细胞对压力的反应，包括暴露于环境（紫外线辐射、热休克、重金属）、病理（感染、发热、炎症、恶性肿瘤、缺血）或生理（生长因子、激素刺激、组织发育）刺激，在分子水平上通过快速合成分子伴侣来表征，如应激蛋白的热休克家族（热休克蛋白[hsp]）（有关综述，请参阅参考文献4,10,23,28,29、和41). 这种反应在原核和真核细胞中非常保守，广泛认为在宿主防御和生存中起关键作用(30). 应激诱导hsp的产生有助于防止最初的损伤，促进恢复，并产生对随后应激的抵抗状态（耐热性）(15,28). hsp的这种保护作用归因于几个功能特性，包括通过最小化分子内和分子间的不正确相互作用来积极参与蛋白质的折叠，维持蛋白质的天然折叠状态，以及修复或促进错误折叠蛋白质的降解(1,16). 此外，hsp可以通过调节各种应激刺激诱导的细胞凋亡的参与和/或进展来发挥细胞保护作用(2). 除了hsp在细胞生存中的既定作用外，在一系列人类疾病中，包括神经退行性疾病（如淀粉样变、朊病毒病和阿尔茨海默病），其伴侣功能也受到广泛的临床关注以及各种心血管疾病（包括心肌缺血、心肌肥厚、中风和血管损伤）(4,37,41).
hsp70蛋白家族在细胞对急性应激状态的反应中起着关键作用，它是真核细胞中丰富且高度保守的蛋白质组，其成员组成性表达、诱导性调节和/或靶向不同的细胞内细胞器。在小鼠中，hsp70家族至少包含七种蛋白质，包括热休克同源蛋白（Hsc70）、葡萄糖调节蛋白Grp75和Grp78、精细胞特异性hsp70.2和睾丸特异性Hsc70t。此外，细胞暴露在应激损伤下，通过诱导无内含子激活生存反应热休克蛋白70.1和热休克蛋白70.3基因（指定热休克蛋白70i). 这些基因编码68kDa的相同蛋白质，位于主要组织相容性复合体III类基因座内，相距约8kb(14,18,19). hsp70蛋白家族的分子伴侣功能依赖于ATP调节的hsp70与底物多肽中疏水片段的结合(6,33). 所有hsp70蛋白都含有一个保守的44-kDa NH2-末端ATP酶结构域，一个更可变的COOH末端结构域，包含一个15-kDa肽结合位点和一个10-kDa模块，功能未定义。与ADP结合形式相比，ATP结合形式的蛋白质对底物的亲和力较低。因此，这些蛋白质结合一种线性肽中间体，该中间体由ATP结合和水解的循环介导，然后是ADP-ATP交换和释放。hsp70伴侣蛋白的活性进一步受到许多其他耳蜗蛋白的调节（例如，hsp40、hip、hop）(7,17).
在细胞中的急性应激刺激期间，hsp70i（hsp70.1或hsp70.3）蛋白的快速诱导表达是这些分子生理功能的一个独特特征。因此，监管网络和机制受到了广泛关注热休克蛋白70i在体内细胞和组织中的表达。众所周知，hsp70i的表达是通过涉及热休克转录因子（HSF）的转录激活和翻译机制实现的。小鼠HSF家族成员（HSF1、HSF2或HSF4）与以下基因启动子中的热休克元件（交替定向的五核苷酸5′-nGAAn-3′单位）结合热休克蛋白基因及其转录调控(35,48). HSF1广泛表达，是应激诱导的热休克蛋白70i基因。相反，HSF2被提议进行监管热休克蛋白70i在特定发育阶段表达，而最近描述的HSF4的功能尚不清楚(12,42). 尽管对HSF在复杂生物体细胞中的功能进行了广泛的研究，但关于HSF在调节组织和细胞特异性表达热休克蛋白的，尤其是热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.3在体内正常或应激条件下。然而，一些证据表明热休克蛋白70i在某些组织中，基因也在生理条件下组成性表达，这表明这种表达并不是单纯由HSF1调节的。事实上，已经证明热休克蛋白70.1在合子基因组激活开始时转录（双细胞阶段），这种自发表达受转录因子而非HSF（例如Sp1）调节(5)尽管其他研究使用异源热休克蛋白70.1调节转基因表达的启动子也暗示了HSF1在这种自发hsp70.1表达中的作用。(8,24,25,44). 此外，免疫组织化学研究为hsp70i在成年小鼠某些组织中的组成性表达提供了证据，例如皮肤上皮层(31). 然而，一个重要的警告是，许多这些研究依赖于使用截断的热休克蛋白70启动子序列来调节转基因（β-半乳糖苷酶或萤光素酶）的表达，这种条件可能无法忠实地复制其正常活性。总之，关于组织特异性的现有证据热休克蛋白70i表达式不足以为定义特定角色热休克蛋白70在发育过程中或在成人中。
假设存在多重热休克蛋白70家庭成员（包括压力引起的热休克蛋白70.1和热休克蛋白70.3)由于序列同源性很高，迄今为止还不可能确定每个基因在体内细胞应激保护中的确切功能贡献，以及单个hsp70在功能上如何相互关联。有直接证据表明，hsp70i通过一种称为耐热性（或细胞保护）的细胞保护过程，在对抗应激诱导的细胞死亡方面发挥着多重作用，在该过程中，细胞最初处于亚致死状态（高温预处理）或者其他应激刺激可以大大减弱所有热诱导的变化，从而导致更严重的应激挑战，而应激挑战通常会导致细胞广泛死亡。相反，hsp70i的表达减弱或功能中和使细胞对凋亡敏感，而大多数细胞中hsp70i的过度表达可保护细胞免受各种应激刺激引发的细胞死亡，包括高温、氧化应激、化疗药物和辐射(27). 这些观察清楚地证明了hsp70i的细胞保护特性；然而，这是如何实现的还不太清楚。越来越多的证据表明，使用无细胞系统或设计用于过度表达hsp70的细胞系的研究表明，该分子可以通过调节应激诱导的内在凋亡途径来抑制各种治疗后的细胞凋亡，该途径通过释放细胞色素介导线粒体的细胞死亡c（c）来自线粒体膜间隙。据报道，hsp70i在细胞色素水平上发挥作用c（c）释放和引发caspase激活，hsp70i的伴侣功能是这些作用所必需的(36). 此外，hsp70i可以通过与Apaf-1的caspase募集域直接关联和抑制凋亡小体形成而发挥抗凋亡功能(三,40). 细胞凋亡途径中另一个可以被hsp70i调节的点是c-Jun NH2-末端激酶（JNK）信号，在热休克、乙醇暴露以及通过细胞因子刺激或紫外线照射导致细胞凋亡之前(20,26). 有人提出hsp70i通过阻止JNK激活发挥作用，尽管这种干预的重要性还不太清楚(13). 在肿瘤坏死因子诱导凋亡的情况下，hsp70i可以从JNK激活下游的凋亡中拯救细胞。显然，hsp70i影响多种凋亡途径，细胞类型特异性差异可能是hsp70i干预的不同点。
