miR-214依赖性PHLPP2水平升高介导甲基乙二醛对小鼠主动脉内皮细胞胰岛素刺激的Akt激活的损害

摘要

已有证据表明，微RNA（miRNAs）与糖尿病并发症之间存在关联，这是通过调节参与血管功能障碍病理生理学的分子通路，包括胰岛素-信号转导途径实现的。甲基乙二醛（MGO）在糖尿病中积聚，并与心血管并发症相关。本研究旨在分析miRNAs在MGO诱导的小鼠主动脉内皮细胞（MAEC）胰岛素反应性损伤中的作用。miRNA调节是通过转染特定的miRNA模拟物和抑制剂在MAEC中进行的，无论是否用MGO处理。Western blot检测miRNA-靶蛋白水平。通过荧光素酶分析和使用PHLPP2-3′UTR上miR-214特异的靶保护物来测试miR-214PH域富含亮氨酸重复蛋白磷酸酶2（PHLPP2）的调节。这项研究表明，MGO处理的MAEC中PHLPP2增加了4倍。PHLPP2水平与miR-214调制呈负相关。此外，miR-214过表达能够降低MGO治疗的MAEC中的PHLPP2水平。有趣的是，PHLPP2的直接调节被证明依赖于miR-214。最后，miR-214的抑制会损害胰岛素依赖性Akt的激活，而其过度表达则可以缓解MGO治疗的MAEC中胰岛素对Akt激活的影响。总之，本研究表明PHLPP2是MAEC中miR-214的靶点，并确定miR-215下调是MGO诱导内皮细胞胰岛素抵抗的一个促成因素。

1.简介

2型糖尿病（T2DM）是一种慢性代谢性疾病，以β细胞功能和胰岛素敏感性缺陷为特征，导致血糖水平升高[1]. 糖尿病引起的内皮功能障碍是糖尿病血管并发症发生的关键和始动因素。T2DM内皮功能障碍的几种机制已被确定，包括胰岛素信号的改变[2]. 胰岛素对内皮细胞具有特异性，其最重要的作用之一是一氧化氮（NO）的合成，它依赖于IR/IRS1/PI3K/Akt通路和1177号血清eNOS磷酸化激活[三,4]. 胰岛素诱导的NO生成可增强平滑肌血管舒张和血流，在胰岛素抵抗状态下会受到损害[5]. 鉴于胰岛素在内皮细胞中的促血管作用，内皮胰岛素抵抗导致内皮依赖性血管舒张功能受损，这是糖尿病患者内皮功能障碍的常见特征，也是并发症的重要原因，也是T2DM相关高死亡率的原因[6]. 因此，迫切需要更好地了解内皮细胞胰岛素抵抗的潜在机制，以便为这些慢性病制定新的和改进的治疗策略。

除了遗传学之外，环境和表观遗传修饰也是T2DM及其相关并发症发病的主要因素。最近的研究确实证明了miRNA表达改变与血管功能障碍之间的明确联系，表明某些miRNA与心脏、肾脏、外周神经和视网膜糖尿病相关损伤的发展有关[6]. 微RNA（MicroRNAs）是一类含有20–22个核苷酸的非编码单链RNA分子。它们普遍表达，并通过影响转录后基因表达来调节几个关键的生物途径和细胞功能[7]. miRNAs已成为新陈代谢的关键表观遗传调节因子，其失调会导致代谢性疾病，包括T2DM[8]. Zampetaki等人[9]在一项针对T2DM患者的前瞻性研究中，分析了800名患者血浆中的miRNA，并基于10个miRNA建立了糖尿病特征。有趣的是，在T2DM发病前几年，其中6种miRNAs的表达减少，与亚临床外周动脉疾病相关，表明它们被用作糖尿病并发症风险患者的标记物。miRNAs也是胰岛素抵抗发展的一个促成因素，胰岛素抵抗在葡萄糖稳态和内皮功能中起着重要作用。miRNAs被描述为通过翻译抑制胰岛素分泌介质来影响胰岛素信号转导[10,11,12,13]或通过调节其调节剂，如小窝蛋白1，这对胰岛素受体调节至关重要[14]或在Ser473对Akt进行去磷酸化的磷酸酶PHLPP2[15].

