MicroRNA-331-3p靶向NRP2抑制宫颈癌细胞增殖和E6/E7表达

摘要

microRNAs（miRNAs）的异常表达参与了各种癌症的发展和进展。在本研究中，我们研究了miR-331-3p在子宫颈癌细胞增殖和角质形成细胞分化标记物表达中的作用。此外，我们评估了神经纤维蛋白2（NRP2）是否是调节人乳头瘤病毒（HPV）相关癌蛋白E6和E7的假定靶分子。使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲基氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2评估人类宫颈癌细胞系SKG-II、HCS-2和HeLa的细胞增殖小时-四氮唑，内盐（MTS）分析。使用TdT-介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）和Annexin V分析测定细胞凋亡。定量RT-PCR用于测量NRP2、E6、E7、p63和总括素（IVL）基因的信使RNA（mRNA）表达。使用细胞周期分析进行细胞生长功能分析。miR-331-3p的过度表达抑制SKG-II、HCS-2和HeLa细胞的增殖，并诱导G2/M期阻滞和凋亡。NRP2 3′-非翻译区荧光素酶报告子分析显示，NRP2由miR-331-3p直接调控。使用定量RT-PCR对SKG-II、HCS-2和HeLa细胞过度表达miR-331-3p或抑制NRP2的基因表达进行分析，结果显示E6、E7和p63 mRNA的下调和IVL mRNA的上调。此外，miR-331-3 p的过度表达在蛋白水平上抑制了NRP2表达。我们发现miR-331-3p和NRP2通过调节细胞周期、凋亡而成为细胞增殖的关键效应器。NRP-2还调节E6/E7和角质形成细胞分化标志物的表达。我们的研究结果表明，miR-331-3p在调节宫颈癌细胞增殖中具有重要作用，并且miR-331-3p可能通过抑制NRP2促进角质形成细胞分化。miR-331-3p和NRP2可能有助于抗癌作用。

1.简介

宫颈癌是全世界女性最常见的肿瘤之一。宫颈癌的发病机制发生在持续感染高危型人乳头瘤病毒（HPV）后，如16、18、31、33、39、45、52、58和69型HPV；它通过中断宫颈鳞状上皮的正常分化而进展缓慢[1,2]. E5、E6和E7蛋白存在于高危型HPV中，作为病毒癌蛋白发挥作用，并被认为与人类宫颈癌的发生有关[三,4,5]. E6和E7分别与参与细胞周期调节的肿瘤抑制蛋白p53和视网膜母细胞瘤（Rb）家族蛋白结合[5,6]. E6和E7对p53和Rb蛋白的失活可能是宫颈癌发生的重要步骤。最近的临床研究表明，辐射和分子靶向治疗结合E6/E7沉默可显著降低体内肿瘤生长[7].

微小RNA（miRNA）是一种短调控RNA，通过与靶基因转录物的互补位点结合，通过翻译抑制来控制基因表达[8,9,10]. miRNAs影响膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌和胃癌等多种癌症的细胞增殖、凋亡、细胞分化和上皮-间质转化（EMT）[11,12,13,14,15,16]. 宫颈癌中有一些致癌或抗癌因子的候选miRNA[17]. 评估异常高水平的miRNA有可能成为宫颈癌诊断的有用生物标志物[18]. 例如，miR-129-5p诱导干扰素β下调E6和E7表达[19]miR-26a和miR-342-3p通过IVA 1型蛋白酪氨酸磷酸酶和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径或叉头盒M1抑制细胞增殖和侵袭[20,21]miR-101通过抑制G1-S转换调节细胞周期[22]. miR-196a和miR-181b通过调节Forkhead box蛋白O1（FOXO1）和p27促进细胞增殖^基普1或腺苷酸环化酶9[23,24].

我们以前曾报道过syndecan-1（CD138）通过直接靶向神经纤维蛋白2（NRP2）和伏隔核相关蛋白1（NACC1）上调miR-331-3p的表达，从而介导前列腺癌细胞的EMT[13]. miR-331-3p抑制肿瘤生长，改善预后，并调节胶质母细胞瘤、前列腺癌和胃癌中NRP2、脱氧胆红素羟化酶和长非编码RNA Hox转录物反义基因间RNA（HOTAIR）和人上皮生长因子受体2（HER2）的表达[25,26,27]. 在本研究中，我们评估了miR-331-3p是否通过候选靶点NRP2调节宫颈癌增殖和HPV相关蛋白E6和E7的表达。此外，为了评估miR-331-3p是否通过改变角质形成细胞标记物的表达而促进角质形成细胞核的分化，我们通过定量逆转录-PCR（qRT-PCR）评估了p63和总花素（IVL）的表达。

