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分子生物学细胞。2002年4月；13(4): 1313–1328.
数字对象标识：10.1091/mbc.01-10-0525
预防性维修识别码：项目经理102271
PMID：11950941

内体液泡上的双层氯氰菊酯涂层参与溶酶体的蛋白质分选

马丁·萨克斯，*† 西尔维·乌尔贝，‡ 维奥拉·奥尔肖特，*† 格尔·斯特劳斯，*和朱迪思·克伦普曼*†§
胡安·博尼法西诺，监控编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

在许多细胞中，内胚体空泡显示出功能未知的网格蛋白外壳。在此，我们表明，该涂层主要存在于早期内体上，并且在电子显微镜下具有典型的双层外观。通过免疫电子错吸分析，我们发现外壳中含有重链和轻链的网格蛋白，但缺少适配器复合物AP1、AP2和AP3，这与网格蛋白外壳在内吞囊泡和再循环内体上的不同。被毛对短时间与布雷费尔丁A孵育不敏感，但在磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂沃特曼的存在下消失。未发现内胚体包被区与微管蛋白或肌动蛋白的踪迹相关。通过定量免疫电镜，我们发现生长激素（GHR）和表皮生长因子的溶酶体靶向受体集中在被膜区，而循环转铁蛋白受体则不集中。此外，我们发现蛋白酶体抑制剂MG 132诱导截短的GHR（GHR-369）向循环囊泡重新分布，这与内胚体空泡相关的GHR 369向限制膜的非涂层区域重新分布一致。总之，这些数据表明，液泡内体上的双层网格蛋白外壳在将蛋白质靶向溶酶体方面发挥了作用。

简介

有文献记载的内吞作用最好的方式是受体介导的通过网格蛋白包被的囊泡摄取配体（综述于施密德，1997年). 受体被招募并集中在质膜上的氯氰菊酯包被的小孔中。包被囊泡形成后，网格蛋白被生长素和热休克蛋白70的协同作用去除(昂格威克尔等。, 1995). 未涂覆的囊泡以rab5调节的方式与早期内体（EEs）融合(鲁比诺等。, 2000). 高动态EE由液泡部分（也称为分选内体）和新兴的管状延伸部分组成。EEs的管状卵泡组织反映了它们在蛋白质分选中的关键作用。注定在溶酶体中降解的受体，如表皮生长因子受体（EGFR）和生长激素受体（GHR），被并入内胚空泡腔中的小泡中，这些小泡是由限制膜向内萌芽形成的（微自噬）。循环受体，如转铁蛋白受体（TfR）进入EEs和循环内体（RE）的管状延伸部分，并从那里返回质膜(斯托沃格尔等。, 1987;霍普金斯大学等。, 1994).

尽管在EEs的结构和分子表征方面取得了进展，但对内胚体内蛋白质分选的机制知之甚少。有人建议排序发生在“迭代细分”过程中(邓恩等。, 1989). 该模型基于再循环受体，配体在进入分选内体的酸性环境时会释放出来。该模型提出，受体快速且持续地进入管状延伸部分，以再循环到质膜，而配体和大部分液相被保留在分选内体中。事实上，荧光脂质以类似于TfR的动力学循环到质膜，支持组成膜循环的想法(市长等。, 1993). 此外，TfR的再循环与其细胞质尾部的存在无关(京等。, 1990). 虽然不能排除存在额外的、有效的RE分类机制(van Dam和Stoorvogel，2002年)，这些发现与默认遵循回收途径的模型一致(边缘等。1999年)这意味着对溶酶体的靶向是信号介导的。事实上，已有大量蛋白质被描述为通过信号传导到溶酶体，包括EGFR、GHR、白细胞介素2受体β链和一些G蛋白偶联受体(精细（Subtil）等。, 1998;莱蒙和特劳布，2000年;Marchese和Benovic，2001年;谢诺伊等。, 2001). 对于EGFR，内质小泡中的结合是溶酶体靶向的先决条件，这取决于其细胞质尾部的二亮氨酸基序及其激酶活性(费尔德等。, 1990;科尔尼洛娃等。, 1996;基尔等。1999年). 最近的证据也表明泛素蛋白酶体系统在EGFR溶酶体靶向中的作用。泛素连接酶c-Cbl是EGFR的负调节因子，在EGFR刺激下被磷酸化，之后它与EGFR细胞质尾部结合并介导受体的泛素化(伽利斯特奥等。, 1995;列夫科维茨等。1998，1999;约阿塞罗等。1999年). 因为EGFR在溶酶体中被降解(邓恩等。1986年)泛素化可能具有调节功能，而不是降解功能。需要进一步研究以确定c-Cbl和EGFR之间的相互作用是否发生在质膜和/或内体水平(列夫科维茨等。, 1998;斯坦格等。, 2000;德梅尔克等。, 2001). 泛素-蛋白酶系统也参与GHR的内吞。最近，我们发现它既调节了生长激素（GH）–GHR复合物从质膜的初始内化，也调节了溶酶体在胞内水平的分选步骤(戈韦尔等。, 1997，1999;萨克斯等。, 2001;范·克霍夫等., 2001). 这些数据与最近在酵母中的研究一致，表明货物蛋白的泛素化可能作为一个信号，将其并入流行隔室的内囊泡中(卡兹曼等。, 2001;雷吉奥里和佩勒姆，2001年;Urbanowski和Piper，2001年).

在各种形态学研究中，发现除了质膜和反式-高尔基体网络（TGN）也存在于液泡分选内体以及管状RE的膜芽上(斯托沃格尔等。, 1996;德尔安吉丽卡等。, 1998;福特等。, 1998;普雷克里斯等。, 1998，1999;德威特等。1999年). 网格蛋白外壳在液泡分选内体中的作用尚不清楚，但最近研究表明，当肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物（Hrs）过度表达时，网格蛋白向内体液泡的募集增加(莱博格等。, 2001). Hrs和网格蛋白向这些膜的募集取决于磷脂酰肌醇3-激酶（PtdIns3-激酶）的活性。值得注意的是，Hrs的过度表达并不影响TfR的循环，但会导致EGFR在Hrs阳性内体中的积累，这表明磷脂酰肌醇3-磷酸（PtdIns3P）和Hrs在向溶酶体的转运中起作用。最后，高水平的可溶性N个-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE）蛋白syntaxin 7在早期内胚空泡分选内体的氯氰菊酯涂层膜域中被发现(Prekeris公司等。1999年).