解释的作用热休克蛋白70i应对环境和生理应激的基因需要直接在体内研究热休克蛋白70.1和热休克蛋白70.3在特定细胞和组织类型中表达，并检查其对应激反应的功能贡献。为此，我们培育出了缺乏热休克蛋白70i通过替换基因的整个编码序列热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.3具有一个体内β-半乳糖苷酶基因。这允许研究热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.3在体内发挥作用，能够在发育过程中以及在正常或应激条件下的成年小鼠中检测这些基因在转录和蛋白质水平上的组织和细胞特异性调节。在这里，我们报告了热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.3在正常和热应激条件下，该基因导致小鼠不同组织中hsp70i蛋白合成显著减少。这反映在获得性耐热性的维持不足和对热应激诱导的凋亡的敏感性增加。还提供了组织特异性组成表达和应激条件下hsp70i诱导表达的直接体内证据，表明存在不同的机制来控制生理和病理条件下hsp 70i的表达。
材料和方法
靶向载体的构建和缺乏热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.3基因。
的5′端和3′端热休克蛋白70.1和热休克蛋白70.3通过与人杂交，从129/SvJ小鼠基因组文库（lambda fixII载体；Stratagene，La Jolla，Calif.）中分离出用于构建靶向载体的基因片段热休克蛋白70.1cDNA探针(19). 限制性绘图、寡核苷酸杂交和测序证实，四个重叠噬菌体克隆包含两种小鼠热休克蛋白70.1和热休克蛋白70.3基因座，包括5′-和3′-侧翼序列的数千个碱基。目标向量构建基于lacZ公司-新-tk公司含有β-半乳糖苷酶的（pN-Z-tk2）模板质粒载体(lacZ公司)带有牛生长激素poly（A）信号的基因片段[lacZ公司-胸腺嘧啶激酶驱动的新霉素耐药基因poly（A）](tk公司)猴病毒40poly（A）信号启动子[tk公司/新聚物（A）]和侧翼tk公司基因盒。这个tk公司/新聚（A）片段两侧有Cre重组酶识别(loxP)通过将突变小鼠与表达cre公司基因。基本上，几乎是热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.3（密码子1至633）在框架中替换为lacZ公司-新使用近端4.5kb和远端4kb热休克蛋白70.1以及4.5和3.5 kb热休克蛋白70.3分别是。目标向量在唯一萨尔胚胎干细胞转染的I位点。用线性化靶向载体电穿孔ES细胞（D3；Incyte Genomics，St.Louis，Mo.），并选择对G418（200μg/ml）和2′-氟-2′-脱氧-1b的双重耐药-d日-阿拉伯-呋喃糖基-S-碘-乌拉西尔（FIAU）（更昔洛韦，2μM）遵循标准方案（Incyte Genomics）。用Southern印迹法筛选双抗克隆。通过带有侧翼基因组（靶向载体外部）的Southern印迹证实了正确的靶向性lacZ公司-新探针。简要地，巴姆HI消化的基因组DNA与外部探针杂交，产生6和9kb的条带热休克蛋白70.3野生型和靶向基因座。对于热休克蛋白70.1野生型和靶向基因座，杂交生态RI消化的基因组DNA和外部探针分别产生了12和9 kb的条带。将ES细胞克隆显微注射到C57BL/6囊胚中，获得了多个种系传递嵌合小鼠。通过使用外部探针进行Southern印迹或使用引物1进行PCR（退火至热休克蛋白70.3和热休克蛋白70.1编码区，5′AGATCACCACACACACAACACGACAAG），2（退火至新基因，5′CTTGGGTGGAGAGGCTATTC），3（与热休克蛋白70.3等位基因3′非翻译区、5′GTGCAATACAAAGTAACTGAAAGAC）和4（退火至热休克蛋白70.1基因3′非翻译区、5′GACAGTAATCGGTGCCACAAG）。用于检测野生型或目标热休克蛋白70.3等位基因、引物1、2和3组合使用，用于野生型或靶向型热休克蛋白70.1将等位基因、引物1、2和4组合使用。野生型和目标基因座的预期PCR产物分别是hsp70.3的0.6和1.1 kb片段和hsp70.1的0.5和1.0 kb片段。
组织学。
在胚胎第17天（E17）恢复的胚胎或从成年小鼠获得的组织嵌入OCT化合物中，snap冷冻在干冰2-甲基丁烷浴中，切片，风干，并固定在含有2 mM MgCl的磷酸盐缓冲盐水（pH 7.3）中0.2%戊二醛中2用苏木精或5-溴-4-氯-3-吲哚-β对每个组织标本的切片进行染色10分钟-d日-β-半乳糖苷酶活性的吡喃半乳糖甙（X-Gal）（Molecular Probes，尤金，俄勒冈州）。所有切片用曙红复染，并进行大体和显微镜病理分析。
全身热疗挑战。
