呼吸道合胞病毒（RSV）是世界范围内严重小儿病毒性细支气管炎和肺炎的主要病原体，每年在美国约有10万名婴儿和儿童住院，4500人死亡(7,14,25). 此外，RSV感染可导致老年人严重呼吸道疾病(23)以及免疫缺陷患者(28). 迄今为止，尽管迫切需要这种制剂，但尚未获得有效的RSV许可疫苗。
自1967年以来，我们的实验室一直致力于开发用于鼻腔给药的RSV减毒活疫苗。通过模拟自然感染，这种疫苗应刺激细胞免疫和体液免疫，并可避免某些非复制或亚单位疫苗所观察到的增强型疾病(7,16,24,27). 鼻内途径也部分消除了婴儿血清中存在的母体抗体的免疫抑制作用，并刺激局部和全身免疫(10).
已经通过生物或重组方法开发了许多RSV活减疫苗候选品，并在动物和人类中进行了评估(8,15,16,29,30,32). 最有希望的生物衍生候选人(内容提供商)对温度敏感的(ts秒)称为病毒中央处理器248/404，在1至2个月大的RSV幼稚婴儿中进行评估，发现具有传染性、免疫原性和对第二剂疫苗的保护性(33). 然而，一些接种者出现了轻度上呼吸道充血，这表明有必要进一步缓解。此外，在感染过程后期从单个接种者身上分离的病毒显示出部分表型逆转和减弱突变的丧失。因此，我们开发改良的减毒活疫苗候选品的策略是：（i）使用重组方法结合在一组生物衍生减毒病毒中识别的减毒突变，包括中央处理器248/404和（ii）通过专注于不易发生遗传逆转的基因缺失，开发新型衰减突变。
RSV是肺炎病毒科的属副粘病毒科它的基因组是一个15.2 kb的单链负义RNA，编码10个亚基因组mRNA，其中有11个蛋白质被翻译。这些蛋白质包括核衣壳N蛋白、磷酸蛋白P和大聚合酶亚基L，它们共同构成最小的病毒聚合酶；RSV聚合酶的全过程转录需要转录抗终止因子M2-1的存在(6,18,19,34). 有四种包膜相关蛋白：内基质蛋白（M）和三种跨膜表面蛋白，即附着蛋白（G）、融合蛋白（F）和小疏水蛋白（SH）(7). 最后，呼吸道合胞病毒编码两种非结构蛋白，NS1和NS2，以及M2-2蛋白，其结构或非结构状态尚不清楚。NS1和M2-2似乎在RNA合成中起作用。
我们之前描述了一种通过共转染质粒中的抗原RNA和N、P、L和M2-1蛋白共表达产生重组亚群a RSV（rRSV）的反向遗传学系统(5). 该系统的一个应用是识别病毒基因，这些基因可以被删除或沉默，而不会破坏体外复制，但对病毒体内复制仍然是必要的(4,26). SH基因的缺失导致了一种病毒，命名为rA2ΔSH，其体外复制效率等于或略高于野生型rRSV（rA2），并在小鼠和黑猩猩中中度减弱(4,29). NS2基因被删除的rRSV，命名为rA2ΔNS2，在体外表现出生长动力学降低和感染病毒产量降低，在小鼠和黑猩猩中显著减弱(26,29). 在NS2基因被删除的重组牛RSV中发现了类似的体外特性(2). 这两种缺失突变目前正被纳入重组减活疫苗候选品中进行临床评估。