免疫电子显微镜（immunoelectronic microscopy，immunoEM）提供了以高形态分辨率显示内体亚结构域并分析其蛋白质组成的可能性(格乌泽等。, 1983;Klumperman公司等。, 1993). 在此，我们使用这种方法研究了不同类型的货物蛋白和调节蛋白在内胚体涂层和非涂层区域的分布。我们发现，突触合蛋白7和Hrs以及溶酶体结合的GHR和EGFR集中在分选内体的涂层区域，而再循环TfR则不集中。我们的数据与内体网格蛋白外壳在蛋白质向溶酶体分选中的作用一致。

材料和方法

材料和抗体

GH是伊利·礼来（印第安纳波利斯）的礼物。表皮生长因子（EGF）购自Invitrogen（Carlsbad，CA）。用于GH生物素化的6-（生物酰胺）己酸磺基琥珀酰亚胺是从皮尔斯化学公司（伊利诺伊州罗克福德）。GH按所述进行生物素化(边沁等。, 1994). 生物素化转铁蛋白（Tf）购自西格玛化学公司（密苏里州圣路易斯）。Brefeldin A、nocodazole和wortmannin从Sigma Chemical购买，latrunculin A从Molecular Probes（Eugene，OR）购买，MG 132从Calbiochem（San Diego，CA）购买。为了检测GH，用人GH培养细胞并用豚鼠抗人GH多克隆抗体标记（Biogenesis，Poole，Dorset，United Kingdom），或用生物素化GH培养并用兔抗生物素多克隆抗体进行标记（Rockland，Gilbertsville，PA）。在之前的研究中，我们表明这两种方法产生了相同的数据(萨克斯等。, 2001). 兔抗兔GHR细胞溶质尾的兔抗血清如前所述(斯特劳斯等。, 1996); 兔抗syntaxin7抗血清(普雷克里斯等。1999年)抗β-微管蛋白的小鼠单克隆抗体（mAb）是R.Scheller博士（斯坦福大学，加利福尼亚州帕洛阿尔托/基因泰克，加利福尼亚州南旧金山）赠送的礼物。针对氯氰菊酯轻链的兔抗血清是德国汉诺威医学院E.Ungewickell博士赠送的一份礼物。抗β1/β2-adaptin的小鼠单克隆抗体是T.Kirchhausen博士（马萨诸塞州波士顿哈佛大学）赠送的礼物。绵羊抗EGFR抗血清是从Invitrogen中获得的。兔抗γ-adaptin抗血清来自Sigma Chemical。抗生物素兔多克隆抗血清来自Rockland。抗肌动蛋白的小鼠单克隆抗体（克隆C4）来自ICN Biomedicals（俄亥俄州克利夫兰）。针对人类TfR的小鼠单克隆抗体购自Zymed Laboratories（加利福尼亚州南旧金山）。抗氯氰菊酯重链蛋白的小鼠单克隆抗体来自于转导实验室（肯塔基州列克星敦），抗鼠IgG的多克隆兔抗体来自于DAKO（丹麦格洛斯特鲁普）。针对人类Hrs的C末端肽（PPAQGSEAQLISFD）制备兔抗Hrs多克隆抗体。通过细胞提取物的免疫印迹和短暂过度表达绿色荧光蛋白和血凝素标记Hrs的细胞的免疫荧光，竞争实验证实了抗体的特异性。

细胞

含有热敏E1酶的中国仓鼠细胞系ts20(库尔卡等。1988年)稳定转染全长兔GHR cDNA（wtGHR细胞）或编码截短GHR 1-369的cDNA（GHR-369细胞）(戈韦尔等。, 1998). 细胞在30°C的允许温度下，在Eagle最低必需培养基（MEMα）中生长，该培养基补充有4.5 g/l葡萄糖、10%胎牛血清（FBS）、青霉素、链霉素和0.45 mg/ml遗传素。在实验中，细胞生长在不含基因素的60毫米培养皿中。为了增加GHR的表达，在使用前18小时向细胞中加入10mM丁酸钠。HeLa细胞在含有10%FBS、青霉素、链霉素和2 mM的DMEM中培养我-谷氨酰胺。

GH、EGF的内化与生物素化转铁蛋白的摄取

为了耗尽生长因子，将表达GHR的细胞在含有0.1%牛血清白蛋白（BSA）的MEMα中培养1小时，然后添加8 nM GH或生物素化GH，再培养30或60分钟。然后用含有0.1%BSA的MEMβ清洗细胞三次，固定，并按如下所述进行免疫EM处理。如有指示，仅在实验开始前1小时添加溶于乙醇或溶剂中的20μM MG 132。固定前10分钟添加溶于甲醇的布雷费尔丁A（10μg/ml）。固定前45分钟，添加溶于二甲基亚砜中的Wortmannin（100 nM）。固定前2 h或20 min分别加入溶于二甲基亚砜中的诺卡唑（10μg/ml）或溶于甲醇中的4μM latrunculin A。BSA与5-nm胶体金结合（520nm处的最终OD为5）用于标记内吞途径。在使用之前，BSA-gold在4°C下与磷酸盐缓冲盐水（PBS）进行通宵透析。细胞与BSA-gold孵育5分钟，然后固定或孵育10分钟，然后进行清洗步骤，并在没有BSA-good的情况下进一步孵育15分钟。生物素化转铁蛋白的铁饱和度如前所述(斯托沃格尔等。, 1987). 对于Tf摄取，将wtGHR或GHR-369细胞在含有0.1%BSA的MEMα中在允许温度下培养1h。将生物素化Tf添加至最终浓度20μg/ml，然后再将细胞培养30分钟。HeLa细胞在含有0.5%FBS的DMEM中培养过夜。添加EGF（100 nM），然后再培养细胞10分钟，然后固定。

免疫电镜

将细胞固定在2%多聚甲醛和0.2%戊二醛的0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中。为了观察GHR-369细胞中的GH，使用pH 7.4的0.1 M磷酸盐缓冲液中的4%多聚甲醛。为了保存微管细胞，将其固定在PHEM缓冲液中[60 mM哌嗪-N、 N′-双（2-乙磺酸），25 mM HEPES，2 mM MgCl2，10 mM EGTA，pH 6.9]。如前所述，按照蛋白A-金法对细胞进行超薄冷冻切片和免疫标记处理(狭槽等。, 1991). 简而言之，用0.02M甘氨酸清洗PBS中的固定细胞，轻轻地从含有1%明胶的PBS培养皿中刮取，并在PBS中12%明胶中造粒。细胞颗粒在冰上凝固并切成小块。为了进行低温保护，在4°C下用2.3 M蔗糖将试块渗透过夜，然后安装在铝针上并在液氮中冷冻。为了提取超薄冰冻切片，使用了2.3M蔗糖和1.8%甲基纤维素的1:1混合物(利乌等。, 1996).

