PBMC分离过程中洗涤介质类型对SARS-CoV-2特异性T细胞下游特性的影响

2.2. PBMC处理方法

本研究比较了三种PBMC分离方法；它们被称为“PBS”、“RPMI”和“RPMI+”方法，它们的区别在表2.

2.3. SARS-CoV-2活化诱导标记物（AIM）T细胞检测

AIM T细胞分析用于检测SARS-CoV-2尖峰特异性T细胞(Dan等人，2021年). 简言之，PBMC在HR5培养基（RPMI-1640+25mM HEPES[Gibco，ThermoFisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆，美国]中解冻并重新悬浮，补充有5%的人类AB血清[GeminiBio，萨克拉门托，加利福尼亚州，美国]，1%的谷氨酸MAX[ThermoFisher Scitentific（马萨诸塞州立大学沃尔瑟姆），美国]和200mM青霉素/链霉素[Sigma-Aldritch，St.Louis，MO，USA]），含有20⁄单位/mL苯并酶核酸酶[MilliporeSigma，Burlington，MA，USA]。将细胞接种到1⁄×10的微量滴定板中⁶每个孔中的细胞，在37⁄°C和5%CO的HR5培养基中放置过夜₂然后，在HR5培养基中用1⁄μg/mL二甲基亚砜、1μg/mL尖峰巨池（spike MP，由La Jolla Institute for Immunology善意提供）或10⁄μg/mL植物血凝素-L（PHA）（MilliporeSigma，Burlington，MA，USA）刺激细胞23–24⁄h。Spike MP是一个肽库，包含跨越整个SARS-CoV-2 Spike蛋白的重叠15肽。刺激后，用1:100的僵尸紫外线活性染料（BioLegend，San Diego，CA，USA）在PBS中对细胞进行染色，然后用补充表1中的抗体混合物进行染色。然后将细胞重新悬浮在FACS缓冲液（2%FBS，0.1%叠氮化钠PBS）中，并使用BD LSR II流式细胞仪（BD Biosciences，San Diego，CA，USA）进行分析。每次运行都包括补偿珠。所有分析均使用FlowJo软件版本10.8.1（BD Biosciences，San Diego，CA，USA）进行。

CD4和CD8 T细胞的选通策略可以在补充图1A中找到。目标⁺CD4和CD8 T细胞被定义为CD134（OX40）⁺CD137型⁺（附图1B）和CD69⁺CD137型⁺（补充图1D）。通过CCR7和CD45RA染色（CD45RA）确定记忆亚群的分类⁺CCR7号机组⁺，天真_N个]; CD45RA⁻CCR7号机组⁺，中央存储器[T_厘米]; CD45RA⁻CCR7号机组⁻，效应器存储器[T_{相对长度单位}]; CD45RA⁺CCR7号机组⁻，终末分化效应记忆[T_EMRA公司])对于CD4和CD8 T细胞（补充图1C，E）。使用Spike MP AIM对样本进行记忆表型分析⁺T细胞刺激指数>2。AIM的选通策略⁺CD4和AIM⁺CD8 T细胞、单个OX40、CD69和CD137的表达以及记忆亚群是用荧光减去一个对照测定的。所有样本均显示出足够的PHA刺激多克隆扩增，定义为超过10%的AIM⁺CD4或CD8 T细胞，用于至少一种处理方法。