野生型（+/+）、杂合型（+/-）或纯合型（−/−）热休克蛋白70.3或热休克蛋白70.1成年小鼠在42°C的循环水浴中半浸45分钟，然后在安乐死前恢复6至8小时。如上所述，准备组织进行组织学检查。未经处理的小鼠作为对照。
从hsp70.3或hsp70.1缺陷小鼠获得的CFU-GM的热反应和热耐受诱导动力学。
来自+/+、+/-或−/−的骨髓细胞热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.3对小鼠进行了耐热性测试(34). 骨髓细胞在43°C下加热20分钟，并在37°C下恢复期内指示的时间用更高的热量（44°C，40分钟）进行激发。随后将细胞电镀并在37°C的5%CO中培养2持续8天。显微镜下计数粒细胞、巨噬细胞或粒细胞和巨噬细胞混合物的集落。未经处理的CFU粒细胞/巨噬细胞（CFU-GM）的集落形成效率约为2/10三有核细胞。以不同浓度（1×10）培养细胞5至16×105每皿细胞数）取决于给定的处理。存活率的计算公式如下：存活率=[（严重热刺激后的菌落数/电镀细胞数）/（一次热处理后的菌群数/电镀的细胞数）]×100。
hsp70蛋白表达的Western blot分析。
对全细胞提取物（35μg总蛋白）进行十二烷基硫酸钠-10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转移至硝化纤维过滤器（Bio-Rad，Hercules，Calif.）。根据制造商的说明，使用增强化学发光（ECL）方法（ECL试剂盒；新泽西州皮斯卡塔韦市阿默沙姆）进行免疫检测。首先用对热诱导型hsp70（C92；Amersham）特异的单克隆抗体、对Hsc70和热诱导型hsp70反应的抗体（3A3；Affinity BioRegents Inc.，Golden，Colo.）或对β-半乳糖苷酶特异的抗体（Promega，Madison，Wis.）对膜进行探测，然后用合适的辣根过氧化物酶偶联二抗进行检测。ECL检测后，将膜剥离并用对肌动蛋白特异性的兔多克隆抗体（Sigma，St.Louis，Mo）和辣根过氧化物酶缀合的抗兔血清重新处理，并再次用ECL检测。用特异性兔多克隆抗体（Sigma）对肌动蛋白进行印迹，以确保每条泳道中存在等量的蛋白质。
热刺激后表达hsp70.1或hsp70.3缺陷的MEF的凋亡和存活。
从第14天的胚胎中制备小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），并在添加10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle's培养基中培养。为了诱导耐热性，用相对温和的热休克（43℃持续20分钟）对细胞进行预处理，并在37℃下恢复6或24小时，然后用致命的热休克进行激发（45℃持续30分钟）。在37°C下进一步恢复24小时后进行分析。通过用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（FITC）和碘化丙啶（细胞凋亡检测试剂盒；R&D Systems，Minneapolis，MN）染色来测量细胞活力和热激发后的细胞凋亡水平根据制造商的说明，并使用FACSCalibur细胞仪（Becton Dickinson）进行分析。
caspase活性和细胞色素的测定c（c）释放。
凋亡caspase活性通过免疫印迹总细胞裂解物（50μg蛋白质）和caspase 9特异性抗体（AAP；加拿大维多利亚州StressGen）或caspase底物之一聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）抗体（H-250；加利福尼亚州圣克鲁斯市圣克鲁斯生物技术公司）进行检测。用于检测细胞色素c（c）从线粒体中释放，我们遵循前面描述的程序(50). S-100馏分的制备如下。在对MEF进行热处理后，将细胞颗粒在冰镇磷酸盐缓冲盐水中清洗一次，并用5体积的缓冲液（20 mM HEPES-KOH[PH7.5]、10 mM KCl、1.5 mM MgCl）再次悬浮2、1mM EDTA钠、1mM EGTA钠、1 mM二硫苏糖醇和0.1 mM苯甲基磺酰氟），含250 mM蔗糖。细胞均化并在10000×克在4°C下保持15分钟。10000×克以100000×克在4°C下放置1小时，检测上清液（S-100组分）中等量的蛋白质（30μg）的细胞色素c（c）小鼠细胞色素特异性抗体免疫印迹法释放c（c）（加利福尼亚州圣地亚哥Pharmingen）。
结果
一代缺乏热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.三通过β-半乳糖苷酶靶向基因替换。
研究热休克蛋白70.1和热休克蛋白70.3在体内，我们设计了一种基因删除策略，包括替换几乎全部的基因热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.3使用编码序列lacZ公司-新暗盒（图。A和D）。五个对G418和FIAU耐药的D3胚胎细胞克隆，三个灭活的杂合克隆热休克蛋白70.3基因和两个克隆杂合热休克蛋白70.1基因，将被破坏的等位基因传递到生殖系。通过Southern blotting验证了正确的靶向性，其侧翼为靶向载体外的3′基因组，并且新的-lacZ公司探针（图。B和E），并通过PCR对小鼠进行常规基因分型（图。C和F）。所有使用纯合、杂合或野生型对照的实验均在F2来自F的C57BL/6-129/SvJ混合背景同窝伙伴1杂合杂交。为了避免tk公司-新标记基因对LacZ表达的影响热休克蛋白70.3或热休克蛋白70.1启动子，用表达cre公司去除新霉素选择标记的基因（由奥古斯塔乔治亚医学院分子医学和遗传学研究所Pandelakis Koni提供）。本报告中提出的实验是用靶基因座中含有选择标记的小鼠进行的。然而，对目标等位基因中移除新霉素基因的小鼠进行的分析证实了这些结果（数据未显示）。这个热休克蛋白70.1−/−或热休克蛋白70.3−/−小鼠存活，按预期孟德尔分布出生，有生育能力，在分析的不同组织中未检测到明显的形态学或显微镜异常。