定量免疫电镜

我们根据BSA-金摄取的不同时间点以及内腔薄片中可见的内囊泡数量，将内腔空泡隔定义为早或晚（表​（表1；1;萨克斯等。, 2001). 由于膜的连续性在切片平面上并不总是可见的，因此不能总是区分内体相关的再循环小管和分离的RE。因此，我们将距内胚体相关小管200 nm内的内胚体空泡直径为40–60 nm的所有小管上皮细胞膜纳入内胚体关联小管类别，而距内胚体内空泡距离较远的此类膜则纳入REs类别。初级内吞小泡与循环小管和内吞体的区别在于其电子透明腔和直径较大的～100 nm(Sachse公司等。, 2001). 溶酶体通过电子致密无定形材料的存在和/或内膜片的存在而被识别。

表1

内化BSA-金在不同类别内体上的分布

BSA摄入内囊泡数量
溶酶体
≤23–56–9≥10
5分钟46.3  ± 7.441.3  ± 4.912.0  ± 2.00.4  ± 0.60  ± 0
10分钟+15分钟追逐14.3  ± 3.523.9  ± 3.639.5  ± 2.210.3  ± 2.312.0  ± 2.1

HeLa细胞与BSA结合到5-nm金孵育指定时间点。数字表示BSA-gold阳性的内体空泡百分比（±SD）。注意，这些计数中不包括初级内吞囊泡。 

建立GH、GHR、GHR-369、Tf、TfR和EGFR在EE液泡子域上的相对分布（表​（表2，2，​,3,三、和​和5），5)，在低倍下选择网格区域以获得良好的超微结构，然后在15000倍的放大率下沿线性轨迹进行扫描。所有距离EE液泡20 nm范围内的金颗粒被认为是膜相关的，并被分配到它们所在的亚结构域。对于所有定量，至少进行了三次独立的计数。内胚体亚结构域上蛋白质的出现以EE液泡限制膜上总标记的百分比表示。测量涂层的相对表面积（表​（表22和​和3），三)，随机拍摄EE液泡照片。在最终放大81000倍的照片上放置一层透明覆盖层，取代相距5 mm的正方形网格线。然后通过计算与线晶格重叠的交叉点的数量来测量液泡的限制膜的长度，并计算内涵体亚结构域占据的限制膜的百分比。通过将存在于内胚体亚结构域上的给定蛋白质的金标记百分比除以该亚结构域所占据的限制膜的百分比，计算标记表面比率（表​（表22和​和3）。三). 当该比率>1.00时，该亚结构域中蛋白质的标记密度超过随机分布，表明富集。同样，比率<1.00表示标记密度低于内吞体限制膜上的随机分布。将涂层亚结构域的标记表面比率除以非涂层亚结构域的标记表面比率，得到涂层在非涂层结构域上的富集或排除因子。为了确定MG 132对GHR369细胞中GH分布的影响（表​（表4），4)对于每种情况，进行三次独立的计数，并用总标记的百分比表示给定隔间内GH的发生率。最后，通过计算也含有GH的Tf阳性RE的百分比，在三个独立的疗程中确定了GH和Tf在囊泡/管状RE中的共定位水平。

表2

TfR、Tf、GHR和GH在wtGHR细胞早期内胚空泡界膜上的分布

涂层区域无涂层区域未定义
A标签（%）
 交通部9.1  ± 1.777.3  ± 5.613.6  ± 4.3
 Tf（传递函数）8.8  ± 1.874.6  ± 1.316.6  ± 0.7
 GHR公司24.4  ± 4.460.7  ± 1.914.9  ± 3.1
 GH公司21.2  ± 4.259.7  ± 5.119.1  ± 1.3
B表面积（%）11.374.714
C标签表面比率
 交通部 0.8 1 1
 Tf（传递函数） 0.8 1 1.2
 GHR公司 2.2 0.8 1.1
 GH公司 1.9 0.8 1.4

让WtGHR细胞内化生物素化GH或-Tf 30分钟，并标记生物素、TfR或GHR。（A） 数字表示在EE液泡限制膜的亚结构域上发现的指示蛋白质的总金标签（±SD）的百分比。横截面上看不清楚的膜区域称为未定义区域。（B） 包被膜和非包被膜面积对内涵体限制膜总量的相对贡献以百分比表示。（C） 通过将一个亚结构域中的总标记百分比除以该亚结构域所占的膜百分比（n=50个内体），计算给定蛋白质在任一内体亚结构域的标记表面比率。与蛋白质在内胚体限制膜上的随机分布相比，比率>1.00表示标记密度增加，<1.00表示减少。 

表3

TfR和EGFR在HeLa细胞早期内涵体液泡限制膜上的相对分布

涂层区域非涂层区域未定义
A标签（%）
 交通部5.9  ± 2.281.7  ± 1.812.4  ± 3.9
 表皮生长因子受体18.2  ± 2.470.0  ± 7.311.8  ± 5.0
B表面积（%）5.585.39.2
C标签表面比率
 交通部1.1 11.3
 表皮生长因子受体3.3 0.81.3

Hela细胞内化EGF 10分钟，并标记EGFR或TfR。（A） 数字表示在内胚体液泡限制膜的亚结构域上发现的总金标记（±SD）的百分比。横截面上看不到的膜区域，以及无法判断是否有涂层的膜区域被称为未定义区域。（B） 涂层和非涂层膜面积对限制膜总面积的相对贡献以百分比表示。（C） 标签表面比率按表计算​表22（n=50个内体）。 

表4

存在或不存在MG 132时GH–GHR-369复合物的亚细胞分布

质膜氯菊酯涂层结构内生小泡电气工程师LE公司内皮相关小管再循环内体
控制36.1  ± 2.27.3  ± 1.43.9  ± 1.029.1  ± 1.516.3  ± 2.72.2  ± 1.15.1  ± 1.0
MG 132型46.3  ± 6.17.7±1.84.2  ± 0.717.5  ± 4.24.5±1.65.6  ± 0.914.2±3.0

用或不用20μM MG 132预培养细胞1h。添加生物素化GH后，继续培养60分钟，然后固定和处理免疫电镜。用生物素抗体标记细胞。数字表示在所示隔室中发现的总金色标签（±SD）的百分比。材料和方法中提供了不同类别的详细定义。 

表5

MG 132存在或不存在时GH–GHR-369复合物在早期内体液泡中的分布

限制膜
卢门
涂层无涂层未定义内囊泡
控制15.0  ± 3.232.5  ± 2.210.2  ± 2.642.3  ± 4.2
MG 132型12.4  ± 2.643.5  ± 2.613.3  ± 3.130.8  ± 4.3

