描述的方法原则上可以适应更复杂的细胞和更多样的微环境，我们希望有一天这些想法能够被应用于创建肿瘤、组织、水华甚至整个微生物组的越来越多的多尺度模型。

方法

在这项工作中，我们采用了全细胞E类.大肠杆菌Macklin等人的补充中描述的模型[22]，将其转换为使用Vivarium接口[24]，为氨苄西林和四环素的反应添加了新的子模型，并将其嵌套在支持多个E类.大肠杆菌并行运行的模型。在这里，我们简要总结了如何调整模型，包括运行的模拟的详细列表，并描述了如何处理模拟输出以创建每个图面板。有关更多详细信息，请参阅S1文本.

Colony-scale模型

为了便于将多个全细胞模型集成到单个共享环境中，我们首先将原始的全细胞模型转换为E类.大肠杆菌到基于Vivarium的复合模型中。我们开发了单元测试，以确保转换后的子模型的输出与原始模型的输出相匹配，只留有很小的数值误差余量，并进行了组合测试，以比较两个完整模型的输出。这些测试的脚本位于迁移的文件夹活菌大肠杆菌存储库。

模拟实验

通过执行ecoli/实验/tet_amp_sim.第页中列出的带有命令行参数的文件表1模拟是在一个Google Compute Engine虚拟机（VM）上运行的，该虚拟机具有224个CPU、896 GB内存、一个500 GB的启动磁盘（带有debian-11-bullseye-v20211105映像）和一个250 GB的交换文件。模拟数据被发送到MongoDB服务器，该服务器运行在一个单独的Google Compute Engine虚拟机上，该虚拟机具有16个CPU、32 GB内存、一个500 GB的启动磁盘（带有debian-10-buster-v20210316映像）和一个2900 GB的数据库连接磁盘。本文分析的全套仿真运行大约需要两天的实时时间。

表1

所有仿真运行及其相应命令行参数的目录。
初始种子（-s）基线（-b）初始状态（-f）*初始菌落（-i）**[Tet.]单位：mM（-t）[Amp.]单位：mM（-a）运行时间（-r）***开始时间（-n）
基线葡萄糖模拟
0是的违约-00260020
100
10000
四环素MIC模拟
0不-13.375E-03号01455211550
1002
10000三
四环素敏感性模拟
0不-11.125E-03号机组01455211550
2003年2月25日
4.5电子03
9E-03号
四环素蛋白合成抑制
0不违约-005000
2005年5月
1.08E-04版
2.32E-04号机组
5E-04号机组
1.08E-03版
2.32E-03型
5E-03号机组
1.08E-02号机组
2.32E-02号机组
5E-02号机组
氨苄西林MIC模拟
0不-105.72E-03号机组1455211550
1002
10000三
氨苄西林敏感性模拟
0不-101.43E-03号机组1455211550
2.86E-03型
4.29E-03号
1.145E-02号机组

*默认值是指文件data/wcecoli_t0.json

**每个数字是指葡萄糖模拟的t=11550 s中保存的快照：1=种子0，2=种子100，3=种子10000。保存的快照的种子与抗生素sim的种子相匹配。

***额外2秒，因为在最后2秒的时间步长之后没有发出数据。

对于我们的每个实验条件（基线葡萄糖、+四环素和+氨苄西林），我们对不同的种子（0、100和10000）分别进行了三次重复的7.2小时模拟。所有模拟都是从空间环境中心的一个单元开始的。对于四环素和氨苄西林条件，我们在3.2小时后，通过使用相应葡萄糖模拟的保存快照启动每个模拟，在各自的最低抑菌浓度（1.5 mg/L和2 mg/L）下引入抗生素。这使我们能够比较给定初始种子的基线和抗生素模拟的结果。下面列出了这九个模拟（每个条件三个）基线葡萄糖模拟,四环素MIC模拟、和氨苄西林MIC模拟在里面表1.

此外，为了评估不同抗生素浓度对菌落生长的影响，我们对四环素和氨苄西林在MIC之外的浓度进行了模拟。除了引入的四环素（0.5 mg/L、1 mg/L、2 mg/L或4 mg/L）和氨苄青霉素（0.5 mg/L、1毫克/L、1.5 mg/L、4毫克/L）的浓度外，这些模拟的设置与上文所述的相同，因为我们对每个替代浓度只使用了一个复制品（在种子0上）。以下列出了这八种模拟（每种抗生素4种）四环素敏感性模拟和氨苄西林敏感性模拟在里面表1.