靶向载体的构建热休克蛋白70.1和热休克蛋白70.三基因与小鼠的世代热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.三基因。的限制地图热休克蛋白70.三（A） 或热休克蛋白70.1（D） 基因，显示野生型等位基因（顶部）、靶向载体（中间）和同源重组后预测的靶向等位基因（底部）。的位置新-lacZ公司以及用于Southern印迹分析的TK盒和探针。载体的设计使每个载体的启动子热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.三基因驱动β-半乳糖苷酶的表达。Southern blotting检测正确基因靶向的探针是一个0.4 kb的3′片段(巴姆HI（高）-Hin公司dIII）对于热休克蛋白70.三基因座与1.2kb(巴姆HI（高）-巴姆HI）碎片热休克蛋白70.1基因位点。限制性内切酶指定如下：R，生态RI；B、，巴姆你好；A、，阿帕I；N、，不是I；H、，欣dIII；E、，生态中国国际广播电台。箭头指示的是热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.三等位基因。（B和D）来自野生型（+/+）、杂合型（+/-）或纯合型（−/-）的尾部DNA的Southern blotting分析热休克蛋白70.三小鼠（B）或热休克蛋白70.1突变小鼠（D）。更换热休克蛋白70.三基因由新-lacZ公司除了6-kb野生型片段外，盒式磁带还产生了一个9-kb片段，并替换了热休克蛋白70.1该基因产生12-和9-kb的片段。（C和F）基于PCR-的基因分型分析扩增0.6和1.1 kb的野生型和靶向片段热休克蛋白70.三基因座（C）和0.5和1.0 kb的片段热休克蛋白70.1基因座（F）。
组织特异性表达热休克蛋白70.三和热休克蛋白70.1在胚胎发育期间和成年小鼠的组织中。
在急性应激条件下（即热应激）hsp70i的显著诱导性导致了目前的共识，即严格控制的调控机制已经进化，以确保该蛋白在正确的时间和地点变得活跃，但在其他方面是沉默的。组织和细胞特异性hsp70i表达谱是理解体内hsp70i功能的一个关键方面，但尚未得到很好的定义，主要是因为缺乏足够的实验方法来监测体内hsp70 i的表达。
精确研究细胞和组织特异性热休克蛋白70i表达，我们已经观察到β-半乳糖苷酶在小鼠器官中的活性热休克蛋白70.1+/−和热休克蛋白70.3+/−忠实复制热休克蛋白70i等位基因转录活性。我们首先寻求获得自发的直接证据热休克蛋白70i在没有明确压力的情况下胚胎发育过程中的表达。从妊娠中期（E12.5）开始，鼻咽区域出现强烈染色，随后（E14）整个皮肤表面出现强烈染色。结构组织特异性的更清晰图像热休克蛋白70i如图所示，当器官发生基本完成时，在妊娠晚期（E17）胚胎中可以看到这种表达。。两种基因的表达模式重叠热休克蛋白70i在整个表皮、角膜（未显示）、口鼻粘膜（包括舌和唇）和胃肠道（食管和前胃上皮）上检测到高水平的基因。注意，在胃上皮上未观察到hsp70i的表达。在泌尿系统中，这两个基因都在肾小管和膀胱上皮中表达（图。). 在其他胚胎组织中未观察到显著表达（数据未显示），这表明hsp70i表达受到限制。对新生儿（出生后第1天或第2天）组织的组织学分析显示，自发基因表达的模式类似（数据未显示）。此外，如图。，观察到的模式热休克蛋白70i在成年（8-12周龄）小鼠的组织中表达没有改变，只有在大脑中发现了例外。此处，在成年小鼠大脑切片的海马体（齿状回、C1、C2和C3区域）中可见明显的hsp70i表达，而在胚胎或新生儿的脑组织中未见表达。
胚胎发育后期hsp70.3或hsp70-3的组织特异性组成性表达。热休克蛋白70.1+/−和热休克蛋白70.三+/−胚胎于E17取回，冷冻、切片、固定并用X-Gal染色。切片用曙红（粉红色）复染。箭头表示蓝色β-半乳糖苷酶表达。组织来自皮肤、鼻腔、舌头、食道、胃、前胃和肾脏。请注意热休克蛋白70i仅在前胃上皮中观察到表达（箭头所示），而在胃上皮中没有发现组成性表达。舌头、胃和前胃的放大倍数，×20。皮肤放大倍数，×200。所有其他组织的放大倍数，×50。
成年小鼠组织特异性组成性hsp70.1和hsp70.3的表达。野生型对照组的组织（C57BL/6-129/SvJ）F2,热休克蛋白70.1+/−，或热休克蛋白70.三+/−成年小鼠（8至12周龄）收获、冷冻、切片、固定并用X-Gal染色。切片用曙红（粉红色）复染。箭头表示蓝色的β-半乳糖苷酶活性。热休克蛋白70i皮肤、舌头、食道、前胃、海马、角膜、肾脏、肾小球和膀胱均有表达。海马体放大倍数，×30。食道和肾脏放大倍数，×70。皮肤、舌头和前胃放大倍数，×145。所有其他组织的放大倍数，×290。