用或不用20μM MG 132预培养细胞1h。添加生物素化生长激素后，继续孵育60分钟，然后固定和处理免疫电镜并用抗生素标记。数字表示在内胚体液泡的亚结构域上发现的总金标记（±SD）的百分比。 

结果

不同细胞类型的内分泌物上存在双层氯菊酯涂层

内胚体空泡上的涂层是一种普遍现象，我们在许多细胞类型中观察到，例如HeLa、中国仓鼠卵巢、幼仓鼠肾脏、PC-12、HepG2和ts-20细胞，尽管频率不同。最近的几项研究表明，这些外套中含有甲氰菊酯(普雷克里斯等。, 1998;索基纳等。1999年;拉姆等。, 2000). 通过仔细的电子显微镜检查，我们注意到，与细胞中其他部位的网格蛋白涂层不同，内胚层由两层组成，一层薄且高度电子致密的层，与内胚层空泡的限制膜紧密相对（图​（图1A，1A、 箭头），以及面向细胞质的第二个更模糊、电子密度更低的层（图​（图1A，1A、 箭头）。一个狭窄的、电子透明的边缘将两层分开（图​（图1C1C和​和2C）。2C） ●●●●。涂层的这种特征性双层外观在超薄冰冻切片中很明显（图​（图1），1)以及在传统制备的锇固定和电子嵌入细胞的电子显微镜切片中（我们的未发表数据）。涂层大多是扁平的，这让人联想到在质膜上有网格状的氯氰菊酯涂层。值得注意的是，最近在一个黑色素瘤细胞系的液泡内体中间产物上描述了具有类似形态外观的网格蛋白外壳(拉波索等。, 2001). 由于涂层的特征外观，我们将其进一步称为双层涂层。重要的是，内胚体循环小管总是起源于无涂层区域（图​（图1），1)向内萌芽的轮廓中没有被毛（图​（图1B）。1B） ●●●●。

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内胚体液泡上的双层涂层含有网格蛋白重链和轻链。（A） 中国仓鼠卵巢细胞。在EE的扁平涂层区域发现了氯氰菊酯重链（10-nm金）。氯氰菊酯涂层由一个与内胚体限制膜相对的窄的电子致密层（箭头）和一个面向细胞质的较模糊层组成（箭头）。请注意，循环管与涂层区域相对出现（小箭头）。（B） 同样在wtGHR细胞中，在涂层区域发现了氯氰菊酯重链（10-nm金）（箭头所示）。注意，在向内发芽的小泡上没有发现标签（小箭头）。与A中一样，出现的小管与涂层区域没有连续性（小箭头）。（C） wtGHR细胞中早期内体的示例，在涂层区域标记为氯氰菊酯轻链（10-nm金）（箭头）。PM，质膜。棒材，200 nm。

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双层涂层中没有氯菊酯适配器复合物AP1和AP2。（A） HeLa细胞标记γ-adaptin（10-nm金）。标签出现在EE附近的囊泡和小管上，但双层涂层上没有标签（箭头所示）。（B） WtGHR细胞标记β1/β2-adaptin（10-nm金）。标签位于氯氰菊酯涂层的凹坑（箭头），但不在双层涂层中（箭头）。（C） WtGHR细胞与10 mM brefeldin A孵育10分钟，并标记有网格蛋白重链（10-nm金）。此时，brefeldin A不会干扰双层涂层（箭头）。LE，晚期内体；PM，质膜。棒材，200 nm。

为了确定双层包被的内体在内体途径中的位置，我们将HeLa细胞与偶联于5-nm金的内吞示踪剂BSA孵育5或10分钟，然后在没有BSA金的情况下追逐15分钟。从EE到晚期内胚体（LE）成熟时，内胚体液泡的腔中积聚了更多的内囊泡(van Deurs公司等。, 1993). 因此，作为区分早期和晚期内体液泡的额外标准，我们还根据横截面中可见的内囊泡数量对其进行了分类。在摄入BSA-金5分钟后，>85%的BSA-含金内体的内部小泡少于五个（表​（表1）。1). BSA-gold只能接触到一小部分具有6到9个或更多内部囊泡的内体。电子致密溶酶体总是没有标记。在10分钟摄取和15分钟追踪后，>60%的BSA-金阳性液泡含有5个以上的内囊泡，溶酶体也被显著标记。BSA-gold早期或晚期到达的内体形态与在其他细胞类型中观察到的非常相似(Klumperman公司等。, 1993;克莱杰梅尔等。, 1997;德威特等。1999年). 因此，我们最早定义了不超过五个内部囊泡的内体。需要注意的是，该定义仅包括液泡部分，而不包括再循环小管。在这些EE中，>30%的EE在截面平面上含有双层涂层。相比之下，只有6.5%的LEs含有外套。我们得出结论，双层外套主要与EE液泡有关。因此，在我们研究的其余部分中，除非另有说明，我们将重点放在电气设备上。

双层涂层中不存在氯菊酯适配器复合物AP1、AP2和AP3

接下来，我们进行了一系列免疫标记，以确定已知的外壳成分是否可以定位在双层外壳中，包括一种与已知的网格蛋白轻链无关的新型网格蛋白同系物(线路接口单元等。, 2001). 如图所示​图1，1除氯氰菊酯重链外，在双层涂层中容易检测到氯氰菊酯轻链，这表明这些涂层中存在的氯氰胆碱是传统类型的。网格蛋白在质膜和TGN上的组装分别依赖于衔接蛋白复合物AP2和AP1。通过免疫电镜，在内胚小管上发现γ-adaptin(福特等。, 1998;马拉德等。, 1998). 通过免疫沉淀和荧光显微镜观察，α-adaptin（来自AP2）和γ-adapten（来自AP1）亚单位均定位于内胚体(索基纳等。1999年). 此外，Kornfeld及其同事(特劳布等。, 1996)在分离的溶酶体上定位AP2和网格蛋白。为了观察这些适配器复合物是否存在于EEs的双层外壳中，我们首先使用了一种分别识别AP1和AP2的β1和β2 adaptin的抗体。质膜和高尔基体区域的氯氰菊酯包被的小孔和小泡被该抗体清楚地标记，而双层内胚层始终没有标记（图​（图2B）。2B） ●●●●。通过使用抗γ-adaptin抗体，在PC-12和HeLa细胞中证实双层涂层中没有AP1（图​（图2A；2A；我们未发布的数据）。第三种衔接复合体AP3已被证明存在于A431和PC12细胞的内体小管上(德尔安吉丽卡等。, 1998). 在HeLa细胞中，AP3确实在内胚体空泡附近的管状-球状剖面上发现，但双层膜上没有标记。此外，在缺乏功能性AP3的摩卡小鼠的成纤维细胞中，仍然经常观察到内体液泡上的双层涂层（我们未发表的数据）。AP1和AP3在膜上的组装依赖于小GTPase ADP-核糖基化因子1（ARF1），并被布雷费尔丁A阻止，该蛋白阻断ADP-核糖基化因素1的膜结合(Robinson和Kreis，1992年;Ooi公司等。, 1998). 当wtGHR细胞与brefeldin A孵育10分钟时，高尔基体已经分解（我们未发表的数据​（图2C）。2C） ●●●●。这一观察表明双层外套的组装独立于ADP-核糖基化因子1结合。