最后，在为氨基酰化tRNAs与核糖体拟合平衡结合常数的过程中，我们对广泛的四环素浓度范围进行了11次模拟，范围在0到0.05 mM之间的几个数量级。我们调整了结合常数，直到得到的剂量-反应曲线与文献中报道的无细胞系统的曲线相比较(S6A图). 以下列出了这些模拟四环素蛋白合成抑制.

请注意，我们的模拟配置为向单独的MongoDB虚拟机发送数据，该虚拟机具有中指定的互联网协议（IP）地址ecoli/composites/ecoli_configs/cloud.杰森。用户可以更改此IP地址或执行ecoli/实验/tet_amp_sim.第页使用-我标记将数据发送到与模拟运行在同一台机器上的MongoDB服务器。

分析

亚世代基因表达

在图1B，在基线葡萄糖模拟（种子10000）中，当所有细胞平均每个细胞表达不到一次时，基因被认为表现出亚代表达。所有其他基因均呈指数表达。如果基因被列在EcoCyc数据库的基因本体术语0046677下，则认为这些基因与抗生素反应相关[109]. 这个ompF（ompF）和ompC公司基因被添加到这个列表中，因为已知它们编码对抗生素扩散到细胞中很重要的孔蛋白[110].

平均蛋白质和mRNA浓度

在图2C，绘制的文献mRNA浓度估计为报告的平均mRNA分数（一个mRNA计数除以总mRNA计数）的乘积[52]以及平均总mRNA计数，除以代表性基线葡萄糖模拟中所有细胞分裂前的平均体积（种子10000）。在图2D，通过除以每代蛋白质单体的测量计数得出绘制的文献蛋白质浓度[51]在一个典型的葡萄糖模拟中，细胞分裂前的平均体积（种子10000）。为了与OmpF、TolC和AmpC单体在周质和外膜上的定位保持一致，使用周质体积计算OmpF，TolC，AmpC的浓度，我们假设周质体积为总体积的0.2倍[111]. 相比之下，所有mRNAs和MarR单体的浓度是用细胞质体积或总体积的0.8倍计算的。

瞬时增长率

在图3D，瞬时增长率计算为G=log2（米1/米0)/Δt，其中m1是当前干质量，m0是前一时间步长的干质量，Δt是时间步长（2秒）。除法运算前最后一个时间步长的瞬时增长率设置为0。瞬时增长率的倍数变化计算为G泰特/G公司glc，平均值，其中G泰特是四环素快照和G中每个细胞的瞬时增长率glc，平均值是基线葡萄糖模拟中所有细胞和时间点的平均瞬时增长率（种子0）。

在图3M，使用与瞬时生长速率相同的公式计算每个时间步长的倍增速率，并将其转换为1/hr，得出如果细胞以相同的瞬时速率继续生长一小时，其干质量将倍增的次数。在这两个散点图上，每个点表示添加四环素后的特定时间窗口内细胞的平均倍增率（例如，如果细胞在添加四环素后的一个小时之前生成，则只有在该小时之前的瞬时倍增率才会计入左侧图中的平均值）。在指定时间窗口内花费少于20秒的细胞被排除在外，因为它们缺乏足够的数据来计算准确的平均倍增率。

细胞壁完整性

为了证实在我们的模型中，相对于基线条件，引入氨苄青霉素导致细胞壁损伤增加，我们计算了总间隙面积的倍数变化为（P放大器*E类放大器)/（Pglc，平均值*E类glc，平均值)，其中P放大器是氨苄西林暴露细胞壁的孔隙率（晶格中的间隙数除以晶格中的位置总数），E放大器是氨苄西林暴露细胞壁静止长度的延伸，Pglc，平均值是基线葡萄糖模拟的所有细胞和时间点的平均孔隙度（种子0），Eglc，平均值是基线葡萄糖模拟（种子0）中所有细胞和时间点的平均休息长度。细胞壁完整性的相对变化被绘制为瞬时对数2在快照中使用色标进行折叠更改图4C.