甲基乙二醛（MGO）是晚期糖化终产物（AGEs）的主要前体，AGEs是代谢记忆的最重要机制，是糖尿病慢性并发症的病理生理学基础[16]. MGO主要作为糖酵解的副产物，通过降解少量（1%）磷酸三糖而生成。糖尿病患者的MGO水平增加了5倍。与高血糖水平无关，MGO介导蛋白质的细胞内糖基化，并与血管功能障碍相关[17]. 最近，一些miRNAs被发现在糖尿病微血管和大血管并发症的背景下干扰和调节细胞内AGE信号[16]. 此外，MGO还通过miRNA调节成为基因表达的调节剂[18,19].

我们之前已经证明，高MGO水平会导致内皮细胞胰岛素抵抗，Akt依赖性通路受损，胰岛素会释放NO[20]. 这种效应至少部分由小鼠主动脉内皮细胞（MAEC）中Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因（KRAS）水平的miR-190a下调依赖性增加介导。通过我们之前的研究，我们还发现其他三种miRNAs的表达与糖尿病有关：在接触MGO的MAEC中，miR-214、miR-450a和miR-126分别减少32%、22%和30%[21]. 本研究的目的是分析这些miRNAs在MGO诱导的MAEC胰岛素反应性中的作用。

2.结果

为了评估miRNAs对胰岛素信号转导的可能贡献，发现暴露于MGO的MAEC中发生改变[18]，考虑了可用算法的组合，并使用mirWalk数据库查阅了推测miRNA结合位点预测的综合图谱。这项研究已将参与胰岛素信号转导的候选基因确定为miR-214和miR-126的潜在靶点。其中，磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）、蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）、PH域富含亮氨酸重复蛋白磷酸酶1和2（PHLPP1和PHLPP2）在胰岛素信号的下调中起着重要作用。如所示图1500μmol/L MGO处理MAEC对PTEN蛋白水平无影响(图1a） ，PTP1B(图1b） 和PHLPP1(图1c） ●●●●。相反，与未经处理的对照细胞相比，经MGO处理的MAEC中PHLPP2的蛋白水平增加了4倍(图1d） ●●●●。

有趣的是，转染miR-214的特异反义抑制剂（miR-214inhibitor）可诱导MAEC中PHLPP2蛋白水平的剂量依赖性增加(图2a） ●●●●。然而，转染miR-126特异反义抑制剂（miR-126-抑制剂）的MAEC和转染非靶向反义抑制剂的MAEC之间没有差异(图2b） ●●●●。根据之前的结果，通过最高浓度（50 nmol/L）的RNA寡核苷酸转染特异性模拟miR-214（miR-214-模拟物），在过度表达miR-214MAEC中观察到PHLPP2水平显著降低。相比之下，与非靶向对照寡核苷酸（对照模拟物）转染的细胞相比，转染miR-126特异性RNA寡核苷酸的MAEC没有效果(图2c） ●●●●。综上所述，这些结果表明miR-214而不是miR-126能够调节PHLPP2的蛋白水平。

在转染miR-214抑制剂的MAEC中，PHLPP2水平增加了约4倍，并且与MGO处理的对照细胞和miR-214inhibitor加上MGO共同处理的细胞中观察到的水平相当(图3a） ●●●●。此外，在存在MGO的情况下，用miR-214模拟物转染MAEC可逆转MGO的作用，导致PHLPP2减少2.5倍(图3b） ●●●●。因此，这些结果表明miR-214介导MGO对PHLPP2表达的影响。