PtdIns3-激酶抑制剂Wortmann存在时，内膜双层膜消失

PtdIns 3-激酶代谢物参与调节膜交通的几个步骤(斯皮罗等。, 1996;基督教等。1999年)包括内体内囊泡的形成(费尔南德斯·博尔贾等。1999年). 此外，PtdIns3P（P）已定位于EE和LE的内囊泡(吉洛利等。, 2000). 将wtGHR细胞与PtdIns 3-激酶抑制剂沃特曼（wortmannin）孵育45分钟，导致内胚空泡扩大，仅有少量内囊泡（图​（图3A）。三A） ●●●●。重要的是，沃特曼蛋白孵育导致与内体空泡结合的氯氰菊酯显著减少，而且根据形态学标准，仅很少观察到双层涂层。相反，TGN、质膜和RE处的氯菊酯涂层似乎未受影响（图​（图3A）。三A） ●●●●。虽然在沃特曼诱导的液泡的界膜中存在TfR（图​（图3B）三B） 表明它们来源于EEs，不能排除晚期内吞室的输入。因此，为了量化沃特曼对双层涂层的影响，我们同时考虑了EE和LE。在对照细胞中，双层膜覆盖了9%的EEs和LEs液泡的限制膜。沃特曼处理后，只有3%的液泡膜被覆盖。考虑到沃特曼处理后内胚体液泡的大小增加了17%，这些数据表明包膜面积减少。我们的结论是，内胚体双层外套的形成和/或维持取决于PtdIns 3-激酶的活性。

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Wortmannin导致内胚体双层外套的消失。WtGHR细胞与100 nM沃特曼蛋白孵育45分钟。（A） Wortmanin诱导膨胀的内胚体空泡（V），这些空泡很少有可见的双层外壳，并且没有标记为网格蛋白（10-nm金）。相反，网格蛋白与细胞质小泡和小管的结合未受干扰（箭头）。（B） 早期内体标记物TfR（10nm金）定位于肿胀的内体液泡的限制膜。棒材，200 nm。

双层涂层与肌动蛋白或管蛋白细胞骨架无关

内吞细胞器的运动和细胞内定位取决于与微管的结合(Matteoni和Kreis，1987年;哈贝曼等。, 2001)和肌动蛋白丝(van Deurs公司等。, 1995). 因此，我们试图确定内体空泡上的双层外套是否可能作为细胞骨架的锚定位点。γ-微管蛋白的标记显示了金的长线性图案，反映了微管的纵向切片（图​（图4，4、A和B）。虽然我们经常观察到LEs和溶酶体与微管的联系（图​（图4A；4A；我们未发表的数据），我们在EE液泡的包衣区附近没有发现线性轨迹或单个微管蛋白簇（图​（图4B）。4B） ●●●●。此外，微管解聚剂诺卡唑对双层涂层的存在没有影响（我们未公布的数据）。

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双层涂层与微管或肌动蛋白（A）HeLa细胞无关。溶酶体（L）与微管蛋白（10-nm金）的线性轨道相关。（B） 相反，微管蛋白与EEs上的涂层区域（箭头）无关。（C） 肌动蛋白（10-nm金）很容易在质膜（PM）附近和微绒毛突起中发现。（D） 当肌动蛋白位于脑电图的界膜附近时，它与包膜区无关（如箭头所示）。棒材，200 nm。

肌动蛋白丝是向溶酶体运输所必需的(van Deurs公司等。, 1995). 此外，在爪蟾鸡蛋提取物，肌动蛋白在体外内胚空泡上成核(汤顿等。, 2000). 用抗肌动蛋白抗体标记显示肌动蛋白存在于胞浆中，尤其是在质膜下区域和细胞突起中（图​（图4C）。4C） ●●●●。此外，有时在内胚体液泡的界膜附近观察到标记，但与界膜的涂层区域无关（图​（图4D）。4D） ●●●●。用latrunculin A孵育细胞，导致肌动蛋白丝的分解，对双层外套的发生没有影响（我们未发表的数据）。总之，这些数据没有任何迹象表明，包膜提供了EEs与细胞骨架相互作用的位点。

EGFR和GHR而非TfR集中于早期内分泌物的双层涂层中

为了研究双层包衣区域可能参与EEs内的蛋白质分类，我们接下来建立了循环受体TfR和两个在配体结合后降解的受体EGFR和GHR的稳态分布。如许多其他类型的细胞所示，wtGHR细胞中的大多数胞内TfR在RE中发现，只有少量位于EE液泡的界膜（图​（图5A）。5A） ●●●●。在与EE空泡相关的相对较少的标记物中，11.1%定位于内囊泡，这很可能代表了靶向溶酶体的少量TfR(Omary和Trowbridge，1981年). 在本研究中使用的其他细胞系中也发现了类似的分布模式。在EE液泡的限制膜处，我们发现双层涂层区域的TfR标记<10%（表​（表2）。2). 当Tf–TfR复合物被标记为抗-Tf时，获得了几乎相似的值（表​（表2），2)表明TfR抗原性没有被外壳的存在所掩盖。同样在HeLa细胞中，EEs界膜上的TfR仅占涂层区域的很小比例（表​（表3）。三).

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EGFR、Hrs和GHR集中在双层涂层中。（A和B）WtGHR细胞与生物素化GH孵育30分钟。（A）TfR（10-nm金）标记主要出现在RE中，其中一些位于早期内体（小箭头）附近。在EEs的限制膜处，TfR定位于涂层（箭头）和非涂层区域（箭头）。（B） GHR（10-nm金）存在于EE的限制膜和内部囊泡上。在限制膜上，GHR存在于涂层区域（箭头）。（C和D）HeLa细胞与EGF孵育10分钟。（C） EGFR（10-nm金）明显存在于EE的涂层区域（箭头所示）。（D）此外，Hrs（10-nm黄金）也局限于EE的涂敷区域（箭头）。PM，质膜。棒材，200 nm。

为了比较包膜和非包膜膜亚结构域中的蛋白质浓度，我们用该结构域的相对表面积来划分内体亚结构域上存在的TfR标记百分比（表​（表22和​和3）。三). 在wtGHR和HeLa细胞中获得的数据非常相似，并表明EE液泡中的少量TfR均匀分布在限制膜的涂层和非涂层区域（表​（表22和​和3三).

