miR公司‐144‐3p通过影响细胞需氧糖酵解抑制肝癌进展福克斯K1

2.2. 细胞培养和转染

正常人肝细胞系L‐O2（BFN608006124）、人肝癌细胞系HepG2（BFN60 800692）、HCCLM3（BFN 608006111）和Hep3B（BFN 60 803969）购自BLUEFBIO。上述细胞系在含有10%胎牛血清（FBS；Thermo Fisher）的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM；Thermo-Fisher37°C，5%CO₂.

miR‐144‐3p模拟物、oe‐FOXK1、sh‐FOXK1及其阴性对照品由Ribobio生产。引入脂质体内酰胺2000试剂盒（Thermo Fisher）将miR‐）144‐的3p模拟体、oe−FOXK1、sh‐的FOXK1s及其阴性对照物转染到HepG2细胞中。

2.3. 定量实时聚合酶链反应(qRT‐PCR)

使用Trizol试剂（Thermo Fisher）提取总RNA。对FOXK1和miR‐144‐3p进行定量。使用PrimeScript RT试剂盒（Takara）和Hifair®miRNA第一链cDNA合成试剂盒（YEASEN）进行cDNA合成。使用qRT-PCR试剂盒（Takara）检测相对表达。miR‐144‐3p和FOXK1的内部参数分别为U6和β‐actin。如表所示1包括引物序列。

2.4. 蛋白质印迹

如前所述，执行与蛋白质提取和蛋白质印迹相关的步骤。 ²¹ 用RIPA（Thermo-Fisher）裂解液处理细胞，用BCA分析试剂盒（Thermo Fisher，BCA）检测蛋白质浓度。接下来，在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离蛋白质样品（30μg），并将蛋白质转移到聚偏氟乙烯膜上。在室温下用5%脱脂牛奶封闭膜2小时，并在4°C下用单克隆抗体培养过夜。第二天，在室温下培养山羊抗兔IgG H&L（HRP；ab6721，1:2000；Abcam）1小时。最后，用化学发光检测试剂盒（Sigma-Aldrich）检测每个治疗组的蛋白质。主要抗体为兔抗人FOXK1抗体（ab18196，1:1000；Abcam）和β-actin（ab124964，1:10000；Abcam）。

2.5. 细胞计数套件-8(CCK公司‐8)

细胞按2×10播种^三细胞/孔放入96孔板中，培养0、24、48、72和96小时。向孔中加入10μL CCK‐8溶液（Sigma），然后再培养4小时。在450 nm处用微孔板阅读器测定吸光度。

2.6. Transwell分析

将细胞接种到跨阱装置（Corning）的上腔（无血清培养基）中，然后将罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）-1640培养基（含10%FBS）引入下腔。37°C下细胞培养1天后，上部插入物中未迁移的细胞被丢弃。将迁移的细胞固定在4%多聚甲醛中，并用结晶紫染色30分钟。在显微镜下观察和计算细胞。为了检测细胞侵袭，在细胞接种前，在上室底部涂抹30μL Matrigel，其余步骤与迁移试验相同。

2.7. 双荧光素酶分析

包含miR‐144‐3p靶点和突变结合位点（FOXK1‐WT/MUT）的FOXK13′-UTR报告载体由General Biosystems合成。如上所述，使用脂质内酰胺2000（Invitrogen）与NC模拟物或miR‐144‐3p模拟物和报告载体共同转染HepG2细胞。48小时后，利用双露西分析试剂盒（Solarbio）测试荧光素酶活性。

2.8. 流式细胞术

凋亡试剂盒（Thermo Fisher）用于评估细胞凋亡。在磷酸盐缓冲溶液（PBS）中悬浮后，将细胞负载5μL膜联蛋白V‐FITC，轻轻混合，并在室温下黑暗孵育15分钟。然后，在测试前用10μL碘化丙啶（PI）对细胞进行染色5分钟，并通过流式细胞术检测细胞凋亡率。

对于细胞周期检测，在转染72小时后，收集细胞，然后调整细胞悬浮液以提供单细胞悬浮液（1×10⁶ 细胞/mL）。然后将细胞用70%乙醇在4°C下固定并储存过夜。固定细胞在染色前用PBS冲洗三次，并去除上清液。添加0.5 mL PI（40%；Sigma），彻底混合，并在远离光的地方培养30分钟。最后，使用流式细胞仪（BD Biosciences）测量细胞周期，并使用CellQuest软件（BD生物科学）计算不同阶段的细胞比例。

2.9. 糖酵解途径活性的测定

利用Seahorse Biosciences XF96分析仪测试耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）。细胞在皮氏培养皿中培养24小时，然后在37°C的无异种（XF）培养基中培养2小时。OCR和ECAR检测符合XF细胞Mito应激测试曲线。