与上述组织学研究结果和早期报告一致，在成年小鼠组织中，Western blotting检测到的基础（组成）hsp70i蛋白表达模式没有重大差异（图。). 然而，蛋白质水平的比较表明，与对照（+/+）动物相比，hsp70i的总量略有下降（+/-小鼠）或显著下降（−/-小鼠）。这表明完整的同源基因（即hsp70.3）在hsp70i蛋白的整体表达水平上缺乏hsp70-3或hsp70.1补偿热休克蛋白70.1−/−老鼠，反之亦然）。使用hsp70i抗体对组织切片进行间接免疫组化标记，进一步证实了这一观察结果（数据未显示）。因此热休克蛋白70i在胚胎和出生后小鼠的某些组织中，表明组织特异性调节机制在正常条件下控制hsp70i的表达。
组织特异性组成性hsp70i蛋白表达在热休克蛋白70.1-或热休克蛋白70.3-与野生型对照组相比，缺陷成年小鼠。通过从野生型（+/+）、杂合型（+/−）或纯合型（−/-）的脑、皮肤、食道、前胃和肾组织中提取的免疫印迹蛋白来评估hsp70i蛋白的水平热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.三老鼠。作为等蛋白负荷的对照，检测印迹中的肌动蛋白。
热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.三在缺乏结构性表达的组织中，热应激后基因活性迅速上调。
接下来，我们研究了热休克对成年小鼠组织中hsp70i表达的影响。热休克蛋白70.1+/−或热休克蛋白70.3+/−将小鼠暴露于轻度全身热应激（42°C持续45分钟），6小时后评估hsp70i的表达。与早期观察到的热休克后hsp70i蛋白水平升高一致，hsp70.1或hsp70.3在多个组织中的表达显著增加，尤其是那些缺乏基础hsp70i表达的组织。如图所示。hsp70i在肝脏、小肠、胰腺（尽管有趣的是，在朗格汉斯岛上未发现表达）和肾上腺皮质中显著高水平表达。在脾脏中，边缘区的少数辅助细胞和血管内皮细胞中发现hsp70i表达。在淋巴细胞中未观察到可检测的表达（数据未显示）。心脏中hsp70i的表达主要局限于心肌和心血管系统（冠状动脉血管）。在睾丸中，间质细胞（Leydig）有显著表达，但精母细胞缺乏热休克蛋白70表达式。
组织特异性热休克蛋白70.1和热休克蛋白70.三成年小鼠全身热疗后的诱导。热休克蛋白70.1+/−和热休克蛋白70.三+/−成年小鼠（8至12周龄）在42°C的循环水浴中半浸45分钟，然后在安乐死前恢复6小时。未经处理热休克蛋白70.1+/−小鼠作为对照组（左侧面板）。如图图例所示，制备组织并对其进行β-半乳糖苷酶活性染色。箭头表示蓝色β-半乳糖苷酶染色。在野生型小鼠的任何组织切片中均未检测到β-半乳糖苷酶活性（数据未显示）。热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.三肝脏、小肠、胰腺、肾上腺、脾脏、心脏和睾丸均有表达。肾上腺和心脏放大倍数，×70。所有其他组织的放大倍数，×145。
正如预期的那样，通过Western blotting测定的hsp70i蛋白水平在野生型对照动物热休克后显著增加。热休克蛋白70.1+/−或热休克蛋白70.3+/ −与野生型小鼠相比，小鼠的hsp70i蛋白水平略有降低（不到两倍）（数据未显示），而用热休克蛋白70.1−/−或热休克蛋白70.3−/−鼠标（图。). 由于在杂合小鼠中只检测到基础或诱导的hsp70i蛋白的水平略有降低（与野生型小鼠相比），因此不太可能使一个拷贝的hsp70蛋白失活热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.3在我们的分析中，等位基因改变了生理hsp70i的表达模式。
全身热疗后hsp70i蛋白表达诱导减少热休克蛋白70.1-和热休克蛋白70.三-缺陷成年小鼠。野生型（+/+）、杂合型（+/-）或纯合型（−/−）热休克蛋白70.1-或热休克蛋白70.三-将缺陷小鼠麻醉，进行热休克（42℃持续45分钟），并在安乐死前恢复6小时（指示42℃）。对照组为麻醉但未接触热休克的小鼠（显示为C）。用hsp70i（C92）特异性抗体免疫印迹法评估不同组织的蛋白提取物。数据显示，热诱导hsp70i蛋白在缺乏基础（组成）的部分小鼠组织（心脏、肝脏、胰腺和肠道）中的水平热休克蛋白70i表达式。
停用热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.三该基因导致骨髓细胞获得性耐热性维持不足。
应激反应中hsp70i的快速诱导被认为是细胞保护过程的基础。因此，亚致死热应激或高温预处理后hsp70i蛋白水平的增加会显著减弱所有热诱导的细胞变化，从而导致随后的严重热挑战（耐热性）。
确定个体是否失活热休克蛋白70i基因导致热敏感性，我们使用集落形成试验测定骨髓祖细胞（CFU-GM）的热反应，作为细胞存活的定量测量。对CFU-GM骨髓细胞在第二次热休克中存活的能力进行了测试，这与它们发展耐热性的能力相对应。所有细胞类型都用亚致死性热激发（43°C，20分钟）预处理，并在暴露于随后的致死性热激发（44°C，40分钟）之前恢复不同时间。无论基因型如何，未经修复的细胞在严重热应激下的存活率相似（约0.01%存活率）。然而，野生型细胞的热预处理产生了显著的耐热性，保护它们免受随后的热应激（图。A） ●●●●。杂合小鼠的细胞比野生型小鼠的细胞更容易受到热应激的影响。相反，来自纯合子的预处理细胞热休克蛋白70i−/−小鼠比野生型小鼠的细胞更容易受到热刺激（24小时时为10倍）。有趣的是热休克蛋白70.1与删除热休克蛋白70.3.容量热休克蛋白70i-骨髓细胞缺乏而产生耐热性与hsp70水平呈负相关。通过研究+/+、+/-或−/−小鼠骨髓热休克后β-半乳糖苷酶表达和hsp70蛋白合成的动力学可以反映这一点（图。B和C）。总的来说，骨髓细胞中β-半乳糖苷酶表达的动力学与野生型小鼠细胞中hsp70i蛋白合成的动力学密切相关。正常生理生长条件下未检测到β-半乳糖苷酶的表达；然而，来自杂合或纯合突变小鼠的骨髓细胞在热休克后β-半乳糖苷酶表达水平显著增加。与野生型小鼠的观察结果相反，热休克（43℃持续20分钟）显著增加了hsp70i蛋白水平，我们发现杂合突变小鼠中hsp70i的水平降低到野生型水平的～50%（根据C92抗体免疫印迹结果的密度计进行量化）。正如预期的那样，纯合子hsp70i蛋白水平进一步显著降低（五到八倍）热休克蛋白70.1-或热休克蛋白70.3-缺陷小鼠。请注意，hsp70蛋白的表达是用一种对应激诱导的hsp70i（指定为C92）特异的抗体或一种同时检测诱导型hsp70和组成性表达的Hsc70蛋白（指定为3A3）的抗体检测的。
