TSPO作为免疫抵抗基因参与T细胞介导的胶质母细胞瘤免疫控制

细胞培养与慢病毒转导

如前所述，BTIC13、-111、-129和-134脑肿瘤起始细胞（BTIC）是通过切除人类GB（CNS-WHO-4级）建立的[47]. 细胞系通过商业提供商（eurofins Genomics）的STR图谱鉴定。肿瘤细胞保存在基于RHB-A的无血清培养基（Takara，#Y40001）中，补充青霉素-链霉素（Merck，#P4333）、表皮生长因子（EGF；Miltenyi Biotec，#130–097-751）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF；Miltenyi Bietec，#130-093-842）各20 ng/ml。细胞在37°C、5%CO下培养₂湿度为95%。

为了实现TSPO的稳定敲除，对BTIC13、-111、-129和-134进行慢病毒转导。TSPO-specific short hairpin RNA（shRNA）序列（shTSPO-F:5'-CCG GCC ACA CTC AAC TAC TGC GTA TCT CGA GAT ACG TAG TTG AGT GTT GTT G-3'，shTSPO-R:5'-AAT TCA AAA ACC CTC AAC-TAC TGC-GTA TCT-CGA GAT-ACG CAG TAG GTG G-3'）和一个非靶向对照shRNA被克隆到pLKO.1 puro质粒（Bob Weinberg馈赠；添加基因质粒#8453）[59]. 为了产生慢病毒颗粒，使用Metaffetene（Biontex；#T020-1.0）在人类胚胎肾（HEK）293-T细胞中，将shRNA质粒与pCMV-VSV-G和psPAX2（由奥地利因斯布鲁克大学S.Geley教授善意捐赠）共转染。24小时后，使用含有慢病毒颗粒的HEK细胞滤过的上清液通过旋转接种（900 rpm，1小时，室温）转导BTIC靶细胞。转导24小时后，通过Puromycin（Merck，#P8833；3µg/ml）处理筛选转导细胞。

通过单细胞稀释获得BTIC13 TSPO敲除细胞和对照细胞的克隆细胞系。将分离的单个细胞接种在96孔板中，并逐步亚培养到较大的血管中，直到它们可以用于实验。

人类GB细胞系U-87 MG（ATCC®，HTB-14™；来源：雄性）和U-251 MG（ECACC，09063001；来源：男性）由Markus J.Riemenschneider教授提供。细胞在标准条件下在DMEM（Merck，#D6429）中培养，DMEM补充有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素G和100µG/ml链霉素，37°C，在5%CO2的湿润环境中培养。人类胶质（少突胶质细胞）杂交细胞（MO3.13；Tebubio，CLU301-P，来源：雌性）在37°C的高糖DMEM中培养，不添加丙酮酸钠（Merck，#D5796），补充10%胎牛血清、100 U/ml青霉素G和100µG/ml链霉素，在5%CO2的湿化气氛中培养。

肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的生成

将新鲜切除的GB组织切成小块，并在添加400µg/ml DNase I（Merck，#1128493201）和400 U/ml IV型胶原酶（Worthington，#LS004209）的对照培养基中进行酶消化，在37°C，5%CO的条件下持续2 h₂然后通过100µm过滤器过滤消化后的肿瘤，以1400 rpm离心10 min，并与2×10共同培养⁷将来自3个不同供体的异基因PBMC放在20 ml的膨胀培养基中，加入30 ng/ml抗CD3、3000 U/ml IL-2和0,38µg/ml两性霉素B（Gibco，#15290-26），照射14天。在第5天、第7天和第11天，用新鲜膨胀培养基补充IL-2。第14天，收集细胞，用FACS进行表征，并冷冻在5×10的等分中⁶在冷冻介质A（60%AB血清和40%RPMI1640）和B（80%AB血清与20%DMSO）中。