2.10. 丙酮酸、乳酸、柠檬酸和苹果酸的检测

分别使用丙酮酸检测试剂盒（BC2205；Solarbio）、乳酸检测试剂盒。

3.2. 沉默福克斯K1抑制肿瘤的恶性进展肝癌细胞

上述研究确定FOXK1在HCC细胞中显著上调。因此，我们探讨了FOXK1在肝癌细胞功能中的作用。首先，我们用沉默的FOXK1构建了两个肝癌细胞系。通过qRT‐PCR和western blot分析了它们的转染效率，这表明在含有sh‐FOXK1的HCC细胞系中FOXK1mRNA和蛋白质水平显著降低（图2A、B). 接下来，CCK‐8和transwell分析表明，沉默的FOXK1显著降低了HCC细胞的生存能力、迁移和侵袭（图2C–E级). 最近的研究表明，凋亡在癌症治疗中具有重要意义，细胞数量的动态平衡需要在增殖和凋亡之间取得平衡，而这两个变量都依赖于细胞周期。 ²² 流式细胞术显示，沉默FOXK1后G0/G1细胞池显著扩大（HepG2细胞株：从54.9%增至64.5%，HCCLM3细胞系：从36.8%增至41.5%）。S期细胞比例降低（HepG2细胞系：从27.3%降至21.8%，HCCLM3细胞系，从18.3%降至14.0%），表明G0/G1向S的转变停止（图2英尺). 凋亡实验表明，沉默FOXK1后，凋亡细胞的比例显著增加（HepG2细胞株：从11.14%到18.53%，HCCLM3细胞系：从7.92%到10.94%；图2G（2G）). 上述结果表明，沉默FOXK1可抑制HCC细胞表型进展。

在单独的窗口中打开

图2

沉默的FOXK1抑制肝癌细胞的恶性进展。用（A，B）qRT‐PCR和western blot检测转染效率。（C） CCK‐8用于检测细胞活力。（D，E）Transwell用于检测细胞迁移和侵袭能力。流式细胞术检测细胞周期和凋亡*第页 < 0.05.

3.3.福克斯K1是的下游靶基因miR公司‐144‐3便士

为了进一步探索FOXK1的上游调控分子，我们使用生物信息学数据库筛选差异表达的miRNA（DEmiRNAs）。这种差异分析导致了126个DEmiRNAs的鉴定（122个上调，6个下调；图3A级). 通过将下调的DEmiRNAs与预测的靶miRNA交叉，获得了三个miRNA（图3B公司). FOXK1与这三种miRNAs的相关性分析表明，miR‐144‐3p与FOXK1s的负相关最高（图3C、D). 肝癌组织中miR‐144‐3p水平显著降低（图第三方). 然后，通过qRT-PCR检测HCC和正常肝细胞中的miR-144-3p水平，在HCC细胞系中显著降低（图第三层). 随后，miR-144-3p和FOXK1的潜在靶向结合位点被鉴定（图第三代移动通信). 由于HepG2细胞的表型在上述实验中具有重要意义，因此HepG2细胞系成为我们的主要研究重点。我们通过荧光素酶分析验证了miR‐144‐3p和FOXK1具有靶向关系。这表明miR‐144‐3p模拟物能够下调表达FOXK1‐WT的细胞的荧光素酶活性，但不影响表达FOXK‐MUT的细胞（图3小时). 最后，我们将miR‐144‐3p模拟物转染到HepG2细胞中，结果表明，miR‐的过度表达降低了FOXK1 mRNA和蛋白质水平（图3I、J). 总体而言，FOXK1是miR‐144‐3p的目标。

在单独的窗口中打开

图3

FOXK1是miR‐144‐3p的靶基因下游。（A） TCGA‐LIHC数据集中DEmiRNAs的火山图。（B） FOXK1上游基因和下调DEmiRNAs的文氏图。（C） FOXK1和预测miRNAs的皮尔逊相关热图。（D） FOXK1和miR‐144‐3p之间的皮尔逊相关性。（E） 肝癌组织中miR‐144‐3p表达的箱线图。（F） L-O2、HepG2、HCCLM3和Hep3B细胞中的miR‐144‐3p水平。（G） FOXK1‐WT/MUT与通过starBase预测的miR‐144‐3p序列结合的示意图。（H） FOXK1和miR‐144‐3p的靶向关系。（I，J）miR‐144‐3p模拟转染的HepG2细胞中FOXK1 mRNA和蛋白水平*第页 < 0.05.

3.4.miR公司‐144‐3p抑制肿瘤的恶性进展肝癌单元格通过福克斯K1

为了研究miR‐144‐3p通过FOXK1对HCC细胞恶性进展的影响，我们设置了以下组：mim‐NC+oe‐NC、miR-144­3p mimic+oe­NC和miR‐）-144‐3p-simic+o‐FOXK1。首先，通过qRT-PCR和western blot检测细胞的转染效率。miR‐144‐3p模拟物+oe‐NC组的FOXK1 mRNA和蛋白质水平显著低于模拟物-NC+oe­NC组。FOXK1的过度表达可以恢复因miR‐144‐3p过度表达而导致的FOX K1表达降低（图4A、B类). 然后，transwell分析和CCK‐8表明，过表达miR‐144‐3p显著抑制了细胞存活、迁移和侵袭，而进一步过表达FOXK1可以逆转先前的作用（图4C、D). 此后，细胞周期检测显示，过度表达miR‐144‐3p后，G0/G1细胞比例显著增加（HepG2细胞系：从47.3%到57.6%），但S期细胞比例减少（HepG2细胞系：由28.3%到19.9%）；FOXK1和miR‐144‐3p的过度表达共同恢复了细胞周期的进展（G0/G1的比例从57.6%到50.2%，S的比例从19.9%到26.4%；图第四版). 我们观察到，过表达miR‐144‐3p后，凋亡细胞的比例增加（从10.07%增加到18.16%），而过表达FOXK1可以逆转这种增加（从18.16%增加到12.00%；图4英尺). 总之，miR‐144‐3p通过FOXK1抑制肝癌细胞表型进展。

在单独的窗口中打开

图4

miR‐144‐3p通过FOXK1抑制HCC细胞的恶性进展。用（A，B）qRT‐PCR和western blot检测转染效率。（C） CCK‐8用于检测细胞活力。（D） 使用Transwell检测细胞迁移和侵袭能力。（E，F）流式细胞术检测细胞周期分布和凋亡*第页 < 0.05.