骨髓细胞的耐热性诱导。（A） 骨髓祖细胞来自热休克蛋白70.3-或热休克蛋白70.1-缺陷小鼠表现出维持耐热性的能力下降。来自+/+（●）、+/-（▴）或−/−（▾）的骨髓细胞热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.三测试小鼠的耐热能力。在37°C下的恢复期内所示的时间，用更高的热量（44°C，40分钟）重新加热预处理过的细胞（43°C，20分钟）。随后对细胞进行培养，以形成粒细胞、巨噬细胞或粒细胞和巨噬细胞的混合物的集落，在37°C下培养8天后进行显微镜计数。数据表示材料和方法中描述的每个时间点的存活率。误差条表示三次重复平均值的标准误差。（B和C）骨髓细胞中热诱导hsp70i蛋白表达的动力学在热休克蛋白70.3-或热休克蛋白70.1-缺陷小鼠。骨髓细胞采集自热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.三+/+不处理、+/-或−/-小鼠，或在43°C下加热20分钟。然后将细胞在37°C下孵育1、2、4、6或24小时，然后用35μg总细胞蛋白进行收集和免疫印迹分析。使用的抗体显示在左侧。β-Gal是一种对β-半乳糖苷酶蛋白特异的小鼠单克隆抗体。C92识别热诱导型hsp70。3A3识别组成型和热诱导型hsp70。肌动蛋白的兔多克隆抗体被用作负荷指标。将从非热处理细胞中提取的蛋白质作为对照（显示为C）。请注意，在热休克蛋白70.1−/−骨髓细胞中仍有hsp70蛋白带。这代表hsp70.3蛋白；反之亦然热休克蛋白70.三−/−老鼠。
停用热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.三该基因导致MEF对热应激诱导的凋亡细胞死亡的敏感性增加。
有人认为hsp70i在获得性热耐受中的作用模式是防止凋亡死亡。hsp70i在这方面可能在细胞色素水平上发挥作用c（c）通过与Apaf-1的caspase募集域直接关联和抑制凋亡小体形成来释放和启动caspase激活。然而，该途径的生理重要性尚不明确。
为了进一步阐明hsp70i（hsp70.1与hsp70.3）在细胞抗热应激保护中的要求，特别是在耐热性方面，我们生成并研究了仅在是否存在热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.3.MEF缺乏的增长率热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.3与野生型MEF相似（数据未显示）。当我们使用膜联蛋白V-FITC测定耐热MEF人群的凋亡细胞死亡时，我们进行了更显著的观察。如图所示的数据。一个迹象表明，我们观察到耐热性发展显著下降，尽管在热休克蛋白70.1-比中的热休克蛋白70.3-与野生型细胞中的MEFs相比。此外，正如预测的那样，野生型MEF暴露于亚致死热休克导致hsp70i表达的显著诱导。然而，hsp70i水平在热休克蛋白70i-缺陷MEF（图。B） ●●●●。
两者的累积表达热休克蛋白70热休克后的基因对于最大程度的耐热性发育和维持至关重要。（A） 停用热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.3基因导致MEF获得性耐热性维持不足。为了诱导热耐受性，MEF用相对温和的热休克（43℃持续20分钟）进行预处理，并在37℃下恢复6或24小时，然后用致命热休克（45℃持续30分钟）进行激发。在37°C下进一步恢复24小时后，通过膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶染色以及荧光激活细胞分选仪进行分析。根据染色曲线（膜联蛋白和碘化丙啶双阴性）计算热处理细胞群的细胞存活百分比。填充条，控制MEF；散列条，热休克蛋白70.3−/−MEF；开放式酒吧，热休克蛋白70.1−/−MEF公司。（B） 暴露于热休克蛋白70.1-或热休克蛋白70.3-亚致死热休克的MEF缺乏导致hsp70i表达诱导显著降低。来自+/+、+/-或−/−的MEF热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.三对小鼠进行热处理（43°C持续20分钟），并在37°C下恢复指定时间后提取蛋白质。用hsp70i（C92）特异性抗体免疫印迹法检测hsp70i蛋白表达。将从非热处理细胞中提取的蛋白质作为对照（显示为C）。热休克蛋白70.三或热休克蛋白70.1通过β-半乳糖苷酶蛋白分析检测转录活性，并使用肌动蛋白作为负荷指标，如材料和方法所述。（C） 停用热休克蛋白70.1和热休克蛋白70.3基因通过激活内在凋亡途径增加MEF对细胞死亡的易感性。来自+/+或−/−的MEF热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.三用相对温和的热休克（43℃持续20分钟）对小鼠进行预处理，并让其在37℃下恢复6或24小时，然后用致命的热休克进行攻击（45℃持续30分钟）。在37°C下进一步恢复24小时后进行分析，细胞色素除外c（c）在6小时恢复期后进行分析。Procaspase 9，PARP，线粒体细胞色素c（c）通过免疫印迹法检测热处理细胞的释放和肌动蛋白（作为负荷控制）。将从非热处理细胞中提取的蛋白质作为对照（显示为C）。指定为45°C的通道代表从45°C加热30分钟的细胞中提取的蛋白质，无需预处理。