在图4H–4J，由于数据伪影，没有绘制每个单元格的前10秒数据。在我们的模型中，细胞壁子模型仅每隔10秒更新一次模拟状态，以减少计算负担，导致分裂后的10秒钟内细胞壁参数没有更新以匹配。

评估死亡因素

为了确定哪些抗生素反应相关蛋白是细胞存活的主要决定因素，我们比较了存活细胞和死亡细胞之间几种蛋白和蛋白复合物的平均表达水平。模拟结束时存活的细胞被排除在外，因为尚不清楚它们能否存活到下一代。我们预测β-内酰胺酶、OmpF孔蛋白、AcrAB-TolC外排泵和PBP1A/1B可能有助于细胞存活。我们进行了双侧独立t检验，以比较存活细胞和死亡细胞之间的平均表达，使用Bonferroni校正来调整多重检验。在图4L，首先将每种蛋白质或蛋白质复合物的per-agent平均浓度转换为群体z-score，以便于可视化，然后将其分为存活和死亡群体，随后绘制z-scores分布图。

系统发育信号

我们使用了树探索环境（ETE）工具包的Python API[112]创建如中所示的系统发育树图4M并以Newick格式导出树的结构。R包植物醇使用了此导出文件[113]以Blomberg’s K的形式计算系统发育信号[114]两个特征：一个二进制变量表示每个细胞是否存活或死亡，另一个连续变量表示每个电池的平均AmpC浓度。这些K统计量的P值是使用n=10000随机排列系统发育的排列测试来估计的。具有统计学意义的K表明，相关的树叶往往比不相关的树叶更相似[114]. K值本身表明进化树的相关尖端是否比布朗运动进化模型下的预期更相似（K>1）或更少相似（K<1），布朗运动模型代表了典型的无选择中性进化[114–116].

要分析的代数

中的文献数据图4N是从1963年波曼和埃里克森的图2中手动提取的[91]使用软件工具[117]. 将原始数据倒置，以产生代到裂解（裂解时间除以代时间），而不是代时间除以裂解时间。计算模拟数据的相同指标为所有死亡细胞添加氨苄西林和细胞裂解之间的平均时间。

支持信息

S1图

葡萄糖吸收和扩散。

（A） 基线葡萄糖模拟的平均细胞葡萄糖摄取率分布（种子10000）。（B） 不同时间点环境中的交叉葡萄糖浓度。

（SVG）

S2图

模拟和实验蛋白质组和通量组。

（A） 基线葡萄糖模拟（种子10000）的平均蛋白质计数（每个细胞寿命的平均值，然后所有细胞的平均值）与之前发布的蛋白质组的比较[44]. （B） 基线葡萄糖模拟（种子10000）的平均中心碳代谢通量（每个细胞寿命的平均值，然后所有细胞的平均值）与之前发布的通量组的比较[45].

（SVG）

S3图

分区失步。

（A） 基线葡萄糖模拟中所有细胞分裂前的时间分布（种子10000）与测量的倍增时间相比E类.大肠杆菌应变B/r[46]. （B） 基线葡萄糖模拟中每代出生时间的标准偏差（种子10000）。

（SVG）

S4图

细胞之间的系统发育和物理距离。

每一级系统发育相关性的细胞对中心之间欧氏距离的箱线图，即二元系统发育树中成对细胞之间必须遍历的最小边数。在基线葡萄糖模拟（种子10000）的最后一个时间点（26000秒）计算细胞的物理距离和系统发育距离。

（SVG）

S5图

蛋白质单体浓度没有相关性。

OmpF、TolC、MarR或AmpC所有组合的细胞平均浓度散点图，具有最小二乘回归线和95%置信区间。Spearman r系数和Bonferroni调整的p值位于每个图的右上角。数据取自基线葡萄糖模拟（种子10000）。

（SVG）

S6图

调整四环素结合和基因调控参数。

（A） 与两个无细胞实验相比，我们模型中蛋白质合成的抑制百分比[60,118]针对一定范围的四环素浓度（如下所述四环素蛋白合成抑制在里面表1). （B） mRNA计数的折叠变化（通过看家基因正常化后间隙A在我们的模型（种子0、100和10000的数据组合）和先前的实验中，当菌落暴露于MIC的四环素时，直接与文献数据进行比较的mRNA计数[64].