最近，在rRSV（rA2ΔM2-2，以前称为rA2-K5）中，通过突变三个潜在的翻译起始密码子中的每一个，并在三个阅读框中插入翻译终止密码子，M2-2开放阅读框被沉默(1). 第二个研究小组制作了一种类似的病毒，其中M2-2通过删除其大部分开放阅读框而沉默，从而产生了一种与rA2ΔM2-2表型相似的病毒(20). rA2ΔM2-2病毒表现出斑块增大、生长动力学降低（尽管最终滴度与野生型相似），以及RNA合成从RNA复制到转录的部分转变(1). 因此，M2-2蛋白似乎是一种负调节转录和正调节RNA复制的调节蛋白。此外，构建了一种rRSV，通过去除抗原cDNA中的122到630个核苷酸，从中删除NS1基因，从而将NS1上游非翻译区连接到NS2的翻译起始密码子。该病毒命名为rA2ΔNS1，表现出RNA复制、斑块大小和生长动力学减少，体外感染病毒的产量约低10倍（M.N.Teng和P.L.Collins，提交出版）。其他副粘病毒编码的蛋白质，如仙台病毒的V蛋白，对体外复制来说不是必需的。然而，重组仙台病毒消融V的表达会导致体内病毒的衰减(22). 有人认为，这种蛋白质具有对抗小鼠先天免疫系统某些方面的功能。最近，猴病毒5的V蛋白被证明可以阻断I型和II型干扰素应答的信号传导(13). 任何RSV“辅助”蛋白，包括NS1、NS2、M2-2、SH和G蛋白，都是拮抗宿主免疫机制的候选蛋白。
在本研究中，我们评估了rA2ΔM2-2和rA2△NS1病毒在黑猩猩上下呼吸道的复制、免疫原性和保护效力，黑猩猩是唯一一种RSV复制和毒力接近人类的实验动物。上述rA2△M2-2和rA2△NS1病毒是在Collins等人描述的抗原cDNA的原始版本中构建的(5). 我们实验室为疫苗目的构建的所有重组病毒都包含对该背景的两种修改：（i）在L基因中引入一组六个翻译沉默的限制性标记，称为位点突变，（ii）F蛋白中的两个氨基酸替换，称为HEK突变，这使得重组病毒在氨基酸水平上与野生型RSV A2亲本完全相同中央处理器衍生出248/404系列候选生物疫苗(21,30). 这些突变在黑猩猩中表现为沉默(32). 本研究中使用的rA2ΔNS1病毒是在HEK位点背景下重建的，为临床评估做准备，而rA2ΔM2-2病毒是在原始遗传背景下重建的，这一差异与本研究无关(1,30).
如前所述，通过鼻内和气管内联合接种，将rA2ΔNS1和rA2ΔM2-2病毒分别施用于RSV血清阴性的幼年黑猩猩(11). 由于这两种病毒都在体外被减弱，我们选择给动物接种10种5每毫升每个部位的PFU，比通常用于接种黑猩猩的浓度高10倍。为了分别监测上呼吸道和下呼吸道的病毒复制，在感染后10天内每隔一段时间采集鼻咽拭子和气管灌洗液样本，然后检测病毒滴度。测定各组的平均峰值病毒滴度（表). 每天对黑猩猩进行鼻漏监测，这是一种上呼吸道疾病的症状，并确定各组的平均峰值得分（表). 由于RSV血清阴性黑猩猩的可用性有限，每组的动物数量很少，因此有必要纳入之前研究中的对照组，在这些研究中，我们评估了生物衍生RSV株A2（野生型RSV A2）、rA2、rA2ΔSH、rA2△NS2以及上述重组版本中央处理器248/404候选疫苗（rA2cp248/40四）（表).