接下来，通过检测细胞色素来评估hsp70i通过抑制内在凋亡途径促进细胞存活的要求和程度c（c）/野生型和热休克蛋白70.1-或热休克蛋白70.3-MEF不足。注意，热诱导的凋亡可以通过caspase 9的激活和caspase 3底物PARP的裂解来表现。蛋白质免疫印迹分析证实，当预处理于热（43°C，20分钟）的MEFs暴露于严重的热休克（45°C，30分钟）时，胱天蛋白酶9从酶原（46 kDa）加工成其活性形式（37和35 kDa）（图。C） ●●●●。然而，在耐热诱导条件下，procaspase 9的加工在热休克蛋白70.1-不足的，或程度较轻的热休克蛋白70.3-与野生型MEF相比，MEF不足（图。C） ●●●●。PARP处理也观察到类似的结果。我们的额外观察显示线粒体细胞色素增加c（c）免疫印迹分析检测到的释放热休克蛋白70.1-或热休克蛋白70.3-与野生型MEF相比，MEF不足。在从相对轻微的热休克中恢复6小时后，暴露于严重热刺激下的细胞最为明显（图。C） ●●●●。因此热休克蛋白70.1-或热休克蛋白70.3-MEF对热的缺乏反映了细胞色素的增加c（c）线粒体释放（与线粒体膜通透性增加相关）和caspase激活。
总之，这些观察结果表明热休克蛋白70i热休克后的基因对于最大程度的耐热性发育和维持至关重要，缺乏任一基因都会降低细胞维持耐受状态的能力。因此热休克蛋白70.3和热休克蛋白70.1基因并不代表简单的冗余，但这些基因的表达是相加的，需要在应激后充分保护骨髓祖细胞或MEF以及可能的其他组织。
讨论
虽然hsp70i作为分子伴侣的功能和物理特征在体外已经得到了很好的研究，但其确切的生理作用以及决定该伴侣分子在体内的细胞和组织特异性表达的调控网络尚不清楚。目前的模式是，严格控制的监管机制已经演变为确保热休克蛋白70i在急性应激条件下（即热应激），在适当的时间和地点变得活跃，但在其他方面则保持沉默。然而，胚胎发育和出生后生长期间自发hsp70i蛋白表达的证据对这一观点提出了挑战(25,31,43). 另一个重要问题涉及两个方面的功能需求热休克蛋白70.1和热休克蛋白70.3编码相同蛋白质的基因，不仅在不利（病理）生理条件下保护宿主免受蛋白质毒性损伤，而且在正常发育条件下和成人中也有保护作用。在这里描述的研究中，基因靶向用于产生编码hsp70i基因的零突变小鼠，并将β-半乳糖苷酶基因插入热休克蛋白70.3或热休克蛋白70.1轨迹。用这些动物模型进行的分析提供了直接证据热休克蛋白70i不仅在应激刺激下上调表达，而且在正常条件下，该蛋白的组织限制性组成表达也存在转录程序。观察到的组织特异性表达模式热休克蛋白70.3和热休克蛋白70.1基因几乎无法区分，这表明这两个基因在转录水平上的调控模式相似。While期间热休克蛋白70.3-或热休克蛋白70.1-缺陷小鼠存活且可繁殖，没有明显的表型异常热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.3在正常和热应激条件下，该基因导致小鼠不同组织中hsp70i蛋白合成显著减少。这反映在对热应激诱导的细胞凋亡的敏感性增加。有趣的是热休克蛋白70尽管存在非破坏性等位基因，但等位基因似乎降低了整体hsp70蛋白水平。这种现象在热应力后尤其显著（图。，肝脏）。虽然我们目前对这一观察没有任何解释，但有可能是热休克蛋白70基因可能在蛋白质水平上影响其他hsp70的积累，可能是通过伴侣正确的蛋白质折叠来实现的。显然，这值得进一步研究，这些研究正在我们的实验室中进行。总的来说，这些发现表明胚胎发育中的单个基因存在冗余，但这两个基因都需要对热休克等应激作出最佳反应。
了解决定应激诱导与持续表达热休克蛋白70i在正常条件下，在胚胎发育过程中以及在成人中仅限于某些组织。hsp70的显著诱导黑腹果蝇可以通过广泛的监管策略来实现，包括热休克蛋白70基因组中的基因(21)，即使在正常温度下，这些基因上也保持开放的染色质结构(47)RNA聚合酶被截留在转录起始位点(39)，以及在温度变化的1分钟内预先存在的转录因子（HSF）的活化和核转运(46). 已经提出了这些精细的调节机制，不仅是为了确保热休克时hsp70的快速诱导，而且是为了在常温和没有可检测的应激的情况下维持hsp70表达的基础水平。哺乳动物中快速应激诱导或组成性hsp70i表达的机制可能类似。然而，这方面缺乏直接证据。值得注意的是，本研究中通过β-半乳糖苷酶活性染色检测到的小鼠hsp70i的组成和诱导表达模式忠实地揭示了内源性热休克蛋白70i基因。然而，通过该方法获得的数据与文献中的现有数据有显著差异(8,24,25,44). 这是因为以前在这方面进行的许多研究都依赖于研究热休克蛋白70i利用hsp70启动子序列调控转基因的表达(lacZ公司或荧光素酶）表达，可能不会严格再现其正常分布的条件。组织受限或基因表达不良在转基因小鼠中并不罕见，这可能是由于转基因的染色体整合位点和/或无法在表达载体中包含建立其天然表观遗传组织所需的所有序列所致。事实上热休克蛋白70i启动子（从转录开始上游约0.5至0.7kb的序列）主要限制报告基因在某些组织中的表达，并限制应激诱导条件，这导致我们预测，构成性表达热休克蛋白70i它们位于热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.3基因。