然后，我们将重点放在EGFR和GHR与同源配体结合后用于溶酶体降解。HeLa细胞与EGF孵育10分钟，固定，并用抗EGFR进行免疫标记。在这些条件下，大多数EGFR定位于EEs，即位于界膜和内囊泡（图​（图5C；5C类；我们未发布的数据）。与TfR有显著差异的是，EGFR在双层涂层膜中表现出较高的存在率（表​（表3，三，顶行）。将涂层子域的EGFR标记表面比率除以未涂层子域，结果表明双层涂层膜的浓度比未涂层区域高四倍（表​（表3；三; 3.3:0.8 = 4.1). 接下来，我们研究了wtGHR细胞摄取GH 30分钟后内吞GHR–GH复合物的定位。与EGFR一样，GHR也存在于内囊泡和EE液泡的限制膜上（图​（图5B）。5B） ●●●●。在极限膜处，涂层区域经常发现GHR（表​（表2）。2). GH-GHR复合物在溶酶体中降解前保持相关(Roupas和Herington，1986年)，暗示GH的免疫检测应导致在EEs上的类似分布。事实上，GH标签集中在包衣的内胚层膜中（表​（表2）。2). 最后，对各自标记表面比率的测定表明，GHR-GH复合物在双层涂层区域的浓度是内胚体限制膜非涂层区域的2.4–2.8倍（表​（表22).

总之，这些数据表明，再循环的TfR均匀分布在EE的涂层和非涂层膜域上，而EGFR和GHR这两种溶酶体降解受体则集中在涂层膜域中。

截短GHR的诱导再循环与双层涂层区域的减少相一致

蛋白酶体系统对GHR的初始内化以及对溶酶体的分选都是必需的(范·克霍夫等。, 2000，2001). 在蛋白酶体抑制剂的存在下，wtGHR的内化被抑制。相反，截断的受体GHR-369在这些条件下仍被内化(范·克霍夫等。, 2000)，但GH降解受损(van Kerkhof和Strous，2001年)这意味着溶酶体靶向性降低。这促使我们研究在有或无蛋白酶体抑制剂的情况下GHR-369的细胞内分布。细胞与生物素化GH孵育60分钟，固定，并处理以标记抗生物素抗体。在这些条件下，GHR-369–GH复合物积聚在内体的内囊泡上（图​（图6，6，A和B），与运输到溶酶体一致。在使用蛋白酶体抑制剂MG 132进行治疗时，与未经处理的细胞相比，第一个显著的区别是在电子致密的管状硅片中GH的发生率增加，使人联想到RE（表​（表44和图​图6，6、C和D）。尽管在对照细胞中，REs中发现了5.1%的GH总标记物，但在GH摄取期间与MG 132孵育的细胞中，该百分比高出约3倍。同时，内胚体相关小管中GH标签的数量也增加了，根据我们的定义，GH标签位于内胚体空泡和RE可能的前体200 nm范围内（表​（表4）。4). 在MG 132处理后，与增加的循环一致，LEs中GH标签的百分比从16.3%下降到4.5%。与GH和Tf共培养，以及随后的双重免疫金标记清楚地显示了GH和Tf在电子密度RE中的共定位（图​（图6D）。6D） ●●●●。在对照细胞中，6.7%的Tf-阳性REs也标记GH，而在MG 132处理的细胞中，这一百分比达到16.8%。根据这些数据，我们得出结论，在蛋白酶体抑制剂MG 132存在的情况下，GHR-369的一部分直接作用于RE，而不是被转运到溶酶体。

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MG 132诱导内吞GHR-369的再循环。（A和B）GHR-369细胞与生物素化GH孵育1小时。（A）GH（10-nm金）存在于质膜（PM）和EEs中。（B） 在LE的内部囊泡上进行GH（10nm金）染色的例子。（C） GHR-369–表达细胞在MG 132存在下培养1小时，随后用MG 132+生物素化GH培养1小时。在EE的限制膜和内囊泡上都发现了GH（10-nm金）。注意，标签存在于从液泡（箭头）进化而来的小管中。（D） 细胞按C处理，但使用GH代替生物素化配体，在过去30分钟内还添加了生物素化Tf。GH（10nm金）和生物素（15nm金）的双重标记显示在电子密度RE上共定位（箭头）。N、 核心。棒，200纳米。

然后我们重点研究了GHR-369在EE液泡中的分布。在未经处理的细胞中，我们发现42.3%的GH位于EE空泡腔中，与内囊泡相关。在极限膜处，双层涂层区域中存在15.0%的GH，非涂层区域中有32.5%的GH（表​（表5），5)，类似于wtGHR的分布。在MG 132处理的细胞中，内囊上GH标记的数量减少到30.9%，与之前观察到的降解抑制相一致(van Kerkhof和Strous，2001年). 值得注意的是，空泡限制膜处GH的伴随增加仅限于非涂层区域，从而使限制膜处的GH标记比率向非涂层区域转移。

Hrs和Syntaxin 7集中于EEs的双层涂层区域

累积的证据表明，从EE到LE的运输需要Hr。在哺乳动物细胞中，Hrs定位于TfR阳性的EEs，并在几种生长因子受体（包括EGFR）激活后磷酸化(科马达等。, 1997;乌尔贝等。, 2000). 膜结合依赖于其FYVE-finger结构域，该结构域结合PtdIns3P（P）因此，Hrs的膜结合被沃特曼干扰(乌尔贝等。, 2000). 因此，我们研究了Hrs与内体双层涂层的可能联系。如图所示​图5D，5D、 在EEs的双层涂层区域存在Hrs。在HeLa细胞中，双层膜中发现位于EE液泡界膜上的Hrs为50.2±1.1%（平均±SD）。标记表面比率的测定表明，Hrs在双层涂层中的浓度是内胚体限制膜非涂层区域的20倍。