表1
在黑猩猩的上呼吸道和下呼吸道中，rA2△NS1和rA2△M2-2都高度衰减，但具有高度免疫原性
| 用于感染黑猩猩的病毒一 | 动物数量 | 剂量b条（每个站点，日志10PFU） | 平均峰值病毒滴度c（c）（日志10PFU/ml）±SE（邓肯分组）
| 平均鼻漏峰值评分d日（范围，0–4） | 血清中和抗体平均滴度e（电子）（倒数对数2)
|
|---|
| 鼻咽拭子 | 气管灌洗 | 第0天 | 第28天 |
|---|
| 野生型RSV A2（f） | 2 | 4 | 5.0±0.35（安培） | 5.5±0.40（安培） | 3 | <3.3 | 11.2 |
| rA2型克 | 2 | 4 | 4.9±0.15（A） | 5.4±0.05（A） | 2.5 | <3.3 | 10.5 |
| rA2ΔSH克 | 三 | 4 | 4.6±0.10（A） | 3.8±0.31（B） | 1 | <3.3 | 10.2 |
| rA2ΔNS2克 | 4 | 4 | 3.8±0.41（B） | 1.4±0.29（C） | 1 | 3.4 | 10.6 |
| rA2cp248/404克 | 4 | 5 | 2.5±0.25（C） | 1.4±0.37（C） | 0.8 | 3.4 | 10.6 |
| rA2ΔNS1 | 4 | 5 | 1.6±0.12（D） | 1.2±0.43（C） | 2 | <3.3 | 9.8 |
| rA2ΔM2-2 | 4 | 5 | 1.5±0.09（D） | <0.7 | 1.8 | <3.3 | 9.1 |
与rA2相比，rA2ΔNS1和rA2△M2-2在上呼吸道的复制水平分别降低了2200倍和2800倍以上（表). 感染后2至7天开始，偶尔检测到rA2ΔNS1或rA2△M2-2的脱落，且水平较低，每只动物在3至8天内都会流出病毒（数据未显示）。因此，回收的病毒并不是从最初的接种物中携带过来的，而是在几天内接近检测水平的复制。在下呼吸道，rA2ΔNS1的复制水平比rA2的复制水平降低了17000倍以上，而rA2△M2-2在所有时间点都无法检测到（降低了55000倍以上）。值得注意的是，所使用的rA2ΔNS1和rA2△M2-2的剂量是rA2的10倍。此外，这两种病毒都比相同剂量的rA2cp248/404弱得多，尤其是rA2ΔM2-2病毒，这种病毒没有从受感染黑猩猩的肺中恢复过来。此外，rA2△NS1和rA2△M2-2在上呼吸道和下呼吸道同样受限，这两种情况都不常见。在上呼吸道，每种病毒的限制性约为中央处理器248/404和175倍于rA2ΔNS2。由于在临床评估期间观察到上呼吸道充血中央处理器1至2个月大婴儿感染248/404病毒(33)由于该年龄段的婴儿是专一的鼻呼吸者，因此，突变对上呼吸道复制的限制程度大于中央处理器248/404有望被纳入减毒活疫苗病毒。接受rA2ΔNS1或rA2△M2-2的动物比感染rA2cp248/404的动物的鼻漏略多，但仍低于感染10倍剂量rA2的动物。虽然NS1或M2-2的缺失可能导致病毒保持中等毒性，但复制不良，我们认为这种可能性不大可能。我们的经验是，在不同时间进行的不同研究中，鼻漏的定量和这些数值的比较可能有点主观，因此不完全可重复。我们预计，包括临床研究在内的进一步评估将表明，与rA2ΔNS1和rA2△M2-2相关的残余毒力量将反映出它们的复制大大减少。
尽管这些病毒的复制受到高度限制，但用rA2ΔNS1或rA2△M2-2免疫后，血清中RSV中和抗体的水平是rA2cp248/404诱导的三倍以内（表). 此外，先前感染rA2ΔNS1或rA2Δ）M2-2的动物对免疫后56天经鼻和气管注射的野生型RSV的复制具有高度抵抗力（表). 两例患者的上呼吸道保护水平相似，下呼吸道保护水平略低于中央处理器248/404，平均峰值滴度和平均脱落天数。
表2
感染rA2ΔNS1或rA2△M2-2的黑猩猩对随后野生型RSV A2在上呼吸道和下呼吸道的攻击具有显著的保护作用
| 免疫病毒 | 接种剂量一（日志10PFU/ml） | 动物数量 | RSV挑战病毒在指定站点的复制b条
| 平均鼻漏峰值评分 |