转录激活热休克蛋白70i主要依赖于预先合成的HSF的激活，HSF随后获得结合四聚体热休克元件的能力，这些元件存在于细胞的近端启动子序列中热休克蛋白70.1和热休克蛋白70.3基因。除了在对有害刺激的反应中发挥关键作用外，HSF还被广泛认为在胚胎发生和出生后生长期间自发hsp70i表达中发挥作用。然而，只有间接和间接的证据可以证明这一点，这些数据仍然可以接受上述详细的批评。就组织特异性hsp70i对应激反应的调节而言，HSF1作为热应激后hsp70i蛋白合成的关键因子的作用是很好的(35,49). 在这方面，利用遗传育种方法进行分析热休克蛋白70.1+/ −HSF1缺陷遗传背景下的β-半乳糖苷酶小鼠表明，热诱导小鼠组织中hsp70i的表达完全由HSF1控制，但未观察到组成性hsp70i表达的显著变化，这表明HSF1不需要用于hsp70l的组织特异性表达（未公布的数据）。虽然这些结果表明HSF1对于热应激诱导hsp70i表达是不可或缺的，并且明显不能由其他转录因子（例如结构相关的HSF2）进行功能补偿，但这些因子在组成性hsp70i表达中的具体功能仍未解决。HSF2在诱导或组成性hsp70i表达的组织中普遍表达(11,38)，该因子不太可能是构成性hsp70i表达的关键因素。除了双重重叠的热休克元件基序外，这两个基序的高度保守的启动子（约300 bp）热休克蛋白70.1和热休克蛋白70.3包含一系列监管元素，包括至少两个Sp1框。因此，有人提出胚胎中hsp70的自发表达是通过Sp1转录活性调节的(5). 然而，很难解释组织特异性调节热休克蛋白70i仅基于Sp1等普遍存在的转录因子表达。因此，在缺乏可测量的应激反应及其在特定组织中的基本稳态功能的情况下，目前对hsp70i组织特异性组成表达的调节了解相对较少。显然，转录因子（大多未知）和反式或顺式监管要素热休克蛋白70i该位点使得很难分析它们对hsp70i表达的特定模式的贡献。然而，作为赋予组织特异性的机制，转录因子之间的合作（组合调控）可能有助于解释热休克蛋白70i我们研究中的表达模式。因此，普遍存在的转录因子的组合（例如，许多细胞类型产生Sp1、AP1或AP2，并且这些因子的假定结合位点存在于热休克蛋白70i启动子区）可能与细胞类型特异性因子结合，以组织特异性的方式调节组成性hsp70i表达。最后，持续表达hsp70可以抑制细胞生长，并且在果蝇属细胞可以导致生长减少而不影响生存能力(9)但在其他实验环境中，已经证明与分化和细胞增殖有关(22,45). 很明显，hsp70的这些相反的功能特征取决于hsp70i在特定细胞或组织中的表达水平；例如，在癌细胞中强制表达hsp70可以促进致癌转化。组织特异性组成性hsp70i表达是否也具有生长抑制或促进作用尚不容易评估，但这种影响可能取决于其他几个因素，例如细胞周期调节器。使用本报告中描述的模型对这种相互作用进行进一步研究，可能会证明在阐明hsp70i表达的这些相反方面有价值。显然，本研究中hsp70i表达的特征性组织特异性发育调控模式表明该分子参与细胞的分化和/或增殖，可能在组织特异性细胞成分的发育和维持中起到确保蛋白质保真度的作用。
对hsp70伴侣功能的需求增加发生在细胞生命的许多阶段，并决定细胞面临死亡的结果。众所周知，包括热休克在内的应激状态可能通过三种不同的方式导致细胞死亡：生殖（克隆）细胞死亡、凋亡和坏死。虽然人们对应激诱导坏死或生殖死亡的机制知之甚少，但在细胞凋亡中，最初的损伤并不直接杀死细胞，而是启动导致细胞自杀的特定信号通路。应激反应中hsp70i的快速诱导被认为是细胞保护过程的基础。在这方面，有令人信服的证据表明，通过诱导hsp（尤其是hsp70i）的轻度热休克激发的细胞对应激的抵抗可能是由于启动凋亡的信号事件的下调。MEF对热应力的敏感性增加热休克蛋白70.3或热休克蛋白70.1本研究中报道的基因可以通过hsp70i在应激诱导的内在凋亡途径中的调节作用至少部分解释。然而，热休克也可以诱导一种非caspase依赖型细胞死亡，这与经典的凋亡不同，并被认为与JNK蛋白激酶活性有关(13,32,36). 热诱导JNK活性的证据，在缺乏热休克蛋白70.1或热休克蛋白70.3基因与野生型的对比支持这一假设（数据未显示）。hsp70i和热休克活化激酶可能参与MEF的半胱天冬酶非依赖性细胞死亡。对上述途径在细胞对有害应激刺激的细胞凋亡保护中的生理重要性进行明确评估，将为hsp70i在体内不同病理状态中的作用提供新的见解。在一起热休克蛋白70i基因产物可能影响多种凋亡途径，细胞类型特异性差异可能是hsp70i干预不同组织的不同点。可用性热休克蛋白70.1-和热休克蛋白70.3-缺陷小鼠提供了一个机会，不仅可以探索hsp70i的抗凋亡功能在多大程度上需要保护各种组织和细胞免受应激损伤，还可以使我们研究hsp70i抗凋亡功能的分子基础。此外，确定和表征决定组织特异性组成和诱导表达的调控元件热休克蛋白70.1和热休克蛋白70.3在环境应激条件下，hsp在宿主组织特异性功能的发育和维持中的作用应提供有价值的见解。最后，这些动物模型的使用将允许检查hsp70i活性是否可以由hsp家族的其他成员补偿，或者hsp70i在细胞保护免受环境压力方面是否具有独特的功能。因此，这些突变小鼠提供了一个有价值的实验模型，以更好地了解hsp70i分子伴侣参与环境应激反应的基本细胞过程，并确定其在人类临床相关病理学中的作用。