为了证明miR-214对PHLPP2表达的直接调节，使用了一种miScript靶向保护剂（TP），该保护剂针对小鼠PHLPP23′非翻译区（UTR）上miR-215的结合位点。在转染miScript靶向保护剂（TP）和miR-214模拟物的MAEC中，不再观察到由miR-215模拟物诱导的PHLPP2蛋白水平的降低(图4a） ●●●●。此外，PHLPP2的miR-214依赖性调节通过荧光素酶报告基因测定得到了证实，该测定使用PHLPP2-3′UTR直接克隆在萤火虫荧光素酶下游的构建体在MAEC中进行。miR-214模拟物的转染可诱导PHLPP2-3′UTR驱动的荧光素酶活性降低25%，而miR-214-模拟物对空对照载体转染细胞中的荧光素酶活性无影响(图4b） ，证明miR-214结合PHLPP2-3′UTR区域。

最后，为了证明miR-214在内皮细胞MGO介导的胰岛素抵抗中的作用，我们分析了miR-214inhibitor和miR-214-模拟物对Akt胰岛素依赖性磷酸化的影响。如所示图5与未接触MGO的相同细胞相比，转染对照抑制剂的MAEC中的MGO处理可降低胰岛素诱导的Akt磷酸化。同样，与转染对照抑制剂的MAEC相比，转染miR-214抑制剂的MAECs显著降低胰岛素刺激的Akt磷酸化(图5a） ●●●●。不同的是，miR-214模拟物的转染可以防止MGO对胰岛素依赖性Akt磷酸化的有害影响(图5b） ●●●●。

最后，在体内验证了非糖尿病小鼠模型（Glo1KD小鼠）主动脉组织中miR-214的下调作用，该模型敲除了乙醛酸酶1，说明其具有高水平的MGO修饰蛋白[22,23].图6显示与野生型（WT）小鼠相比，Glo1KD小鼠主动脉组织中miR-214的表达减少了45%。

3.讨论

越来越多的证据表明，内皮功能障碍是T2DM的直接后果，也是T2DM的常见特征。为了更好地了解血管损伤是如何发展的，特别是在T2DM患者中，已经对内皮在健康和疾病中的功能进行了研究，并提出了几种与炎症和胰岛素抵抗有关的机制[24,25,26]. 事实上，阐明糖尿病相关内皮功能障碍的机制非常重要，并将对未来的转化和干预研究产生重大的临床影响。

近年来，一些miRNAs已成为内皮功能的关键调节因子，其在糖尿病诱导的内皮功能障碍中的改变已被证实，这些改变导致炎症、胰岛素抵抗、高血糖、血管生成和内皮衰老，这些是内皮功能障碍的主要机制[27,28]. 因此，使失调miRNAs的表达正常化可能是控制内皮功能障碍发展和/或进展的一种治疗方法。

甲基乙二醛（MGO）在糖尿病条件下积聚在细胞中，并导致胰岛素抵抗[17,20]. 我们和其他人最近证实，MGO影响内皮细胞中miRNA的表达[21,29]. 实际上，在我们之前的工作中，我们进行了一个miRNA阵列，通过该阵列我们评估了文献中已经报道过的84个与糖尿病相关的miRNA的表达谱。我们证实，在这84个miRNAs中，有4个在MGO处理的MAEC中显著改变：miR-126、miR-190a、miR-214和miR-450a[21].

工作假设是，这些被MGO改变的miRNAs可能激活其他机制，从而以不同方式导致MGO导致的内皮胰岛素敏感性受损。我们已经证明miR-190a通过KRAS对内皮胰岛素敏感性产生负面影响[21]. 对于本研究，miR-214和miR-126似乎都是有吸引力的候选药物，因为它们控制内皮细胞功能和血管生成[30,31,32,33,34,35]. 虽然关于miR-450a的研究很少，以支持其作为进一步研究其在MGO治疗的MAEC中潜在作用的候选药物，但已经证明miR-126能够下调IRS-1，抑制Akt活化[36,37]. 此外，据报道，miR-214通过靶向PTEN在包括卵巢癌和胃癌细胞在内的多种细胞类型中的表达来激活PI3K/Akt信号[38,39,40,41,42,43]. 研究还表明，miR-214靶向C2C12成肌细胞中的IRS和Akt[44].