（SVG）

S7图

随着时间的推移，细胞质四环素增加。

（A） MIC处外膜渗透性降低。（B） 一系列初始外部浓度的细胞质四环素浓度增加（与面板C相同的图例）。（C） 一系列初始外部浓度下AcrAB-TolC浓度的降低。在整个四小时四环素暴露过程中（种子0）。

（SVG）

S8图

随着时间的推移抑制转录。

MIC（种子0）暴露于四环素之前3.2小时和之后4小时，RNAP和RNA浓度降低。

（SVG）

S9图

氨苄西林子模型的拟合参数。

（A） 几何分布符合实验测定的肽聚糖链长度。（B） 指数分布符合细胞膨胀和裂解之间的测量时间。

（SVG）

S10图

蛋白质对周质氨苄西林浓度的影响。

AmpC、OmpF、PBP1A、PBP1B和AcrAB-TolC的细胞平均浓度与平均周质氨苄西林浓度的散点图。Spearman r系数和Bonferroni调整了右上角的p值。添加氨苄青霉素（t≥11550秒）后，MIC（种子0）处氨苄青霉素模拟数据的过滤数据。最后一个时间点的活细胞数据被排除在外，因为不知道如果时间更长，它们是否会存活或死亡。

（SVG）

S1表

空间自相关分析。

Moran’s I和Bonferroni在三个基线葡萄糖模拟（种子0、100、10000）结束时（26000秒）调整了OmpF、TolC、MarR和AmpC单体浓度的p值。

（CSV）

S1文本

补充信息文件。

此文件包含对新子模型和其他更改的更详细描述，包括模型构建期间使用的所有新参数的表。

（PDF格式）

致谢

我们感谢Covert实验室对这份手稿的有益讨论和最终审查。

资金筹措表

这项工作得到了Paul G.Allen Frontiers Group通过斯坦福大学Allen Discovery Center提供的支持，以及向M.W.C.颁发的斯隆基金会Matter-to-Life奖的支持。，美国国立卫生研究院NLM授予M.W.C.的R01奖，授予号为R01LM013229，美国国立卫生研究院NIGMS授予M.W.C.的R01GM140008。这是美国国家科学基金会微生物星球化学货币中心（C-CoMP）的出版物#025，该中心是由美国国家科学基金会资助的STC。E.A.获得了美国国立卫生研究院NIGMS颁发的F32奖项（编号：F32GM137464）的支持，M.Y.Y.获得了美国国家卫生研究院培训拨款（编号：T32GM136568）的支持。内容完全由作者负责，不一定代表国家卫生研究院、国家科学基金会、斯隆基金会或P.G.艾伦前沿小组的官方观点。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

数据可用性

当前版本模型的完整源代码可在GitHub上的vivarium-ecoli库中获得(https://github.com/CovertLab/vivarium-ecoli网站). 通过在DOI存档的代码版本上运行，可以重现结果10.5281/zenodo.7709618用于生成所有图形的数据文件存放在内政部10.5281/zenodo.7709450.

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2023年6月；19(6)：e101232。
2023年6月16日在线发布。数字对象标识：10.1371/journal.pcbi.1011232.r001

决定书0

约格·斯特林,学术编辑和丹尼尔A胡子,横断面编辑器
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2021年9月30日

尊敬的Covert博士：，

非常感谢您提交您的手稿“大肠杆菌的全群体建模”，以供PLOS计算生物学研究。

与该杂志审查的所有论文一样，你的手稿也由编辑委员会成员和几位独立审稿人审查。鉴于审查结果（本邮件下方），我们希望再次提交一份考虑到审查人员意见的经过重大审查的版本。

在我们看到修改后的手稿以及您对审稿人评论的回复之前，我们无法对出版做出任何决定。您修改后的手稿也可能会发送给审稿人进行进一步评估。

准备好重新提交后，请上传以下内容：

[1] 一封信，其中包含您对审查意见的详细回复列表，以及对您在手稿中所做更改的描述。请注意，在形成您的回复时，如果您的文章被接受，您可能有机会公开同行评审历史。记录将包括编辑决定书（含评论）和您对评论的回复。如果符合条件，我们将联系您选择加入或退出。

[2] 修订后的手稿有两个版本：一个版本突出显示或跟踪更改，以指示文本更改的位置；另一个是干净的版本（作为手稿文件上传）。

重要的附加说明如下所示。

请在60天内准备并提交修改后的手稿。如果您预计会有任何延误，请回复此电子邮件，告知我们预计的重新提交日期。请注意，60天到期日后收到的修订稿可能需要与新提交的稿件类似的评估和同行评审。