氟抗原特异性CD8的产生⁺T细胞（FluTC）

如前所述，产生流感抗原特异性T细胞（FluTC）[94]. 简单地说，外周血单个核细胞（PBMC）是从HLA-A2的浅黄色外壳中分离出来的⁺通过密度梯度离心法（Biocoll，Biochrom，#L6715）对健康供体进行离心。第0天，共CD8⁺通过磁性分离（CD8）从PBMC中分离T细胞⁺T细胞分离试剂盒，Miltenyi，#130–096-495），根据制造商的说明，在存在HLA-A2匹配的流感肽（GILGFVFTL，ProImmune，#P007-0A-E）的情况下扩增14天。自体CD8阴性部分用60格雷（IBL 437C血液辐射器）照射，并作为饲养细胞使用1周，然后用照射的T2细胞代替饲养细胞。在第1天和第8天，向膨胀液中添加100 U/ml IL-2（Clinigen，PZN-16771811）和5 ng/µL IL-15（研发系统，#247-ILB/CF）。FluTC的百分比在第7天和第14天通过流式细胞术（FACS）通过五聚体染色（GILGFVFTL-APC，ProImmune#F007-4A-E）测定。抗原特异性扩增后，1×10⁶FluTC由FACS分类，并通过使用Rosenberg协议的修改版本进一步扩展14天[22]. 简单地说，在第0天，将分选好的FluTC培养在150 ml膨胀培养基中（50%AIM-V（赛默飞世尔科学公司，#12055091）、50%CLM（CLM:RPMI1640（赛默飞科学公司，#21875091），10%人类AB血清（Valley Biomedical，#HP1022HI）、1%HEPES（默克公司，#H0887）、100 U/ml青霉素G、，100µg/ml链霉素和0.01%β-巯基乙醇（赛默飞世尔科学公司，#33150–010），补充30 ng/ml抗CD3（克隆：OKT3，eBioscience，#14–0037-82）、3000 U/ml IL-2和2×10⁸来自3个不同健康供体的辐照异基因PBMC。在第5天、第7天和第11天，用新鲜的膨胀培养基补充IL-2。第14天，收集细胞，用FACS进行表征，并冷冻在5×10的等分中⁶在冷冻介质A（60%AB血清和40%RPMI1640）和B（80%AB血清与20%DMSO（默克，#D260））中。使用当天，FluTC在共培养或激活前至少4小时解冻，并在CLM中以1×10的浓度培养⁶细胞/ml。

多克隆活化T细胞上清液的制备

在4°C下用4µg/ml抗CD3抗体（克隆：OKT3，eBioscience，#14–0037-82）在非组织培养的6孔板上涂布过夜。第二天，用1 ml PBS将微孔冲洗两次，并将FluTC/TIL接种在补充有1µg/ml人抗CD28抗体（克隆号：CD28.2，BioLegend，#302902）的CLM中，浓度为1×10⁶细胞/ml。活化24小时后，以1400 rpm离心细胞悬液10分钟，并将活化上清液收集到新鲜试管中以供进一步使用。活化的TIL129在CLM中重新悬浮，并进一步用于共培养分析。

反向小干扰RNA转染

用非靶向对照小干扰RNA（siRNA）（Horizon，D-001810-04）或4个TSPO特异性siRNA池转染U-87 MG和U-251 MG细胞（序列：5'-ACA CUC AAC UAC GUA U-3'；5'-CUU CUU UGG UGC CCG ACA a-3'；5'-GGG CCU UGG-AUC UCC U-3'）；5'-CUU GUG AUG UGG CCG U-3'，Horizon，MQ-009559–03），根据制造商的说明，使用RNAiMAX（赛默飞世尔科技，#13778–150）。简单地说，将10µL 250 nM siRNA溶液添加到96 well板的每个孔中。将0.1µl RNAiMAX转染试剂稀释在10µl RPMI（Merck，#R8758）中，并在室温下培养10分钟。添加20µL RPMI，并将30µL RNAiMAX混合物给予涂有siRNA的微孔，并在室温下培养30分钟。5 × 10^三将U-87 MG或U-251 MG细胞重新悬浮在含有10%FCS的60µL DMEM中，接种在含有siRNA-RNAiMAX的微孔中，并在37°C、5%CO2下培养72小时。对于6孔平板转染，上述方案按比例放大。

RNA的分离、逆转录和定量RT-PCR

根据制造商的协议，使用RNeasy Mini试剂盒（Qiagen，#74106）从培养细胞中提取总RNA，并使用QuantiTect逆转录试剂盒（Qiagen）转录500–1000 ng RNA。对于10 ng模板cDNA的实时定量PCR（RT-qPCR），2x QuantiFast SYBR Green PCR混合物（Qiagen，#204056）和300 nM基因特异性引物混合物（TSPO fw:TCT TTG GTG CCC GAC AAA T；TSPO版本：GGT ACC AGG CCA CGG TAG T，Merck；PD-L1 fw TGC CGA CTA CAA GCG AAT TG，PD-L1版本：CTG CTT GTC CAG ATG ACT TCG，Merck²qPCR引物检测人PI3，Qiagen，PPH11211A-200；RT公司²qPCR引物检测人类SLPI，Qiagen，PPH02863A-200）每20μL反应一次，每个样品制备三份。使用QuantStudio 3（Thermo Fisher Scientific）进行反应。靶基因的表达被标准化为参考基因的表达（β-actin fw:CCT CGC CTT TGC CGA TCC，β-acton rev:GCG CGG CGA TAT CAT CC；RPL13A fw:CAT AGG AAG CTG GGA GCA AGA，RPL13A-rev:GCC CTC CAA TCA GTC TG；或GAPDH fw:AGC CAC ATC GCT CAG ACA C，GAPDH rev:AAT ACC AAC TCC GTC GAC T）采用比较Ct法（ΔΔCt）进行分析。结果显示为与对照样品相比的折叠变化。