2.4. SARS-CoV-2干扰素-γ（IFNγ）荧光斑点试验

此外，还使用IFNγ荧光斑点试验检测SARS-CoV-2特异性T细胞(Mateus等人，2020年). 简单地说，PVDF膜FluoroSpot板（瑞典斯德哥尔摩Mabtech）在PBS（抗干扰素γ[克隆：1-D1K]；瑞典斯德哥尔摩Mabttech）中涂上5⁄μg/mL涂层抗体，在4⁄°C下过夜。将PBMC解冻并重新悬浮在添加了20⁄单位/mL苯酶核酸酶的HR5培养基中。对细胞进行计数，并将其接种到测微计板中，测微计为2.5⁄×10⁵每孔细胞数，其中细胞在HR5培养基中用1⁄μg/mL DMSO、1⁄µg/mL Spike MP或10⁄μg/mL PHA刺激23–24⁄h。所有刺激均进行三次。刺激后，用PBS-0.05%吐温20（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）清洗平板，并在室温下用PBS-0.1%牛血清白蛋白中的检测抗体（抗IFNγ-BAM[克隆：7-B6-1]；瑞典斯德哥尔摩Mabtech）孵育2⁄h（美国宾夕法尼亚州吉尔伯茨维尔Rockland Immunochemicals）。再次清洗平板，并使用荧光团结合抗体溶液（抗BAM-490；瑞典斯德哥尔摩Mabtech）在黑暗中培养1⁄h。由Mabtech IRIS FluoroSpot阅读器（瑞典斯德哥尔摩Mabtech.）读取板材。响应报告为斑点形成细胞（SFC）的平均数量/10⁶PBMC，一式三份。

3.2. 通过处理方法获得棘突特异性CD4 T细胞应答

通过基于流式细胞术的AIM分析，我们比较了使用PBS、RPMI和RPMI+方法处理的PBMC样本中CD4 T细胞对SARS-CoV-2棘突蛋白的反应(图1A） ●●●●。背景AIM的频率⁺不同处理方法的CD4 T细胞没有显著差异(图1B） ●●●●。PHA刺激后，RPMI+处理的样本显示AIM的频率显著降低⁺CD4 T细胞比PBS或RPMI-处理的样本（平均%AIM⁺在CD4 T细胞总数中，RPMI+[24.1%]vs.PBS[29.4%]和RPMI[28.7%]第页 = 0.034;图1C） ●●●●。

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图1

AIM的比较⁺PBS、RPMI和RPMI+处理方法之间的CD4 T细胞对SARS-CoV-2棘突蛋白的反应。（A） AIM差异的表示⁺CD4 T细胞，定义为OX40⁺CD137型⁺，对每种刺激条件下的不同处理方法进行了介绍。数字是AIM的百分比⁺CD4 T细胞总数的%。AIM的比较⁺对于（B）DMSO-和（C）PHA模拟条件，显示了处理方法之间的CD4 T细胞。Spike MP刺激AIM的（D）幅度和（E）刺激指数⁺CD4 T细胞也在不同处理方法之间进行了比较。所有钢筋均位于每组钢筋的中间位置。（F） AIM记忆子集差异示例⁺显示了通过处理方法的CD4 T细胞。数字是AIM中每个子集的百分比⁺CD4 T细胞；黑色对应于大量CD4 T细胞群，而红色对应于AIM⁺CD4人群。（G） 每个AIM中的更改⁺比较了不同处理方法对CD4记忆子集的影响。方框位于中间值、第1和第3四分位数，胡须位于最小值和最大值。使用Wilcoxon符号秩检验计算各组之间的统计差异。数据来自8个独立实验。（有关此图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的web版本。）

与其他方法相比，使用RPMI方法处理的样本中，峰值特异性CD4 T细胞反应的幅度显著高于或有更高的趋势（峰值特异性CD4 T细胞的中位数幅度、RPMI[0.13%]与PBS[0.10%]和RPMI+[0.11%]，第页Ş=Ş0.020和第页 = 0.05；图1D） ●●●●。然而，AIM的刺激指数没有明显差异⁺比较两种处理方法时的CD4 T细胞（平均AIM⁺CD4 T细胞刺激指数、PBS[23.3]、RPMI[26.5]、RPMI+[26.6]第页 > 0.10;图1E） ●●●●。然后我们检查了处理方法是否改变了这些抗原特异性群体的表型组成(图1F） ●●●●。经RPMI和RPMI+处理的样本与较低比例的T_N个细胞与PBS处理样品的比较（中值%T_N个AIM的⁺CD4、RPMI[15.5%]和RPMI+[14.6%]与PBS[22.6%]，第页 = 0.038和第页 = 分别为0.007；图1G） ●●●●。这种减少与T的比例显著增加相对应_{相对长度单位}RPMI处理样品的细胞数，RPMI+处理样品的趋势也更高（中值%T_{相对长度单位}AIM的⁺CD4、RPMI[47.8%]和RPMI+[43.7%]与PBS[35.5%]，第页 = 0.011和第页 = 分别为0.10）。