关于寻找MGO治疗的MAEC中改变的miRNAs的新靶点，根据我们之前的研究，我们排除了胰岛素信号通路的关键成分。事实上，我们之前检测了IRS-1、Akt和eNOS的蛋白水平，它们是上述miRNAs的潜在靶点，但这些介质没有变化[20,21]. 因此，我们将重点转向胰岛素信号的负调控，因为MGO下调miRNAs导致其上调将为MGO治疗的MAEC中观察到的胰岛素反应性降低提供合理解释。

通过使用公共生物信息学工具的综合方法，我们确定了一些磷酸酶作为miR-214和miR-126的潜在靶点。因此，我们测试了MGO对以下蛋白质水平的影响：PTP1B，它结合胰岛素受体并随后去磷酸化[45]; 脂质磷酸酶PTEN，使PIP3去磷酸化并拮抗PI3K信号[46]; 以及丝氨酸磷酸酶PHLPP1和PHLPP2，它们在丝氨酸473残基上对Akt进行特异性去磷酸化并使其失活[47,48,49]. 在用MGO治疗后，我们观察到MAEC中PTP1B和PHLPP1的蛋白水平没有变化。令人惊讶的是，尽管PTEN是miR-214的广泛验证目标[38,39,40,41,42,43]MAEC中的MGO未改变其水平。在我们的细胞模型中，miR-214缺乏PTEN调节的一种可能解释是，根据microRNA.org的预测，小鼠PTEN的3′UTR中miR-214的结合位点与其他几种miRNA的结合位点重叠，提示在MAEC中高度表达的其他miRNAs可能以相互排斥的方式调节PTEN，并且独立于MGO治疗后miR-214水平的任何变化。

在我们的研究中，MAEC中的PHLPP2因MGO治疗而增加。PHLPP2是miR-214和miR-126的高置信预测靶点，基于我们使用10个不同的miRNA靶点预测程序检索PHLPP2和这些特定miRNA之间任何相互作用的信息的搜索。我们分别从8个和7个miR-214和miR-126项目中获得了阳性信息。有趣的是，MAEC内源性miR-214的抑制足以导致PHLPP2蛋白水平的显著增加，与MGO治疗后的水平相当；此外，当miR-214过度表达时，磷酸酶水平显著降低。相反，通过调节MAEC中miR-126的水平，未观察到PHLPP2蛋白水平的变化。综上所述，这些结果表明PHLPP2与miR-214之间存在负相关，但与miR-126之间没有负相关，仅支持对miR-214s的生物信息学靶点预测。此外，首次使用小鼠PHLPP2的3′UTR中miR-214结合位点的靶位保护物和用萤火虫荧光素酶基因下游克隆的小鼠PHLPP1的3’UTR进行的报告基因分析，验证了miR-215对PHLPP2.表达的直接调控作用。

为了加强miR-214在MGO对MAEC中PHLPP2水平的影响中的作用，这种miRNA在MGO的存在下被抑制和过度表达。虽然在前一种情况下没有观察到进一步的增加，因此排除了miR-214和MGO导致的两种不同机制，但在后一种情况中，当特异性绕过miR-214MGO依赖性下调时，PHLPP2表达会发生逆转。