下一代RNA测序

根据制造商的说明，使用Illumina Straded mRNA Prep试剂盒（Illumiana，#20040534）从200 ng总RNA中制备下一代测序（NGS）文库。NGS在NextSeq 550 Dx仪器上进行，使用索引、150周期配对端读协议和NextSerq 500/550高输出试剂盒v2.5（Illumina，#20024907）。仅使用免费的、可定制的工具和工作站对NGS数据进行分析。图像分析和基本调用产生了.bcl文件，这些文件被bcl2fastq2工具v2.17.1.14转换为.fastq文件。接下来，使用HiSat2映射器将.fastq文件映射到人类基因组组件GRCh38.87，允许一个不匹配[42]. 使用featureCounts v2.0.1进一步处理所有唯一点击，为所有样本创建计数表[51]. 读取数基于位置，即基因外显子的结合。使用负二项回归模型，使用SVA包的Combat_Seq消除批量效应，该模型保留了RNA-Seq研究中计数数据的整数性质[105]. 使用DeSeq2使用R v4.1.2生成PCA和差异表达分析[54]. 使用增强型火山R程序包和交互式复杂热图R程序包生成火山图和热图[8,28].

ELISA和Luminex分析

分析T细胞-肿瘤细胞共培养上清液和抗CD3/CD28激活的T细胞上清液，以检测IFNγ（人IFN-γELISA试剂盒，BD OptEIA#555142）、肿瘤坏死因子α（TNFα）（人TNF-ELISA试剂瓶，BD OPEIA#555212）、Granzyme B（人Granzeme B ELISA开发试剂盒，Mabtech#3485-1H-20）和TRAIL（人类TRAIL/TNFSF10 DuoSet ELISA，研发系统，#DY375-05）。实验是按照制造商的说明进行的。使用Spark 10 M多模微孔板阅读器（TECAN），以λ=570 nm作为参考波长，在λ=450 nm处测量吸光度。可溶性Fas配体（FasL）通过多重细胞因子检测（MILLIPLEX人CD8⁺T细胞磁性预混17 Plex试剂盒，默克，#HCD8MAG15K17PMX）。根据制造商的说明进行分析，并使用MAGPIX Luminex仪器（默克）测量样品。

蛋白质印迹分析

按说明进行Western blot[47]. 简单地说，细胞颗粒在RIPA缓冲液中冰上溶解10分钟，然后离心10分钟（14000 rpm，4°C）。使用BC分析蛋白质定量试剂盒（Interchim，#UP40840A）测定蛋白质浓度。等量的蛋白质在5x Laemmli缓冲液中稀释，煮沸，在12%SDS PAGE上分离，并转移到PVDF膜（VWR，#516–0224）中，PVDF被封闭在TBS-T缓冲液中5%脱脂奶粉中。在4°C的温度下，用指示的一级抗体孵育过夜。然后，用TBS-T缓冲液清洗膜，并用辣根过氧化物酶（HRP）结合的二级抗体孵育。使用Immobilon Forte Western HRP底物（Millipore，#WBLUF0100）进行检测。使用ImageQuant TL软件（GE Healthcare，TL 8.1）进行蛋白质检测。通过将感兴趣的蛋白质归一化到负荷控制和处理控制来确定相对蛋白质表达。使用了以下主要抗体：兔抗Caspase 9（Cell signaling Technologies，#9502，1:1000）、兔抗Caspase 3（Cell signaling技术，#9662，1:1000，兔抗TSPO（V.Milenkovic的实物礼物，1:5000）、鼠抗GAPDH（Santa Cruz，#47724，1:2500）和鼠抗肌动蛋白（Merck，#A5316，1:2500，）。HRP标记的抗小鼠IgGκ结合蛋白（Santa Cruz，#sc5161021:5000）和小鼠抗兔IgG抗体（Santa Cruz，#sc-235721:5000）用于检测初级抗体。