2.结果

2.1. miR-331-3p过度表达抑制宫颈癌细胞增殖

为了研究miR-331-3p在宫颈癌细胞中的作用，我们进行了MTS分析以评估细胞增殖。miR-331-3p的过度表达显著降低SKG-II、HCS-2和HeLa细胞的细胞增殖(图1A） ●●●●。我们还评估了miR-331-3p抑制剂的作用，发现miR-331-3抑制剂不影响细胞增殖（数据未显示）。为了确定这种抑制的机制，我们通过TdT介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）和Annexin V分析评估了细胞凋亡，发现SKG-II细胞中凋亡细胞的数量显著增加(图1B和图2). miR-331-3p前体的转染效率如所示图1C.miR-331-3p在SKG-II、HCS-2和HeLa细胞中的表达水平分别上调了1292倍、820倍和715倍。我们评估肌动蛋白mRNA的表达作为内部对照。在处理实验中没有显著差异(C类_t吨值（对照/miR-331-3p预转染/NRP2 siRNA转染）；SKG-II细胞：13.43±0.08/13.50±0.11/13.55±0.16），HCS-2细胞：15.17±0.18/15.56±0.10/14.69±0.03，HeLa细胞：14.18±0.17/14.37±0.01/14.28±0.07）。综上所述，这些数据表明miR-331-3p通过诱导凋亡调节宫颈癌细胞的细胞增殖。

2.2。miR-331-3p显著降低HPV相关蛋白E6和E7的表达

为了评估miR-331-3p是否在HPV感染的鳞癌细胞系中调节E6和E7表达中起作用，我们进行了qRT-PCR分析。miR-331-3p的过度表达显著抑制SKG-II、HCS-2和HeLa细胞中E6和E7 mRNA的表达(图3A） ●●●●。miR-331-3p过表达诱导p63下调和IVL上调(图3B） ；然而，miR-331-3p的抑制没有诱导这样的变化（数据未显示）。数据显示，miR-331-3p控制E6/E7和角质形成细胞分化标记物的表达。

2.3. NRP2在SKG-II细胞中的表达直接介导miR-331-3p抑制细胞增殖

我们之前使用TargetScan分析（2012年6月6.2版）和RNAhybrid 2.2（德国比勒费尔德Bielefeld生物信息服务公司）在电子版中筛选了miR-331-3p的几个假定靶点，并将NRP2和NACC1确定为miR-331-3的预测靶点[13]. 在本研究中，我们评估了这些蛋白是否作为宫颈癌细胞中miR-331-3p的靶分子。NRP2的表达在SKG-II中最高，并且在SKG-Ⅱ、HeLa和HCS-2细胞中miR-331-3p的过度表达显著降低(图4A–C），但NACC1未因SKG-II细胞中miR-331-3p过表达而改变（数据未显示）；因此，NRP2可能作为宫颈癌细胞中miR-331-3p的靶点。为了证实这一点，我们构建了Gluc和SEAP报告基因克隆载体（pEZX-GA01），并克隆了全长NRP2 3′非翻译区（UTR）。miR-331-3p前体转染的效果通过荧光素酶报告试验测定(图4D） ●●●●。抑制NRP2表达显著降低细胞增殖，而凋亡细胞的数量显著增加(图5A、 B和图6)SKG-II、HCS-2和HeLa细胞中。此外，抑制NRP2抑制E6、E7和p63的表达，并诱导IVL的表达(图7). 这些结果表明，NRP2直接作为靶分子发挥作用，并通过表达E6/E7和角质形成细胞分化标记物，对miR-331-3p对细胞增殖的影响起重要作用。

2.4. miR-331-3p抑制NRP2诱导G2/M期细胞周期阻滞

为了探讨miR-331-3p和NRP2调控细胞增殖的机制，我们评估了DNA含量指数。miR-331-3p过表达或NRP2抑制增加G2/M期细胞数量(图8A） ●●●●。为了确认细胞周期中的G2/M期阻滞，我们使用细胞周期相关因子的引物阵列进行qRT-PCR。一些与G2/M相变相关的分子被发现减少(图S1). Western blotting和免疫细胞化学显示miR-331-3p过度表达和NRP2抑制抑制了细胞质p16INK4a蛋白水平(图8B） ●●●●。这些结果表明，miR-331-3p过度表达和NRP2抑制导致宫颈癌细胞G2/M期阻滞和p16INK4a下调。