作为另一种分析，考虑了不同处理方法对CD4 T细胞上激活标记物OX40或CD137的个体上调差异(图2A-B）。与PBS处理的样品相比，Spike MP刺激在RPMI-和RPMI+处理的样品中诱导了显著更高的OX40表达（Spike特异性OX40的中位数⁺CD4大小、RPMI[0.79%]和RPMI+[0.76%]与PBS[0.52%]，第页 = 0.024和第页 = 分别为0.027；图2E） ●●●●。刺激指数也呈上升趋势，RPMI和RPMI+处理样品的刺激指数高于PBS处理样品（中位数OX40⁺CD4刺激指数、RPMI[22.3]和RPMI+[27.7]vs.PBS[11.3]，pö=0.10和第页 = 分别为0.008；图2F） ●●●●。相反，不同加工方法对CD4 T细胞上调CD137的差异相对较小(图2G-J）。

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图2

PBS、RPMI和RPMI+处理方法之间CD4 T细胞上OX40或CD137的单一表达差异。显示了每种处理方法的DMSO、Spike MP和PHA刺激后CD4 T细胞上单一（A）OX40或（B）CD137表达的代表性样本。数字是OX40的百分比⁺或CD137⁺CD4 T细胞总数的%。OX40比例的比较⁺介绍了（C）DMSO-和（D）PHA模拟条件下处理方法之间的CD4 T细胞，以及Spike MP刺激后OX40表达的（E）幅度和（F）刺激指数。对于CD137⁺比较（G）DMSO-和（H）PHA模拟条件下处理方法之间的CD4 T细胞比例，以及（I）Spike MP刺激后CD137表达的幅度和（J）刺激指数。所有钢筋均位于中间位置。使用Wilcoxon符号秩检验计算各组之间的统计差异。数据来自8个独立实验。

3.3. 通过处理方法获得峰特异性CD8 T细胞反应

还通过AIM分析鉴定了SARS-CoV-2标记特异性CD8 T细胞，并比较了不同处理方法(图3A） ●●●●。正如预期，我们观察到AIM的背景频率较高⁺CD8 T细胞比AIM⁺CD4 T细胞，但背景AIM⁺处理方法之间的CD8水平没有显著差异(图3B） ●●●●。音频接口模块的频率⁺PHA刺激的多克隆扩增中的CD8 T细胞在处理方法之间也相似，除了RPMI-处理的样品与PBS处理的样品相比显示出稍高的信号（平均%AIM）⁺在CD8总量中，RPMI占61.2%，PBS占54.7%，第页 = 0.036;图3C） ●●●●。

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图3

AIM的比较⁺PBS、RPMI和RPMI+处理方法之间CD8 T细胞对SARS-CoV-2棘突蛋白的反应。目标⁺CD8 T细胞被定义为CD69⁺CD137型⁺，和（A）背景、刺突特异性和PHA刺激的AIM差异的例子⁺给出了不同处理方法之间的CD8响应。数字是AIM的百分比⁺占总CD8 T细胞的百分比。AIM比例的比较⁺显示了（B）DMSO-和（C）PHA模拟条件下处理方法之间的CD8 T细胞。Spike MP刺激AIM的（D）幅度和（E）刺激指数⁺CD8 T细胞也在不同处理方法之间进行了比较。所有钢筋均位于中间位置。（F） AIM差异示例⁺显示了通过处理方法得到的CD8 T细胞记忆子集。数字是AIM中每个子集的百分比⁺CD8 T细胞；黑色对应于大量CD8 T细胞群，而蓝色对应于AIM⁺CD8人群。（G） 每个AIM中的变化⁺给出了不同处理方法之间的CD8存储器子集。方框代表中间值、第1和第3四分位数，而胡须代表最小值和最大值。使用Wilcoxon符号秩检验计算各组之间的统计差异。数据来自8个独立实验。（有关此图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的web版本。）