流式细胞术

流式细胞术用于检测已发表的肿瘤和T细胞质膜上表达的蛋白质[83]. 用PBS-EDTA从平板上分离肿瘤细胞，500×g离心5 min，再悬浮在FACS缓冲液（2×10）中⁵细胞/管）。根据制造商的说明，使用Zombie Aqua™（BioLegend，#423102）或Zombie NIR™Fixable Viability Kit（#423106），然后在FACS缓冲液（PBS，2%FCS）中以100µg/mL的浓度用Kiovig（人血浆衍生免疫球蛋白，Baxter，PZN-06587176）封闭，以区分活细胞在冰上黑暗中放置15分钟。肿瘤细胞在FACS缓冲液中清洗一次，并在黑暗中用荧光团结合的初级抗体或同型对照物PE抗CD119（IFN-γRα链）在冰上培养20分钟（克隆号：GIR-208，BioLegend，#308606）；APC抗CD120a（TNF-R1）（克隆号：W15099A，BioLegend，#369906）；PE抗CD120b（TNF-R2）（克隆号：3G7A02，BioLegend，#358404）；BV421抗CD95（Fas）（克隆号：DX2，BioLegend，#305624）；APC抗CD261（DR4，TRAIL-R1）（克隆号：DJR1，BioLegend，#307208）；PE抗CD262（DR5，TRAIL-R2）（克隆号：DJR2-4（7-8），BioLegend，#3007406）；抗人HLA-A、B、C（MHC-I）（克隆号：W6/32，BioLegend，#311402）。对于MHC-I染色，将细胞清洗一次，并与二级抗体BV605抗小鼠IgG2a/IgG2b（克隆号：R2-40，BD，#744294）一起在黑暗中的冰上孵育20分钟。使用与以下抗体或其各自的同型对照相同的方案对T细胞进行染色：AF-700抗CD3（克隆号为UCHT1，BioLegend，#300424）; PerCP-Cy5.5抗CD4（克隆号：RPA-T4，BioLegend，#300530）；V450抗CD8（克隆号：RPA-T8，BD Bioscience，#560347）；APC-Cy7抗CD45RO（克隆：UCHL1，BioLegend，#304227）；BV605抗CD62L（克隆号：DREG-56，BioLegend，#304833）；APC抗PD-1（克隆号：EH12.2H7，BioLegend，#329908）；FITC抗LAG3（克隆号：11C3C65，BioLegend，#369307）；PE-Cy7反TIM3（克隆号：F38-2E2，eBioscience-Thermo Fisher Scientific，#25–3109-41）；PE anti-TRAIL（克隆号：RIK-2，BioLegend，#308206）。FluTC在抗体染色前在室温黑暗中用五聚体（A*02:01 GILGFVFTL，Proimmune，#F007-4A-E）染色10分钟。在IFNγ和TNFα细胞因子分泌测定中，TIL129与BTIC129共培养12小时。然后，根据制造商的说明，使用IFN-γ（MACS Miltenyi，#130–090-433）和TNF-α分泌检测试剂盒（#130–081-267）对TIL进行染色。将染色的细胞洗涤一次，用FACSLyric流式细胞仪（BD Bioscience）获得，并使用FlowJo（Tree Star）分析数据。

免疫细胞化学

BTIC13野生型细胞和TSPO敲除细胞在层粘连蛋白涂层的8孔LabTek室载玻片（Thermo Scientific，#154534PK）上生长24小时。在室温下用4%多聚甲醛固定细胞10分钟，并用1x PBS洗涤三次。用0.5%Triton X-100（Merck，#23472-9）、10%驴血清（Merck；#S30-M）1×PBS在室温下培养45分钟，细胞在4°C下与兔抗TSPO抗体（Abcam，#ab10949，1:500）和小鼠抗ATPB抗体（Abcam，#ab14730，1:1000）在0.1%Triton X-100中培养过夜，2%驴血清在1x PBS中培养。用1x PBS清洗三步后，用二级抗体驴抗兔Alexa Fluor 488（Life Technologies，#A21206，1:500）、驴抗鼠Alexa Fluor 568（Life-Technologies，#10042，1:1000）和DAPI（Merck，#D9542，5µg/ml）培养细胞。在最后三个清洗步骤后，用ProLong Gold Antifade Mountant（Invitrogen，#P36930）安装载玻片，并在室温下干燥。使用倒置荧光显微镜（Zeiss，Axio Observer.Z1）和VisiView软件（Visitron Systems，2.08版）分析载玻片。