再次感谢您的提交。我们希望我们的编辑过程到目前为止是建设性的，欢迎您随时反馈。如果您有任何问题或意见，请随时联系我们。

真诚的，

乔格·斯特林

助理编辑

PLOS计算生物学

丹尼尔·比尔德

副主编

PLOS计算生物学

***********************

审查人对问题的回应

作者评论：

如果评论以附件形式上传，请在此处注明。

1号评论员：作者开发了一个软件Vivarium，它集成了全细胞模型（WCM）和基于代理的模型（ABM）。这是第一个基于主体的多尺度模型，它模拟了大肠杆菌的整个菌落。虽然全细胞模型侧重于单个细胞，但由于大肠杆菌的许多行为是在生物膜中的许多相互作用的背景下理解的，因此其对大肠杆菌的实用性降低了。因此，将WCM和ABM结合起来，后者可以模拟个体代理（或细胞或细菌）相互作用产生的种群行为，从而解决这一差距。作者开发了一个统一的模型，该模型模拟了在共享空间环境中相互作用的独立细胞，并将单个蛋白质表达与人群水平的表型联系起来。该模型用于证明抗生素耐药性，并模拟菌落对抗生素的反应。

在该模型中，主体不直接相互作用，而是通过环境的变化来调节相互作用，尤其是通过多体物理，包括扩散。交换的分子浓度也通过环境进行。使用该模型来研究抗生素的反应，作者的模型表明，β-内酰胺酶AmpC表达水平的变化，而非多药外排泵AcrAB-TolC的表达水平的改变，是在硝酸头孢存在下大肠杆菌存活的关键机制驱动因素。

然而，总的来说，这是一种新的方法，作者可以对更常用的抗大肠杆菌抗生素（例如多西环素、环丙沙星或呋喃妥因）进行建模，这些抗生素的耐药性特征很好，这可以进一步证明该模型的广度。

评论员2：本研究建立在作者先前建立的全细胞生态模型（WCM）的基础上，并将其扩展到人口规模。

WCM模型以高复杂性模拟单个Ecoli细胞。

与此形成鲜明对比的是，他们模拟抗生素反应的方法极其简单。从他们的人口模型中获得的见解微不足道，是他们假设的直接结果。

这里的新贡献是扩展到整个菌落模型并应用于抗生素耐药性。不幸的是，这些想法没有得到很好的发展。

抗生素耐药性涉及许多转录和代谢效应。虽然我们不希望对抗生素反应的所有细节进行建模，但对抗生素作用至关重要的成熟机制不应被忽视。使用整个细胞模型，他们可以很好地模拟复杂性，但不幸的是，这里不是这样。

作者建立抗生素治疗模型的方式过于简单。在该模型中，当药物达到作者选择的任意阈值时，就会杀死细胞。许多抗生素的主要靶点已经确定。通过抑制细胞壁酶来明确模拟药物作用应该很简单。之前的研究，例如来自Palsson实验室的研究，使用FBA模型来模拟抗生素靶点的抑制。作者可以很容易地建立在这个基础上。

作者从他们的模型得出结论，“AcrAB-TolC浓度对抗生素反应几乎没有影响”。这是不正确的，与几个已知的观察结果背道而驰。例如，他们如何解释外排泵抑制剂与许多抗生素协同作用且有效的事实？在全基因组敲除筛选中，acrAB基因的缺失大大增加了对抗生素的敏感性。总的来说，该模型过于简单化，无法做出这样的声明。

作者在讨论中表示（第370-74行），与β-内酰胺酶和孔蛋白转录、表达和活性相关的许多动力学参数未知，可能不准确。作者应报告这些参数，并对其结果进行某种类型的敏感性分析。如果大多数参数未知，可能是他们的模型没有设置来回答这类问题。

在摘要和讨论中，作者报告说，他们使用了一种名为vivarium的新软件，这是误导性的，因为这里没有介绍vivarium，但在不同的相关手稿中报道了它。作者不能在两篇单独的论文中声称新颖。

整个群体模型本身没有验证。第202行中报告的唯一“验证”是微不足道的，他们表示“加深了我们对模拟的信心”。作者发现，该模型在有氧和无氧条件下产生了更高的生长。这与群体模型无关。即使是一个简单的FBA模型也可以做到这一点。