3.讨论

源于HPV的病毒致癌基因在宫颈癌进展中起着关键作用。HPV感染癌症的致癌转化是由病毒基因组整合到宿主染色体中触发的，这导致E6和E7蛋白表达增加[28]. 在本研究中，我们发现miR-331-3p过表达通过诱导人宫颈癌细胞株G2/M期细胞周期阻滞和凋亡来调节细胞增殖。此外，发现NRP2是miR-331-3p的直接靶点，沉默NRP2对细胞增殖的影响与miR-331-3p过度表达的作用相同。我们的研究清楚地表明，miR-331-3p和NRP2轴可能在宫颈癌细胞的生长中发挥重要作用。

p63是p53家族转录因子的一员，在非肿瘤性鳞状上皮的基底细胞和副基底细胞以及包括宫颈癌在内的肿瘤对等物中表达。p63表达的免疫组织化学分析可能是评估大多数鳞状细胞癌（如宫颈癌）的重要工具[29,30]. 人乳头状瘤病毒的生命周期与角质形成细胞的分化密切相关。一旦鳞状上皮的基底细胞被HPV感染并整合，病毒基因组产物E6和E7介导上皮分化[6]. E6蛋白直接影响IVL启动子特异性下调IVL表达[31]. 在目前的研究中，miR-331-3p过度表达显著下调NRP2、E6和E7蛋白，并依次上调IVL表达，这可能会诱导角质形成细胞分化，正如人类宫颈癌细胞中p63蛋白表达降低所确定的那样。综上所述，我们得出结论，miR-331-3p通过调节HPV活性与宫颈癌进展密切相关。

细胞蛋白p16INK4a在HPV感染的宫颈上皮中过度表达，在E7蛋白表达的反应下发生转化[32,33]. p16INK4a是一种细胞周期素依赖性激酶抑制剂，可减慢细胞周期并发挥肿瘤抑制基因的作用[34]相反，在许多人类癌症中，细胞核和细胞质中p16INK4a的过度表达与宫颈鳞癌的癌症进展密切相关[35,36]. 因此，联合检测E6/E7 mRNA和p16INK4a蛋白是组织学诊断和临床预后评估的有用生物标志物[34,37,38,39,40,41]. MiR-331-3p被认为是与癌症相关的miRNA之一。在胃癌、结直肠癌、前列腺癌和胶质母细胞瘤中，miR-331-3p的表达显著下调[25,27,42,43,44]. 在结直肠癌细胞中，miR-331-3p的过度表达抑制细胞生长，促进凋亡，并通过抑制HER2的表达激活caspase-3[42]. 在胃癌中，miR-331-3p通过直接抑制E2F1基因表达，导致细胞周期阻滞，从而在细胞增殖中发挥关键调节器的作用[43]. 因此，miR-331-3p可以被认为是肿瘤抑制基因。另一方面，miR-331-3p通过直接靶向PH结构域和富含亮氨酸的重复蛋白磷酸酶促进增殖和转移，在肝细胞癌中发挥致癌miRNA的作用[45]. 因此，miR-331-3p是起肿瘤抑制作用还是致癌作用取决于肿瘤类型。迄今为止，在宫颈癌中没有miR-331-3p的报道，miR-331-3和NRP2的作用尚不清楚。在我们目前的研究中，我们已经表明miR-331-3p在宫颈癌中发挥了肿瘤抑制miRNA的作用。NRP2是miR-331-3p的假定靶点，是信号磷蛋白3和血管内皮生长因子家族成员的共同受体，作为癌基因发挥作用，在一些人类癌症中显示高表达，包括肺癌、结直肠癌、胰腺癌和胶质母细胞瘤[25,46,47,48,49]. 在当前研究中，p16INK4a显著降低，同时通过角质形成细胞分化抑制细胞增殖和诱导凋亡；通过miR-331-3p过度表达或NRP2抑制降低p63和增加IVL表达，作为角质形成细胞分化的指标。这些发现表明，miR-331-3p有助于抑制进展或通过角质形成细胞分化从高级别向低级别转化。

我们在这里提供了涉及miR-331-3p过度表达可诱导人类宫颈癌细胞G2/M期细胞周期阻滞机制的关键分子，使用Primer Array系统，重点关注E6-p53和E7-Rb通路。结果，Rb mRNA表达没有改变，p53和p21 mRNA表达降低。这些结果可能是由miR-331-3p抑制NRP2后E6和E7显著减少介导的，p53同时与NRP2相互作用[50]，以减少p21。G2/M期阻滞可能是由miR-331-3p过度表达抑制几个G2/M相相关分子引起的。

在我们目前的研究中，我们没有显示宫颈癌组织的临床意义数据。为了提供更多临床诊断工具可用性的证据，重要的是使用qRT-PCR和免疫组织化学方法评估宫颈癌和/或异型增生中miR-331-3p及其靶分子、NRP2的表达。未来，我们将评估miR-331-3p和NRP2在宫颈癌和异型增生中的表达。