T细胞介导的TSPO诱导

对于T细胞介导的BTIC中TSPO表达调控的分析，4×10⁵BTIC13、129或131接种在补充的RHB-A培养基中的6孔板（TPP）中。1天后，用所示浓度的氟肽对细胞进行脉冲处理1 h，清洗并与4×10⁵FluTC，或用显示的T细胞培养上清液处理。以保存在普通CLM中的BTIC作为对照。18小时后，收集共培养上清液进行细胞因子分析，洗去T细胞并收集剩余的BTIC。对于细胞因子治疗，BTIC在CLM中培养1天，然后用TNFα（PeproTech，#300-01A）或IFNγ（PeproTech，#300-02）处理，或者不处理24和48小时。为了阻断细胞因子受体，将BTIC与人抗TNF-R1（10µg/ml，R&D Systems，#MAB625）、抗TNF-R2（10µ）、抗IFNG-R1（2µg/ml，R&D Systems，#MAB6731）抗体或小鼠IgG1同型对照物（R&D System，#MAB 002）在37°C、5%CO2的500µl CLM中预孵育30分钟。培养30分钟后，添加1.5 ml指示的T细胞培养上清液。24小时后，将细胞制成颗粒并进行snap冷冻，以进行进一步的mRNA和蛋白质分析。

细胞增殖和活性测定

细胞以5×10的密度在96孔黑色平板（SPL Life Sciences，#30296）中培养^三100µl生长培养基中的细胞/孔。24小时后，用特定浓度的TRAIL（PeproTech，#310-04）、TNFα（PeproTechn，#300-01A）、IFNγ（PeproTech，#300-02）或FasL（BioLegend，#589404）处理细胞48小时。在测量前4小时，使用10%的雷沙祖林溶液（研发系统，#AR001），并使用VarioSkan Flash多模阅读器（Thermo Fisher Scientific）在560 nm激发/590 nm发射下测量荧光。分四次进行分析，并重复三次。数值标准化为0 ng/ml。

XTT测定

发表的基于XTT的比色细胞活性测定法测定了特异性T细胞介导的肿瘤细胞杀伤[36]. siRNA转染3天后（如上所述），U-87 MG和U-251 MG细胞装载0.01µg/ml的氟肽（GILGFVFTL，Proimmune，#P007-0A-E）。孵育1小时后，去除脉冲培养基，并取下2×10⁴向孔中加入100µl的FluTC或普通CM。shRNA转导5×10^三BTIC13或1×10⁴共培养前1天，每96周将BTIC129细胞接种在100µl完全补充的RHB-A培养基中。第二天，用0.001µg/ml氟肽加载BTIC13细胞，并与2×10共同培养⁴FluTC，而BTIC129与1×10直接共培养⁵在100µl CM中预先激活自体TIL129。共培养4小时后，通过向每个孔中添加50µl 1 mg/ml XTT试剂溶液（Biomol，#52629500）和1µl 1.25 mM甲磺酸苯肼（PMS）（Biomol，#Cay30558-5）来测量靶细胞的活性。将平板在37°C和5%CO2下培养，并在30、60、90和120分钟后使用Spark 10 M多模微孔板阅读器（TECAN）检测吸收（450 nm，650 nm作为参考）。活细胞对XTT的最大减少量被确定为单独含有肿瘤细胞的三重孔的平均值，而背景是含有培养基的三重孔的平均值。由于T细胞的存在而导致的非特异性formazan形成是从三个含有与相应共培养孔中相同数量的T细胞的孔中测定的。共培养孔中剩余活肿瘤细胞的百分比计算如下：生存率（%）=[OD（共培养孔）–OD[1]（OD=光密度）。

基于荧光素酶的caspase-3/-7分析

除了实时活细胞成像分析外，还使用caspase-Glo®3/7分析系统（Promega，#G8093）定量了caspase-3/-7介导的BTIC凋亡。将shRNA转导的BTIC13（体细胞或克隆细胞）和BTIC129细胞接种在白色不透96-well板（Perkin-Elmer，#6005680）中，并按照XTT分析所述与T细胞共同培养，或用T细胞活化上清液或50 ng/ml TRAIL处理。4小时后，向细胞中添加100µl Caspase-Glo®3/7试剂。在室温下在轨道振动筛（500 rpm）上培养30分钟后，使用Spark 10 M多模微孔板阅读器（TECAN）测量指示活性caspase-3/-7水平的发光强度。从共培养孔中减去仅在T细胞孔中测得的发光强度，以排除T细胞衍生的caspase-3/-7活性。