抗生素如何诱导和调节AmpC？导入的时间延迟多长？它似乎是构成性表达的。我很惊讶ampC甚至在他们的模型中表达出来。它通常在临床菌株中表达。他们使用的模型不是临床菌株，或者至少在手稿中没有提到。AmpC的表达通常较低，但可诱导β-内酰胺暴露。

ampc和tolc的感应时间是多少？

模型中蛋白质特异性异质性参数是如何确定的？为什么Ampc比Acrab噪音更大？应该讨论其原因，如果是有意编程的话。

生产β-内酰胺酶有成本吗？如果不是，为什么会这样？

我认为在孔蛋白和belactase活性之间会有某种交互作用，但我很惊讶他们什么也没看到。

硝西芬从技术上讲不是抗生素。它是检测β-内酰胺酶的指示染料。

他们的模型目前认为药物治疗具有抑菌作用，但β-内酰胺具有杀菌作用。应从模拟中删除死单元格。

为什么死细胞会占据空间？

不知道他们是如何得到硝基头孢的MIC值的。最初的硝基头孢菌素文章报告为64 ug/ml

作者应该采取公正的方法，比较活细胞和死细胞的所有分子特性。

作者描述了与作用在细胞上的力有关的物理问题的实现。但该分析没有描述任何结果。我们从物理问题中学到了什么？

作者在引言和讨论中提到了抗生素耐药性调节剂marA，但在本文中从未使用过它。

第120行：WCM中的哪些分子被报告给vivarium？为什么不是全部？选择一小部分基因/特征的理由是什么？

第178行：作者报告了血糖水平的变化。其他营养素和分泌的代谢物呢？它们变了吗？这可以在热图中报告，并与抗生素反应相关。

**********

作者是否已将其手稿中发现的所有数据和（如果适用）计算代码全部公开？

这个PLOS数据政策要求作者无限制地提供手稿中所述研究结果的所有数据和代码，极少数例外（请参阅手稿PDF文件中的数据可用性声明）。数据和代码应作为手稿或其支持信息的一部分提供，或存放在公共存储库中。例如，除了汇总统计数据外，还应提供均值、中位数和方差度量值背后的数据点。如果对公开共享数据或代码有限制，例如参与者隐私或第三方数据的使用，则必须指定这些限制。

1号审核人：是

2号评审员：是

**********

《公共科学图书馆》的作者可以选择发表他们文章的同行评议历史(这意味着什么？). 如果发布，这将包括您的完整同行评审和任何附加文件。

如果您选择“否”，您的身份将保持匿名，但您的评论仍可能被公开。

你想在这次同行评审中公开你的身份吗？有关此选择的信息，包括同意撤回，请参阅我们的隐私政策.

1号审核人：否

2号评审员：否

图文件：

在修改您的提交文件时，请将您的图形文件上传到飞行前分析和转换引擎（PACE）数字诊断工具，https://pacev2.apexcovantage.com.PACE有助于确保数据符合PLOS要求。要使用PACE，您必须首先注册为用户。然后，登录并导航到UPLOAD选项卡，您将在其中找到有关如何使用该工具的详细说明。如果您在使用PACE时遇到任何问题，请发送电子邮件至gro.solp@serugif公司.

数据要求：

请注意，作为出版的一个条件，公共科学图书馆的数据政策要求您提供用于得出您手稿中概述的结论的所有数据。数据必须存放在适当的存储库中，包括在手稿正文中，或作为支持信息上传。这包括用于生成图表、直方图等的所有数值。有关PLOS生物学的示例，请参阅：http://www.plosbiology.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pbio.1001908#s5.

再现性：

为了提高结果的再现性，我们建议您将实验室协议保存在protocols.io中，在该协议中，可以为协议分配自己的标识符（DOI），以便将来可以独立引用。此外，PLOS ONE还提供了发布同行评审临床研究协议的选项。有关共享协议的更多信息，请访问https://plos.org/protocols？utm_medial=编辑-电子邮件&utm_source=authorletters&utm_campion=协议

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2023年6月16日在线发布。数字对象标识：10.1371/journal.pcbi.1011232.r002

作者对决定书0的回应

版权和许可证信息 PMC免责声明

2023年3月15日

附件

提交的文件名：wcEcoli Colonies公共图书馆CB响应.pdf

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2023年6月16日在线发布。数字对象标识：10.1371/日记.pcbi.1011232.r003