SNARE蛋白syntaxin 7被认为参与了LE途径的膜转运(马洛克等。, 2000;中村等。, 2000). 在之前的一项研究中，我们证明了在EE液泡的双层网格蛋白包衣结构域中存在syntaxin 7(普雷克里斯等。, 1998). 在wtGHR细胞中，syntaxin 7主要局限于内胚空泡（图​（图7A），7A） ，在相关的囊泡和小管中只有偶尔的标记；在双层包膜区，EE液泡的界膜上发现了49.7±4.5%（平均±SD）的syntaxin 7。标记表面比率的计算表明，双层涂层中的syntaxin 7浓度是内胚体限制膜非涂层区域的10倍。因此，除了靶向溶酶体降解的受体蛋白外，已知参与内体运输后期步骤的蛋白也存在于EEs的涂层区域中。

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Syntaxin 7集中在双层被膜（A）WtGHR细胞中。Syntaxin 7（10-nm金）主要局限于EEs的限制膜，在那里它积聚在双层涂层区域（箭头所示）。（B） 在HeLa细胞中，syntaxin 7（10-nm金）显示出类似的染色。棒材，200 nm。

讨论

在大鼠肾上腺髓质细胞的早期形态学研究中，首次记录到内胚空泡上的涂层(霍尔兹曼和多米尼克，1968年). 然而，随着时间的推移，这一观察结果却出人意料地没有引起多少兴趣，而且这些外壳在蛋白质贩运中的作用仍然难以捉摸。在此，我们表明，包衣内体在几种细胞类型中是一种常见现象。被毛具有典型的双层外观，主要出现在早期，仅偶尔出现在晚期内体上。我们研究中最引人注目的观察结果是，在内胚体限制膜内，GHR和EGFR在溶酶体中降解，集中在双层包衣区。这些代表了第一个在这种特殊类型的氯氰菊酯涂层膜中聚集的货物蛋白质的例子。相反，循环TfR在液泡膜上均匀分布。使用针对受体和配体以及几种细胞类型的抗体获得了等效结果。总之，这些数据强烈表明，内体液泡的网格蛋白外壳在蛋白质向溶酶体的分选中起着作用。此外，我们没有发现双层涂层在形成氯氰菊酯涂层的RE中的作用的证据，也没有发现涂层的内体膜与细胞骨架的关联。

对我们的研究结果的一个可能解释是，在将受体-配体复合物并入内腔小泡之前，它们集中在EEs的双层涂层区域。TfR不被排除在被膜区之外的概念表明蛋白质可以自由进入这些区域。然后，浓度将取决于货物蛋白质的主动保留，而不是主动补充。除此之外，这种滞留浓度可能有助于阻止蛋白质进入进化中的循环小管，循环小管在EE阶段占膜流量的95%(Draye等人，1988年). 图中给出了说明此假设的模型​图8。8。

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聚合的证据线表明了一种模型，在该模型中，外套成分和下调受体之间的相互作用导致双层外套的滞留。这种保留浓缩溶酶体途径的蛋白质，并将其与再循环蛋白质分离。未保留在双层外壳中的再循环蛋白质通过内胚体液泡，然后大量流入再循环内胚体（虚线-粗体线）。相反，进入溶酶体的蛋白质在外衣（连续粗体线）中的滞留将先于内吞小泡和随后运输到溶酶体。

最近，在黑色素瘤细胞系MNT-1的内胚空泡上发现了形态相同的双层外套(拉波索等。, 2001). 研究表明，这些被包裹的内体中间产物可能是黑素小体的前体细胞器。我们的数据与该模型一致，但另外还表明外壳在内吞蛋白质转运中具有更广泛的功能。从形态学上看，内胚体外套与先前确定的存在于TGN、质膜和RE上的网格蛋白外套的特征性双层外观不同。内体外壳与其他网格蛋白外壳的不同之处还在于它们的蛋白质组成。我们没有发现双层涂层中存在已知的衔接蛋白复合物AP1、AP2或AP3的迹象，这与莱博格等。(2001)尽管这些数据并不排除双层涂层可能含有低浓度或改变形式的这些衔接蛋白，但这些观察结果清楚地将这种涂层与细胞中其他网格蛋白包被的膜区分开来。AP2标记的缺失令人信服地区分了初级内吞囊泡上的双层外壳和网格蛋白外壳，而AP1和AP3的缺失说明了与RE和TGN上网格蛋白外壳的差异(Dell'Angelica公司等., 1998;福特等。, 1998;马拉德等。, 1998). 此外，该外壳对短时间与brefeldin a孵育不敏感，这足以分解高尔基复合体，表明外壳的组装独立于ARF1，尽管我们不能排除ARF1在内胚体空泡处的结合可能由布雷费尔丁a不敏感的鸟嘌呤核苷酸交换因子介导。因此，我们的研究与其他研究相结合，现在表明内体上的网格蛋白可能以两种方式发挥作用：1）作为内体液泡上的平面晶格，可能介导溶酶体导向蛋白的保留（图​（图8）；8); 和2）在循环小管上以芽的形式介导循环蛋白的运输(斯托沃格尔等。, 1996;福特等。, 1998;马拉德等。, 1998;van Dam和Stoorvogel，2002年).

与wtGHR不同，GHR-369独立于泛素蛋白酶体系统从质膜内吞。我们发现，在控制条件下，GHR-369细胞对GH的摄取与wtGHR细胞相似，并导致野生型和截短型GHR在EEs的涂层和非涂层亚结构域上的等效分布。然而，在MG 132处理对泛素蛋白酶体系统产生干扰后，GHR-369的分布部分从降解途径转移到再循环途径，这是从与Tf共定位的RE中增加的定位得出的结论。这些发现与数据一致，数据表明在MG 134存在的情况下，GHR-369细胞中GH分解受损(van Kerkhof和Strous，2001年). 在MG 132治疗中，EE液泡内，内囊泡上GHR-369标记的百分比下降，这与溶酶体分解的下降一致。重要的是，仅在非涂层结构域中发现限制膜标记的伴随相对增加（表​（表5）。5). 因此，MG 132导致GHR-369在内胚体限制膜上的相对分布从涂层区域转移到非涂层区域。根据我们的模型（图​（图8），8)GHR-369在涂层区域的滞留减少，导致流向非涂层膜和随后的RE的流量增加，可以解释这种变化。事实上，MG 132处理导致EE液泡涂层区域的标签百分比略有下降，但这在统计上并不显著（表​（表5）。5). 因此，另一种或额外的解释可能是，在控制条件下，涂层中受体的结合位点饱和。如果MG 132影响GHR-369在外套中滞留物下游一步并入内部内胚体小泡，这将导致较高水平的再循环受体，从而无法与已经饱和的外套结合。显然，这些推测性的解释必须在未来的实验中加以解决。此外，应记住，MG 132块的分选并不完整，一些GHR–GH复合物仍然到达LE这一事实也表明了这一点。