实时活细胞成像分析

Caspase-3/-7介导的BTIC凋亡通过使用Inccyte®SX5活细胞成像仪（Sartorius）进行实时活细胞成像来确定。ShRNA-转导的BTIC13和BTIC129细胞要么与T细胞共同培养以进行XTT试验，要么用T细胞培养上清液或50 ng/ml TRAIL处理（PeproTech，#310-04）。然后，向细胞中添加Incucyte®Caspase-3/7绿色染料（1:1000，Sartorius，#4440）。以10倍放大率对指定时间点的细胞进行成像。使用Incucyte®2020B软件量化肿瘤细胞凋亡。

利用癌症基因组图谱和单细胞RNAseq数据集进行相关性分析

GEPIA网络服务器(http://gepia.cancer-pku.cn/)用于对TSPO公司以及癌症基因组图谱（TCGA）-GBM肿瘤数据集中的其他指示基因（163名患者）[88]. 皮尔逊相关系数（R）和P值显著性用于每个相关性。

通过相应的登录号（GSE131928）从基因表达综合数据库（GEO）检索到Smart-seq2分析的总共20个成人GB样本的ScRNA-seq数据[65]. 如作者所述，使用“Seurat”R包中的内置函数过滤和处理数据[77]. 非癌细胞通过其已发表的标记物进行鉴定，并进一步从分析中排除，而剩余的4696个恶性细胞则通过“和谐”R包进行进一步处理和整合[44]. 使用25台PC以0.5分辨率进行聚类，并根据已知标记基因的表达进行检测，以确定不同的恶性细胞亚群。Pearson相关系数计算为TSPO公司以及使用阳性表达值细胞的数据显示的基因，其中零表达值细胞被排除在外。“ggpubr”R包用于在散点图上显示相关系数和P值[40].

从分子特征数据库（MSigDB，http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb第7.5.1节）[52].

T细胞衍生IFNγ和TNFα诱导BTIC中TSPO表达

为了描述可诱导BTIC中TSPO上调的可溶性T细胞衍生因子，我们研究了TCGA-GBM数据集中与TSPO公司.TSPO公司表达与IFNGR1,IFNGR2、TNFRSF1A、，和TNFRSF1B公司以GB为单位的表达式（附加文件1：补充图2a）。其中，IFNGR2在整个转录组中排名前50位的基因与TSPO公司假设通过IFNγ和/或TNFα的信号传导可能与TSPO表达有关，我们用重组IFNγ与TNFα处理BTIC13和BTIC129。BTIC13在IFNγ或TNFα治疗后上调TSPO mRNA和蛋白表达，而在BTIC129中，TSPO仅在IFNα治疗后升高（图2a、 b、f、g、附加文件1：补充图2b，c）。

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图2

GB细胞对T细胞衍生IFNγ和TNFα的反应上调TSPO表达。a-j诱导TSPO表达(a至e)BTIC13和in(f-j型)BTIC129对TNFα和IFNγ信号的反应。(a、 b条,f、 g）用50 ng/ml TNFα或IFNγ处理BTIC。分析治疗后24和48小时TSPO mRNA和蛋白的表达。a、 如果RT-qPCR分析TSPO公司BTIC中的mRNA表达。结果显示，与未经处理的情况相比RPL13A型mRNA正常化。b条,克BTIC中TSPO蛋白表达的Western blot分析。c（c）-e（电子）,小时-j个TNF-R1/2和IFNG-R1阻断对激活T细胞上清液反应的BTIC中TSPO表达的影响。BTIC与抗TNF-R1/2和/或抗IFNG-R1阻断抗体预先孵育，并用活化的上清液处理(c-e公司)FluTC或(h-j型)波浪129。对照培养基（CM）处理用于监测基础TSPO表达。在处理后24小时分析TSPO的mRNA和蛋白表达。c（c）,小时RT-qPCR分析TSPO公司BTIC中的mRNA表达。结果显示为折叠变化，与同型控制相比β-肌动蛋白mRNA正常化。d日,e（电子）,我,j个BTIC中TSPO蛋白表达的Western blot分析。d日,我GAPDH蛋白归一化后，蛋白质定量表示为与同型对照相比的倍数变化。e（电子）,j个两个独立实验的代表性印迹。k个-n个对20例成人GB患者中4700个细胞的单细胞RNA-Seq数据进行分析TSPO公司IFNγ诱导基因的表达及其相关性[65].k个所有恶性细胞的UMAP（均匀流形近似和投影）图。使用Harmony算法对细胞进行聚类，并根据Neftel等人[65].（AC：类星形胶质细胞，NPC：类神经祖细胞，OPC：类少突胶质细胞，MES：类间质，G1/S，G2/M：循环细胞）。我UMAP图TSPO公司在恶性细胞中表达。米小提琴情节TSPO公司在所有确定的簇中表达。n个表达式之间的相关性TSPO公司和IFNGR1,IFNGR2以及IFNγ诱导基因第二百七十四页,红外1,SOCS3系列,企业对企业,IRF7，和国际单项体育联合会3在单细胞水平。R表示皮尔逊相关系数。o（o）的比较TSPO公司在接受新辅助或辅助Pembrolizumab治疗的复发性GB患者中的表达。对来自临床试验NCT02852655的RNA-Seq数据（GSE121810）进行分析，以比较IFNγ评分高或低的患者中TSPO的表达[18]. （CPM：百万分位数）(一,b条,d日,e（电子）,（f）,克,我,j个)显示了至少两个独立实验的代表性数据。c、 小时三个独立实验的累积数据。值代表平均值±标准偏差。P值使用(一,c（c）,（f）,小时)双尾学生t检验和(o（o）)Mann–Whitney检验（*=P（P） < 0.05, ** = P（P） < 0.01, *** = P（P） < 0.005, **** = P（P） < 0.001，ns：无显著性