|---|
鼻咽
| 气管
|
|---|
| 平均脱落天数±SE | 平均峰值滴度c（c）±SE | 平均脱落天数±SE | 平均峰值滴度±SE |
|---|
| rA2ΔNS1 | 5 | 4 | 2.8 ± 0.75 | 1.7 ± 0.46 | 1.0 ± 0.41 | 1.8 ± 0.73 | 1 |
| rA2ΔM2-2 | 5 | 4 | 3.5 ± 0.87 | 2.3 ± 0.71 | 1.0 ± 0.71 | 1.7 ± 0.63 | 1 |
| rA2ΔNS2d日 | 4 | 4 | ND（无损检测） | 1.9 ± 0.30 | ND（无损检测） | 2.2±0.77 | 1 |
| 中央处理器248/404e（电子） | 4.7 | 2 | 3.5 ± 0.50 | 2.3 ± 0.25 | 0 | <0.7 | 1 |
| 无e（电子） | | 2 | 8.5 ± 0.50 | 5.0 ± 0.35 | 6.0 ± 1.0 | 4.8 ± 0.30 | 3 |
开发减毒活RSV疫苗的挑战是在不损害免疫原性的情况下消除残余毒力。迄今为止的观察表明，RSV疾病的严重程度与呼吸道中RSV复制水平密切相关。可能会发现一个或多个通过另一种机制降低毒力的衰减突变；事实上，人们希望删除一个或多个非必需的RSV蛋白，如本文中所述的蛋白，可能会揭示这种毒力因子。然而，RSV的这种性质的一个因素尚未确定。因此，目前减少RSV的方法是降低其复制水平，不幸的是，由于抗原的产生减少，这可能会降低其免疫原性。我们迄今为止发现的减弱突变包括（i）在N、F和L蛋白中发现的一组五个氨基酸替换内容提供商RSV和在黑猩猩和人类中传播衰减(9,16,32); （ii）L蛋白中的一系列氨基酸替换和M2基因的基因启动信号中的核苷酸替换，这些都是在生物衍生的ts秒的导数内容提供商RSV及其各自授予ts秒和衰减表型(12,15,21,30); 和（iii）RSV基因的单个或组合缺失，如SH和NS2基因(4,26). 牛RSV基因也被用于根据宿主范围限制进行衰减(三). 这里，我们在列表中添加了两个额外的敲除突变，即NS1的删除和M2-2开放阅读框的沉默。
表中所示的突变病毒，血清阴性幼年黑猩猩的衰减递增顺序为rA2ΔSH<rA2△NS2<rA2cp248/404<rA2Δ的NS1<rA2¦¤M2-2。所有病毒对野生型RSV的攻击都提供了类似的高水平保护（表). 因此，rA2△NS1和rA2△M2-2都具有比rA2cp248/404（重组版本的中央处理器248/404，如上所述，在呼吸道合胞病毒初始的1至2个月大的婴儿中反应性稍强(33). rA2ΔM2-2的衰减比rA2△NS1的衰减稍大，这一发现增加了其中一种病毒达到最佳衰减水平的可能性。血清阴性的幼年黑猩猩对RSV复制和疾病的耐受性略低于RSV未感染的人类婴儿。因此，只有通过对目标疫苗人群（1至2个月大的婴儿）进行临床试验，才能确定rA2ΔNS1、rA2△M2-2或两者是否具有适当的衰减水平。
缺失突变体在体内和体外都应该是非常稳定的，从而使它们成为疫苗开发的诱人候选品。鉴于一名婴儿接种了中央处理器248/404脱落病毒表现出部分逆转(33). RSV疫苗中的低水平遗传不稳定性对正常人来说可能不是一个问题，特别是考虑到全毒力野生型RSV的高流行率。然而，疫苗病毒可能会延长免疫受损个体的复制时间。因此，最好设计一种重组疫苗病毒，以包含无法逆转的衰减突变。
尽管RSV疫苗的主要目标是1至2个月大的婴儿，但第二个目标是老年人。这个中央处理器248/404候选疫苗在RSV未感染婴儿中的减毒作用不足，但在RSV感染的成人中被发现过度减毒(17). 因此，与成人使用的疫苗相比，用于RSV幼稚婴儿的减毒活疫苗需要更加减毒。由于rA2△NS1和rA2△M2-2病毒与中央处理器248/404在其复制水平上，它们可能会被削弱，无法用作成人疫苗。然而，每种病毒都适合作为儿童RSV疫苗进行进一步评估，无论是当前构建的还是包含单个或组合的其他衰减突变。需要注意的是，如果任一候选疫苗证明令人满意，则可通过替换F和G糖蛋白快速生成伙伴B亚群候选疫苗(31).