考虑到PHLPP2是miR-214的直接靶点，我们随后验证了MGO对MAEC中胰岛素信号通路的负面影响是否可能通过miR-215下调介导。为此，我们评估了在MAEC中miR-214的特异性抑制后，丝氨酸473上的Akt磷酸化水平。正如PHLPP2水平增加所预期的那样，在这些条件下可以观察到Akt磷酸化水平的降低，从而模拟了MGO依赖性对内皮细胞胰岛素敏感性的影响。此外，通过miR-214绕过miR-214MGO依赖性下调，模拟了MAEC中的转染，观察到Akt磷酸化和PHLPP2水平的拯救效应，强化了我们的假设，即miR-215下调可能通过其新靶点PHLP2促进MGO依赖效应。此外，我们提供了第一个证据，即高MGO水平与Glo1KD小鼠主动脉组织中miR-214减少45%有关，这与之前在这些小鼠中观察到的与WT同窝小鼠相比胰岛素敏感性受损有关[21]. 事实上，该小鼠模型适合于MGO依赖性效应的体内研究，因为其特征是Glo1水平降低，这是导致MGO修饰蛋白积累和在无高血糖的情况下糖尿病并发症的发生的原因[22,23].

研究已经表明，PHLPP2可以直接去磷酸化Akt以抑制其在内皮细胞中的信号传导活性[14]. 在这项研究中，我们已经证明miR-214通过与PHLPP2的相互作用对MAEC的胰岛素反应性产生了负面影响，这是一个我们所知的以前没有报道过的新发现。

4.材料和方法

4.1. 试剂

用于细胞培养的培养基、血清和抗生素来自Lonza（美国马里兰州Walkersville）。MGO（水中40%）来自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。胰岛素来自Eli Lilly（意大利佛罗伦萨）。使用的抗体为抗p-ser473-Akt和抗PTEN（Cell Signaling Technology，Beverly，MA，USA）、抗α-微管蛋白（Sigma-Aldrich）、抗PHLPP1和抗PHLPP2（Bethly Laboratories，Montgomery，TE，USA，TE）、抗PTP1B和抗Akt（Santa Cruz，CA，USA。所有其他化学品均来自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。蛋白质电泳和蛋白质印迹试剂来自Bio-Rad（弗吉尼亚州里士满，美国），化学发光试剂来自Pierce（伊利诺伊州罗克福德，美国）。

4.2. 细胞培养

小鼠主动脉内皮细胞（MAEC）由Thomas Henry Fleming（德国海德堡海德堡大学）善意提供，并按照之前的描述进行培养[20]. 简言之，将MAEC置于T75烧瓶中，并在含有1 g/L葡萄糖并添加10%的Dulbecco改良培养基（DMEM）中生长(v（v）/v（v）)FBS，2毫摩尔/升我-谷氨酰胺和0.1 mmol/L非必需氨基酸。细胞培养保持在37°C，湿度为5%(v（v）/v（v）)CO公司₂将MGO添加到最终浓度为500μmol/L的培养基中，在MAEC中进行16小时的MGO暴露。根据指示，在含有0.25%无血清培养基中饥饿后，用100 nmol/L胰岛素刺激MAEC 10分钟(w个/v（v）)牛白蛋白血清（BSA）16小时。

4.3。miRNA靶点预测

miRWalk2.0是一个关于microRNA与靶点相互作用的综合图谱[50]用于特定miRNAs的靶向预测。

4.4. miRNA模拟物和抑制剂转染

miR-214水平通过用0.5、5或50nmol/L的miR-214-mimic（mmu-miR-214-miRIDIAN mimic）或miR-214-抑制剂（mmu-miR-214-miRIDIAN Harpin抑制剂）转染MAEC来调节。miR-126水平通过转染0.5、5和50 nmol/L miR-126-mimic（mmu-miR-126 miRIDIAN mimic）或miR-126-inhibitor（mmu-miR-126-miRIDIAN Harpin抑制剂）的MAEC进行调节。miRIDIAN microRNA模拟阴性对照品#1和miRIDIAN microRNA Harpin抑制剂阴性对照品#1（美国科罗拉多州拉斐特市达马孔）分别用作miRNA-Mimic和miRNA-Inhibitor转染的阴性对照品。根据制造商的说明，DharmaFECT 4被用作转染剂（Dharmacon）。转染48小时后，收获细胞并按如下所述进行。