为了确定IFNγ和TNFα是否主要负责TSPO对活化T细胞的可溶性T细胞因子的上调，我们在用活化T细胞上清液处理之前阻断了BTIC上的TNF-R1、TNF-R2和IFNG-R1。除TSPO外，我们还研究了PD-L1表达作为有效抑制IFNγ和TNFα介导的信号传导的阳性对照。单独阻断TNF-R1和IFNG-R1可显著降低BTIC13中TSPO和PD-L1的诱导，三种受体的联合阻断可完全消除TSPO和PD-L1的上调，证明了细胞因子受体信号的有效抑制，并表明T细胞诱导TSPO仅由IFNγ和TNFα介导（图2c–e）。我们对BTIC129进行了相同的实验，使用活化的自体TIL129上清液代替FluTC（图2h–j）。与之前观察到的IFNγ而非TNFα上调BTIC129中TSPO的结果一致，单独阻断TNF-R1/2并不影响上清液介导的TSPO诱导。，IFNG-R1阻断导致BTIC129中TSPO上调受到轻微但不显著的抑制。然而，我们观察到联合受体阻断后TSPO表达显著但仍不完全减少。值得注意的是，PD-L1上调的阻断也不完全，这表明细胞因子-受体相互作用没有完全被抑制。在BTIC和T细胞的共培养中，我们进一步观察到培养液中IFNγ和TNFα水平与BTIC中TSPO表达之间的正相关（附加文件1：补充图2d，e）。

为了证实这些结果，我们分析了一个可公开访问的单细胞RNA-Seq数据集，其中包括来自20个初级GBs的4700 GB细胞（图2k–n，附加文件1：补充图2f-h）[65]. 我们的分析表明TSPO公司在GB的所有子类型中（图2k–m）。由于该数据集中分类的T细胞数量较少，因此无法从统计学上关联T细胞标记物和TSPO公司表达式。然而，TSPO公司GB细胞中的表达与IFNGR1,IFNGR2、TNFRSF1A、，和TNFRSF1B公司（图2n、 其他文件1：补充图2g）。

接下来，我们对TSPO公司已知IFNγ和TNFα诱导基因是IFNγ及TNFα受体刺激的潜在指示物，并发现与IFNγ诱导基因密切相关(GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、SOCS3、CD44、和CCL2级) [74]和TNF诱导基因(普拉乌,普劳尔,LIF、，和BIRC3）（图2n、 附加文件1：补充图2f，h）[55,76]. 因此，与免疫治疗后IFNγ反应较低的GBs相比，新佐剂或佐剂抗PD-1治疗后出现显著IFNγ应答的GBs中TSPO表达显著增高（图2o）[18].

TSPO保护胶质母细胞瘤细胞对抗T细胞介导的细胞毒性

为了解决TSPO在GB免疫抵抗中的作用，我们通过实验沉默了人类GB细胞系和原代BTIC中TSPO的表达，并使用异基因和自体T细胞进行了细胞毒性分析（图三，其他文件1：补充图3）。TSPO敲低导致FluTC对U-87 MG和U-251 MG脑肿瘤细胞系的杀伤增加（图三a、 b、附加文件1：补充图3a，b）。同样，与TSPO缺乏的BTIC13变体相比，TSPO产生的BTIC13-细胞对FluTC的抗性显著提高（图三c、 其他文件1：补充图3c-e）。因此，TSPO缺乏导致自体TIL对BTIC129细胞的溶解增加（图三d、 其他文件1：补充图3g，h）。这些结果通过另一种定量靶细胞杀伤的方法得到了证实（图三e–g）。