MG 132导致GHR-369重新分布到RE的发现表明，分选进入内吞小泡依赖于泛素蛋白酶体系统。这与我们之前的研究结果一致，即GHR溶酶体降解依赖于活性泛素系统和GHR细胞质尾部中所谓的UbE基序的存在，这也是受体泛素化和初始内化所必需的(范·克霍夫等., 2001). 此外，EGFR进入LE通路依赖于泛素系统，特别是通过泛素连接酶c-Cbl的作用，其介导泛素化和随后激活的EGFR的下调(列夫科维茨等。, 1998，1999). 哺乳动物细胞中泛素介导溶酶体分选的分子细节才刚刚开始出现。然而，在酵母中，最近的数据表明，泛素通过运输所需的所谓内胚体分选复合体作为分选进入晚期内胚体途径的信号，该复合体由Vps类E蛋白的一个子集组成：Vps23、，Vps28和Vps37(卡兹曼等。, 2001). 泛素化的货物通过运输所需的内胚体分选复合体识别，从而启动货物进入内囊泡。在进入囊泡之前，泛素被去泛素化酶Doa4从货物中去除，去泛素化酶Doa4被E类Vps蛋白募集(卡兹曼等。2001年). E类蛋白家族的蛋白质是酵母泛泡多泡体的蛋白质分选所必需的(奥多里齐等。, 1998)并在高等哺乳动物中鉴定了几个同源基因，表明溶酶体分选的分子机制是保守的。在这方面，由于Hrs与E类蛋白Vps27具有高度相似性，因此Hrs在内胚体双层涂层中的高度富集非常重要(派珀等。, 1995). 最近，研究表明，在Hrs过度表达的细胞中，Hrs的氯菊酯结合基序对于氯菊酯向EEs的募集是必要的(莱博格等。, 2001). Hrs与内膜的联系取决于FYVE-finger结构域与PtdIns3的相互作用P（P）(乌尔贝等。, 2000). 与免疫荧光数据一致莱博格等。(2001)，我们发现，与PtdIns 3-激酶抑制剂沃特曼（wortmannin）孵育后，网格蛋白从内胚空泡中分离。我们发现双层涂层覆盖的膜的百分比严重降低。重要的是，我们的数据表明，氯氰菊酯仍然与其他细胞膜相关，强调了内体氯氰菊酯外壳的特殊特性。除了氯氰菊酯外，Hrs还与Hrs结合蛋白相关，后者包含一个Src同源3结构域(高田等。, 2000)与氘化酶UBPY结合(加藤等。, 2000). Src同源3结构域的缺失抑制血小板衍生生长因子的降解(高田等。, 2000). 因此，可以设想，如果哺乳动物细胞中也存在内胚体分选复合体，那么它可能位于内胚体液泡的双层涂层区域。

在之前的一项研究中，我们发现SNARE蛋白syntaxin 7显著标记了内体包衣区(普雷克里斯等。1999年). 在此，我们表明，与未涂层的内胚层膜相比，syntaxin 7在涂层区域的浓度是10倍。syntaxin 7在体内运输中的作用尚不清楚。它在两个早期都进行了本地化(Wong（王）等。, 1998;普雷克里斯等。1999年)和晚期内体结构(Mullock公司等。, 2000;中村等。, 2000;病房等。2000年)与晚期内胚体SNAREs Vamp8、syntaxin 8和vti1b在一个复合物中发现(Prekeris公司等。1999年;安东宁等。, 2000;马洛克等。, 2000). 内胚层中高浓度SNARE蛋白的存在表明在膜融合事件中起作用，但具体步骤尚不清楚。因为syntaxin 7参与LE的运输或可能在内体-溶酶体融合中发挥作用(马洛克等。, 2000)可以设想，EEs中的syntaxin 7集中在涂层区域，在下游融合事件中发挥作用。事实上，人们普遍认为，为了暴露SNARE和其他融合机制蛋白与其结合伙伴的相互作用，有必要拆卸网格蛋白外壳。因此，氯氰菊酯外壳的一个功能可能是在EE水平上阻止syntaxin 7与其同源SNARE的相互作用。

Syntaxin 7与clathrin和Hrs一起出现在皮毛中的高标记密度中。然而，在内囊泡上只检测到货物蛋白EGFR和GHR，而没有检测到这些运输机械蛋白。可以推断，外壳蛋白在进入EEs内部时会立即降解。然而，这是不太可能的，因为EE的环境只有轻微的酸性。因此，外壳蛋白的持续缺失可能表明双层外壳在向内萌芽之前被移除，或者，内部囊泡起源于膜的非涂层区域（图​（图8）。8). 在这种情况下，值得注意的是，Hrs被磷酸化以响应EGF，并且这种磷酸化事件依赖于EGFR从质膜到内体的内化以及Hrs从胞浆到EE膜的移位(乌尔贝等。, 2000). 一旦磷酸化，Hrs似乎会从内胚体膜上分离出来，因为磷酸化的Hrs几乎只存在于细胞溶质中(乌尔贝等。, 2000). 因此，很容易推测，EE氯氰菊酯外壳的分解可能至少部分由Hrs磷酸化触发，导致Hrs从EE膜分离。然后，围绕EGFRs的浓缩物可以通过一种尚未确定的机制并入内囊泡。

总之，我们的数据提供了证据，证明EE液泡上的网格蛋白外壳在结构和形态上与所有其他已知网格蛋白外壳不同，并表明该外壳在蛋白质的分类和保留中发挥作用，这些蛋白质将并入内胚泡，这是前所未有的网格蛋白功能模式。

致谢

我们感谢雷内·斯克里瓦内克和马克·范·佩斯基出色的摄影工作；T.Kirchhausen、R.Scheller和E.Ungewickell代表抗体的馈赠；Ann de Maziere、Jürgen Gent、Georg Ramm、Julia Schantl和Peter van Kerkhof进行了有益的讨论；和Hans Geuze对手稿进行批判性阅读。这项工作得到了荷兰科学研究组织（NWO-902-23-192）、欧盟网络（ERBFMRXCT96-0026）以及国家卫生研究院（HL-59150和NS-37525）的资助。Sylvie Urbé由西北癌症研究基金资助。

使用的缩写：

电气工程师早期内体
表皮生长因子受体表皮生长因子受体
GHR公司生长激素受体
高分辨率分光计肝细胞生长因子调节酪氨酸激酶底物
LE公司晚期内体
PtdIns 3-激酶磷脂酰肌醇3-激酶
交通部转铁蛋白受体

脚注

文章在印刷前在线发布。Mol.Biol。细胞10.1091/mbc.01–10–0525。文章和出版日期为www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc.01–10–0525。

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文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会