4.5。Western Blot分析

MAEC在裂解缓冲液中溶解（50 mmol/L HEPES pH 7.5，150 mmol/LNaCl，10 mmol/LEDTA，10 mmol/L Na₂P（P）₂O（运行）₇，2 mmol/L钠_三VO（旁白）₄，100mmol/L NaF，10%甘油，1%Triton X-100）在4°C下保持2小时。蛋白裂解物通过16000×g离心20分钟进行澄清。然后用SDS-PAGE分离细胞裂解物，并转移到0.45μm Protran硝酸纤维素膜（Sigma-Aldrich）中。与一级和二级抗体孵育后（抗体的完整列表，见上文），通过化学发光检测免疫反应带，并使用ImageJ软件进行密度分析。

4.6. miRNA逆转录、miScript PCR阵列和实时PCR

从Glo1-knowdown（Glo1KD）小鼠的主动脉组织中分离出总RNA[21]，根据制造商的说明，使用miRNeasy迷你试剂盒（德国希尔顿QIAGEN）在Qiazol中均质后。在用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）定量后，使用miScript II RT试剂盒（QIAGEN）逆转录总RNA，并使用miScript SYBR Green PCR试剂盒（QIAGEN）通过实时PCR分析miRNA-214的差异表达，并量化为相对于U6 snRNA的表达单位，用作管家小RNA。

用于扩增的特定引物购自QIAGEN：

• Mm_miR-214_2 miScript引物分析，MS00032571
• RNU6B_13 miScript引物分析，MS0001400

4.7. 靶点抑制试验

miScript miR-214靶点保护剂（miR-214TP）是根据小鼠PHLPP2 mRNA 3′UTR中miR-215靶点的序列设计的，该靶点保护器来自美国马里兰州日耳曼敦市齐根市。miScript Target Protector是一种单链修饰RNA，与感兴趣的miRNA的结合位点互补，覆盖结合位点的侧翼区域，从而专门干扰miRNA与单个靶点的相互作用，而不影响同一miRNA的其他靶点的调控。转染后，miScript Target Protector结合到其特定的miRNA-binding位点，阻止miRNA进入该位点，并阻止特定miRNA的基因下调。

根据制造商的说明，使用DharmaFECT 4（Dharmacon）联合转染0.1 nmol/L miR-214 TP和50 nmol/L-miR-214-模拟物MAEC。转染48小时后，收集细胞并按如下所述分析PHLPP2蛋白水平。

4.8. 荧光素酶报告分析

将小鼠PHLPP2-3′UTR序列插入Firefly/Renilla Duo-Luciferase报告载体pEZX-MT06（GeneCopoeia，Rockville，MD，USA）[51]. 这里，萤火虫荧光素酶是受感兴趣的3′UTR控制的报告基因，而Renilla荧光素酶是内部控制。

根据制造商的说明，将MAEC置于6孔板中，并使用DharmaFECT 4（Dharmacon）与100 ng pEZX-MT06对照报告载体或pEZX-MT06/PHLPP2-3′UTR报告载体和50 nmol/L miR-214模拟物或非靶向对照寡核苷酸（模拟对照）共转染。根据制造商的说法，转染后20小时，使用双荧光素酶报告分析系统（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）和光度计（德国普福尔茨海姆市猎户座I号Berthold检测系统）测定细胞裂解液中的萤火虫和Renilla荧光素酶活性。结果表示为Firefly与Renilla活性的比值。实验一式三份。

4.9. 统计程序

数据表示为平均值±SD，如图图例所示。使用Student’s吨-测试。A类第页-小于0.05的值被认为具有统计学意义。

5.结论

总之，本研究首次证明了miR-214与胰岛素抵抗之间以及miR-214-依赖性胰岛素抵抗与内皮细胞PHLPP2之间存在重要联系。因此，这些发现突显了miR-214在糖尿病条件下的重要作用，并表明旨在恢复miR-219水平或抑制内皮细胞中PHLPP2蛋白水平的策略可能为胰岛素抵抗和血管并发症的新疗法的理论设计提供基础。