我们还生成了单细胞TSPO缺陷的BTIC13克隆，与对照克隆相比，在所有三个TSPO缺陷克隆中观察到FluTC介导的杀伤增加（图三f、 其他文件1：补充图3f）。同样，TSPO-deficient BTIC129细胞与自体TIL共培养后，凋亡增强（图三g） ●●●●。值得注意的是，TSPO沉默后MHC-I的表达没有增加，排除了TSPO缺乏BTIC杀伤率提高与细胞免疫原性改变有关的可能性（附加文件1：补充图3i）。

TSPO保护胶质母细胞瘤细胞对抗活化T细胞分泌的细胞毒性分子

接下来，我们研究了TSPO是否可以保护GB细胞免受细胞毒性T细胞释放的可溶性细胞毒性剂如死亡受体配体的影响。TSPO敲除导致U-87 MG和BTIC13细胞中caspase-3/-7活化，这表明不仅在与FluTC共培养时，而且在用活化的FluTC上清液处理后，TSPO敲低也导致凋亡增加（图4a、 b，上下面板）。同样，TIL129及其活化上清液均诱导TSPO缺乏的BTIC129细胞凋亡增加（图4c、 上下面板）。我们通过细胞毒性试验验证了TSPO-介导的对T细胞上清液中细胞毒性分子的保护作用，其中TSPO-缺失的BTIC13克隆和BTIC129细胞在使用活性上清液处理后，与TSPO-增殖的肿瘤细胞相比，凋亡增加（图4e、 f）。

TSPO保护胶质母细胞瘤细胞免受TRAIL诱导的凋亡

在活化的FluTC和TIL129的上清液中，我们观察到细胞毒性因子TNFα、IFNγ、FasL和TRAIL（附加文件1：补充图2d，e，4a，b）。对BTIC13和BTIC129表达的各自受体的研究表明，IFNG-R1、Fas和TRAIL-R2（DR5）的表达水平较高，而TNF-R2的表达水平较低。TNF-R1在BTIC13上的表达较高，而TRAIL-R1（DR4）仅在BTIC3上表达（附加文件1：补充图4c，d）。

TSPO-producient和-deficient BTIC13细胞对重组人TNFα、IFNγ和FasL的治疗都有抵抗力，因为细胞活力没有受到影响，并且不能检测到caspase-9/-3和PARP1的裂解，作为内在/外在凋亡的指标（图5a、 b）。然而，在TSPO敲除后，BTIC13对TRAIL诱导的凋亡的敏感性增加，反映为EC降低₅₀与TSPO产生细胞相比，TSPO缺乏细胞的TRAIL反应值（图5c） ●●●●。据此，我们观察到TRAIL治疗后TSPO缺陷细胞中caspase-9/-3和PARP1的裂解增加，表明TSPO参与了内源性和外源性凋亡途径（图5d） ●●●●。我们还观察到，经TRAIL治疗后，TSPO缺乏的BTIC13中caspase-3/-7激活增加（附加文件1：补充图4e，f）。

与这些观察结果一致，TSPO-deficient BTIC13克隆对TNFα、IFNγ和FasL具有耐药性，而对TRAIL敏感（图5e–i）。对不同TSPO沉默的BTIC13克隆的比较表明，TSPO表达的程度影响了它们对TRAIL的敏感性，因为克隆F6-2表达的TSPO水平高于其他两个TSPO缺失的克隆，显示出更低的TRAIL敏感性（图5i） ●●●●。与BTIC13细胞类似，BTIC129细胞以及BTIC111和BTIC134细胞也被TSPO选择性保护，以抵抗TRAIL介导的凋亡（图5j–l，附加文件1：补充图4g，h）。

由于TSPO通过体外选择性保护TRAIL发挥其肿瘤保护作用，我们推测TSPO的表达是否与原发性GB中TRAIL受体的表达相关。根据TCGA-GBM和单细胞RNA-Seq数据集，TSPO公司GB细胞的表达确实与TRAIL受体的表达呈正相关TNFRSF10A型（TRAIL-R1）和TNFRSF10B型（TRAIL-R2）（附加文件1：补充图4i，j）[65,88].

这项工作是在雷根斯堡脑肿瘤中心（ZHT，Zentrum fuer Hirntumoren；网址：www.ukr.de/zht). 我们感谢LIT流式细胞术核心设施对T细胞分选的支持。我们感谢Irina Fink、Karin Holz、Birgitta Ott-Rötzer、Silvia Seubert和Heiko Smetak提供的技术支持。