|
| 状态 |
2022年4月28日公开 |
| 标题 |
MS_网格_rep2_DNA |
| 样品类型 |
SRA公司 |
| |
|
| 源名称 |
最长肌
|
| 有机体 |
苏斯克罗法 |
| 特点 |
品种：中国地方猪品种
|
| 提取的分子 |
基因组DNA |
| 提取协议 |
骨骼肌取自2周龄LW和MS仔猪。
按照Li等人的描述进行GRID-seq。用2mM DSG溶液在室温下将约2.5×106个细胞交联45分钟，然后在1%甲醛中进一步固定10分钟。固定细胞在1ml平衡缓冲液（0.2%NP-40，5mM Tris-HCl pH 7.5，10）中渗透mM NaCl和1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒），在冰上短暂离心15分钟）。为了制备细胞核，将固定细胞置于300μL Cutsmart缓冲液（0.5%SDS）中，在62°C下培养10分钟。然后，添加50ul 10%Triton X-100以冷却SDS，并在冰上冷却。为了消化染色质，通过简单离心收集细胞核，用1×Cutsmat缓冲液洗涤两次，再悬浮在500μl AluI溶液中（1×Custsmart缓冲液、1%Triton X-100、1 U/μl RiboLock、0.5 U/μl Alu I（NEB）和1×蛋白酶抑制剂），并在37°C下孵育4 h。消化后，向DNA末端添加dA拖尾模块，然后在37°C下使用PNK（NEB）进行DNA/RNA 5'磷酸化和3'去磷酸化修复1.5小时。为了将原位连接物连接到RNA，使用4U/ul T4 RNA连接酶2-截断KQ（NEB）将RNA末端连接到包含5'-腺苷酸化ssDNA悬液的寡核苷酸“桥”分子，并在25°C下培养3小时。为了将原位链接物连接到DNA，收集细胞核，用800μL的1×DNA连接酶缓冲液（NEB为了去除游离连接物，将其重新悬浮在1 ml DNA连接溶液（0.2 U/μL RiboLock、1×DNA连接酶缓冲液、1 mg/ml BSA、1%Triton X-100和1 U/μL T4 DNA连接酶（NEB））中，并在16°C下培养过夜。接下来，清洗颗粒，通过Bst 3.0聚合酶延长桥，通过RNA的第一链合成来稳定RNA链。反向交联和纯化DNA/RNA。将颗粒重新悬浮在300 ul蛋白酶K溶液中（15 mM EDTA、10 mM Tris-HCl、pH 7.5、0.5%SDS和1 mg/ml蛋白酶K（Ambion）），并在65˚C下在热混合器中培养至少2小时。将300μL苯酚：氯仿：异戊醇（pH 8.0）添加到每个试管中后，用2μL糖蓝、30μL 3 M NaOAc（pH 5.5）和300μL 100%异丙醇在冰上沉淀总DNA/RNA至少2小时，然后在16000g下离心30分钟。总DNA/RNA溶解在51μL H2O中（预计总DNA/RNA约为10ug）。下拉生物素DNA/RNA。将50ul DNA/RNA添加到M280链霉亲和素磁珠中，磁珠用1×B&W缓冲液（5 mM Tris-Cl pH 7.5，0.02%吐温-20，0.5 mM EDTA，1 M NaCl）洗涤三次。在室温下孵育45min后，用500 ul 1×B&W缓冲液洗涤珠子5次，并在室温下重悬于100μL新制备的150mM NaOH中10分钟。接下来，将上清液转移到1.5 mL试管中，并用11μL 10×TE缓冲液和6.5μL 1.25M乙酸中和。用2μL糖蓝、10μL 3 M NaOAc（pH 5.5）和100μL 100%异丙醇沉淀单链DNA（ssDNA）。在第二链合成中，通过添加0.5μL 10mM dNTP和5 U klenow Exo-。在MmeI消化后，提取并纯化DNA，切割84bp的靶带并用于Illumina TrueSeq文库构建。
|
| |
|
| 图书馆战略 |
其他 |
| 库源 |
基因组学 |
| 库选择 |
其他 |
| 仪器型号 |
Illumina HiSeq 2500公司 |
| |
|
| 描述 |
网格序列
|
| 数据处理 |
用trim_galore（版本：0.4.5_dev）对每个库的读取进行裁剪，并保持最小长度为79 bp
为了准确获取读取数据，并尽量减少由于测序和/或PCR中引入的错误而导致的不包含精确完整连接子序列的读取数据丢失，我们执行了分层策略：1）我们保留包含连接子核心12 bp种子序列的读取，而不是使用完整连接子进行下游处理，2）MmeI基序用于定义连接子边界，3）连接子定向用于指示读取是来自RNA还是基因组DNA。通过这种策略，获得了17 bp至23 bp的配对DNA-RNA读数。对于每个捕获的RNA读取（cDNA），我们使用其反向补体作为正式读取，因此，该读取精确定位了RNA产物序列的相同序列。所有配对读取都分配了唯一的配对ID。Github上提供了处理原始读取的代码：https://github.com/ezioljj/scripts_for_GRID-seq
使用Bowtie2（版本：2.2.5），使用参数“–local”，将所有干净读取的伴侣与小鼠基因组（mm10）参考分别对齐。SAMtools（版本：1.9）使用参数“-Sbq 2”过滤出包含模糊映射的DNA或RNA读取的读取对。
MACS2（版本：2.1.2）使用宽峰检测模型检测富含GRID-seq RNA读取的基因组区域。
通过标准的GRID-seq流水线描述和执行了染色质富集RNA的识别、非特异性背景的构建以及特异性RNA-染色质相互作用的识别。
装配：Sscrofa11.1
补充文件格式和内容：自定义（染色质相关RNA及其具有标准化相互作用的结合位点）
库策略：GRID-seq
|
| |
|
| 提交日期 |
2022年4月28日 |
| 上次更新日期 |
2022年4月29日 |
| 联系人姓名 |
赵树红 |
| 电子邮件 |
shzhao@mail.hzau.edu.cn
|
| 组织名称 |
华中农业大学
|
| 街道地址 |
洪山区狮子山街1号
|
| 西蒂 |
武汉 |
| 邮政编码 |
430070 |
| 国家 |
中国 |
| |
|
| 平台ID |
9176英镑 |
| 系列（1） |
|
| 关系 |
| 生物样品 |
SAMN27928827标准 |
| SRA公司 |
SRX15039058型 |