个体之间的特异性CD8 T细胞反应差异很大，处理方法之间的反应量没有显著差异(图3D） ●●●●。然而，经RPMI和RPMI+处理的样本趋势更高，AIM刺激指数明显更高⁺CD8 T细胞分别与PBS处理样品（平均AIM⁺CD8刺激指数、RPMI[9.2]和RPMI+[9.8]与PBS[4.4]，第页 = 0.07和第页 = 分别为0.029；图3E） ●●●●。通过观察记忆室，进一步表征了峰特异性CD8 T细胞反应(图3F） ●●●●。这些群体在加工方法之间的表型没有明显变化，除了T_厘米RPMI+处理样品中的细胞与PBS处理样品中细胞的比较（中值%T_厘米AIM的⁺CD8、RPMI+[0.5%]与PBS[1.1%]，第页 = 0.031;图3G） ●●●●。然而，这些比较没有AIM有力⁺CD4与PBS处理的样本一样多，具有AIM⁺SI为2的CD8应答。

对AIM进行了替代分析⁺CD8 T细胞通过处理方法检测激活标记CD69和CD137的个体上调差异(图4A-B）。背景CD69在RPMI和RPMI+处理的样本中的表达显著低于PBS处理的样本（CD69的中位数%⁺总CD8、RPMI[6.8%]和RPMI+[6.3%]相对于PBS[10.1%]，第页 = 0.018和第页 = 分别为0.008；图4C） ●●●●。与PBS样本相比，RPMI+样本在Spike MP刺激后CD8 T细胞上CD69上调的幅度显著高于PBS样本（中位数峰值特异性CD69⁺CD8震级，RPMI+[4.7%]vs.PBS[3.0%]，第页 = 0.049；图4E） ●●●●。RPMI和RPMI+处理的样本中较低的背景表达导致CD8 T细胞上CD69表达的刺激指数增加，尽管较高的基线表达使各组的这些指数较小（CD69中位数⁺CD8刺激指数、RPMI[2.0]和RPMI+[2.2]与PBS[1.4]，第页 = 0.010和第页Ş=Ş分别为0.024；图4F） ●●●●。与CD4 T细胞类似，背景和Spike MP诱导的CD8 T细胞CD137表达在处理方法之间没有显著差异(图4G、 I）。然而，与PBS处理的样本相比，RPMI和RPMI+处理的样本的CD8 T细胞上PHA刺激的CD137表达显著升高（CD137的中位数为%⁺在CD8总量中，RPMI占69.1%，RPMI+占66.8%，而PBS占61.7%，第页Ş=Ş0.017和第页 = 分别为0.036；图4H） ●●●●。此外，与PBS处理的CD8 T细胞相比，RPMI+处理的Spike MP刺激的CD137表达的模拟指数显著升高（CD137中位数⁺CD8刺激指数，RPMI+[5.8]vs.PBS[3.6]，第页 = 0.039;图4J） ●●●●。

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图4

PBS、RPMI和RPMI+处理方法之间CD8 T细胞上CD69或CD137的单一表达差异。显示了不同处理方法之间在DMSO、Spike MP和PHA刺激后CD8 T细胞上单一（A）CD69或（B）CD137表达的代表性样本。数字是CD69的百分比⁺或CD137⁺CD8 T细胞总数的%。CD69的比较⁺针对（C）DMSO-和（D）PHA模拟条件，介绍了处理方法之间的CD8 T细胞。还比较了不同处理方法对Spike MP诱导的CD69表达的（E）幅度和（F）刺激指数的影响。对于CD137⁺介绍了CD8 T细胞、（G）DMSO-和（H）PHA模拟条件下处理方法之间CD137表达的差异以及Spike MP刺激后（I）幅度和（J）刺激指数的变化。中央分隔带上的所有钢筋。使用Wilcoxon符号秩检验计算各组之间的统计学差异。数据来自8个独立实验。

我们要感谢研究参与者的时间和捐赠，我们也要感谢Pannaraj实验室的其他工作人员，Athena Thomassian、Laura Hernandez、Lauren Turner、Shirley Mendieta和Carolyn Jennifer Marentes Ruiz在样本收集和/或手稿审查方面的帮助。