决定书1

丹尼尔A胡子,横断面编辑器
版权和许可证信息 PMC免责声明

2023年6月1日

尊敬的Covert博士：，

我们很高兴地通知您，您的手稿“大肠杆菌菌落的全细胞建模能够量化抗生素反应中的单细胞异质性”已被暂时接受，并将在《公共科学图书馆计算生物学》上发表。

在您的手稿被正式接受之前，您需要完成一些格式更改，您将在后续电子邮件中收到这些更改。我们团队的一名成员将与一组请求联系。

请注意，在您完成所需的更改之前，您的手稿将不会被安排出版，因此请尽快回复。

重要提示：编辑审查过程现已完成。从这一点开始，公共科学图书馆只允许更正拼写、格式或重大科学错误。要求进行重大修改，或任何影响对您作品的科学理解的修改，都会导致您手稿的出版日期延迟。

如果您、您所在机构的新闻办公室或期刊办公室选择新闻发布您的论文，您将自动退出早期出版。如果您或您的机构计划发布这篇文章，请立即通知我们。所有媒体都必须与巴勒斯坦解放组织协调。

再次感谢您对开放获取发布的支持；我们期待着在PLOS计算生物学上发表您的工作。 

顺颂商祺，

丹尼尔A胡子

横断面编辑器

PLOS计算生物学

丹尼尔·比尔德

横断面编辑器

PLOS计算生物学

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审查人对问题的回应

作者评论：

如果评论以附件形式上传，请在此处注明。

1号评审员：作者已充分阐述了所有意见。

2号评审员：作者在处理前一轮评审的意见方面做得很好。

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作者是否已将其手稿中发现的所有数据和（如果适用）计算代码全部公开？

这个PLOS数据政策要求作者无限制地提供手稿中所述研究结果的所有数据和代码，极少数例外（请参阅手稿PDF文件中的数据可用性声明）。数据和代码应作为手稿或其支持信息的一部分提供，或存放在公共存储库中。例如，除了汇总统计数据外，还应提供均值、中位数和方差度量值背后的数据点。如果对公开共享数据或代码有限制，例如参与者隐私或第三方数据的使用，则必须指定这些限制。

1号审核人：无

2号评审员：是

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《公共科学图书馆》的作者可以选择发表他们文章的同行评议历史(这意味着什么？). 如果发布，这将包括您的完整同行评审和任何附加文件。

如果您选择“否”，您的身份将保持匿名，但您的评论仍可能被公开。

你想在这次同行评审中公开你的身份吗？有关此选择的信息，包括同意撤回，请参阅我们的隐私政策.

1号审核人：否

2号评审员：否

2023年6月；19(6)：e101232。
2023年6月16日在线发布。数字对象标识：10.1371/journal.pcbi.1011232.r004

中标通知书

丹尼尔A胡子,横断面编辑器
版权和许可证信息 PMC免责声明

2023年6月13日

PCOMPBIOL-D-21-00770R1

大肠杆菌菌落的全细胞建模能够量化抗生素反应中的单细胞异质性

亲爱的Covert博士：，

我很高兴地通知您，您的手稿已被正式接受，将在PLOS计算生物学杂志上发表。您的手稿现在已交给我们的制作部门，我们会在适当的时候通知您出版日期。

通讯作者很快就会收到排版证明以供审查，以确保在生产过程中不会出现错误。请仔细审阅您手稿的PDF校样，因为这是最后一次更正错误的机会。请注意，重大变化，或那些影响科学理解工作的变化，可能会导致您的手稿出版日期延迟。

在你的最终文件上传后不久，除非你选择退出，否则你手稿的早期版本将在网上发布。早期版本的日期将是您文章的出版日期。最后一篇文章将发布到同一个URL，读者可以访问论文的所有版本。

再次感谢您对PLOS计算生物学和开放获取出版的支持。我们期待着出版你的作品！

带着亲切的问候，

索菲亚·弗伦德

PLOS计算生物学|卡莱尔大厦，卡莱尔路，剑桥CB4 3DN |英国gro.solp@loibpmocsolp公司|电话+44（0）1223-442824|ploscompbiol.org网站|@PLOSCompBiol公司

文章来自PLOS计算生物学由以下人员提供多环芳烃