4.材料和方法

4.1、。单元格行

人宫颈癌细胞系SKG-II、HeLa和HCS-2购自JECB细胞库（日本大阪国立生物医学创新研究院）。SKG-II细胞在添加10%胎牛血清（日本东京NICHIREI BIOSCIENCES INC.）和50 U/mL青霉素-链霉素（日本京都Nacalai tesque）的Ham’s F12培养基中培养。HeLa和HCS-2细胞在添加了10%或15%胎牛血清和50 U/mL青霉素-链霉素的Dulbecco改良鹰培养基（Nacalai tesque）培养基中培养。

4.2. 宫颈细胞系中的miRNA前体和siRNA转染

为了进行转染，SKG-II、HeLa和HCS-2以1.5×10的比例接种⁵将Pre-miR™miRNA前体hsa-miR-331-3p（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）或针对NRP2和NACC1的100 ng/L siRNA转染6孔培养皿中的细胞/孔，转染72小时。使用Pre-miR-miRNA-Precursor Molecules Negative control#2（Life Technologies）作为对照分子。根据制造商的说明，使用Lipofectamine RNAiMAX（Life Technologies）进行Pre-miR™miRNA前体或NRP2 siRNA转染。选择合适的DNA靶点后设计NRP2 siRNA序列，如下所示：NRP2；5′-CAGGCTCTGAAGATGCTCAA-3′。

4.3. miRNA和mRNA的qRT-PCR分析

为了纯化总RNA，包括来自细胞的miRNA，我们使用了miRNeasy迷你试剂盒（德国希尔登QIAGEN）。对于qRT-PCR，使用PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real-Time）和SYBR Premix Ex Taq II（TliRNaseH Plus）（日本大津县塔卡拉）从1µg总RNA合成第一链cDNA。qPCR条件为95°C持续30 s，然后55–63°C持续30s，共35–45个周期。所用引物如下：NRP2为5′-CTGGAAGTCACTAATGGAGAG-3′；NRP2反义5′-GCATCGTTGTTGGCTTGAAATACC-3′；E6感测5′-CTCGTGTATGGACACATTGGAA-3′；E6反义5′-GGCACGCGCACCTTA-3′；E7义5′-TAGAAAGCTCAGCACGACCTT-3′；E7反义5′-GCACACCACGACACAAA-3′；p63义5′-GAAGCAGCAGTTTCGGAC-3′；p63反义5′-TTTCATAAGTCTCACGGCCC-3′；IVL感测5′-AGCTTACTGAGTCTGGTTGA-3′；IVL反义5′-GGGTATTGACTGAGGAGGAAACA-3′；肌动蛋白5′-CTCTTTCCAGCCTCTCCT-3′；肌动蛋白反义5′-AGCACTGTGGTACAG-3′。使用PrimerArray cell cycle（日本大津县高原县）通过qPCR对细胞周期相关基因进行基因表达分析。

4.4. 细胞增殖试验

如前所述，使用CellTiter 96水溶液单溶液细胞增殖试验（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）进行MTS试验[51]测量细胞增殖。数据收集自三次重复实验。

4.5. 荧光素酶报告分析

对于荧光素酶报告试验，SKG-II和HeLa细胞接种于1×10⁵24孔板中每孔细胞数，24小时后转染100 ng高斯（Gaussia）荧光素酶（Gluc）和分泌型碱性磷酸酶（SEAP）报告质粒DNA（NRP2或阴性对照；Genecopoeia，Rockville，MD，USA）和5 nM的miR-331-3p前体。24小时后，使用Secrete-Pair Dual Luminescence Assay Kit（Genecopoeia，Rockville，MD，USA）对裂解产物进行Gluc和SEAP分析。

4.6. 细胞活性和细胞周期分析

按照制造商的说明，使用Millipore（加利福尼亚州海沃德，美国）的Muse™细胞分析仪进行细胞周期和Annexin V分析。简单地说，将miRNA前体或siRNA转染到SKG-II、HCS-2或HeLa细胞后，用PBS冲洗处理过的细胞。然后使用Muse™细胞周期试剂盒和Muse^TM（TM）根据制造商的协议，分别进行Annexin V和Dead Cell Assay（Millipore）。

4.7. Western Blot和免疫细胞化学分析

为了进行western blot分析，用十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺电泳分离处理过的细胞裂解物，并将其转移到聚偏二氟乙烯膜（Millipore）上，然后在室温下将其封闭在5%脱脂牛奶中1小时。将膜与指示的一级抗体孵育，如抗NRP2（英国伦敦Abcam）和抗CDKN2A/p16INK4a（Abcam。使用增强化学发光检测系统在X射线胶片上检测过氧化物酶活性。对于免疫细胞化学，用富含细胞的红色保存液（BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA）固定处理过的细胞，并按照SurePath™方法（BD生物科学）制备。将制备好的载玻片与一级抗体（抗CDKN2A/p16INK4a，英国伦敦Abcam）在室温下孵育1小时，并使用日本东京Nichirei组织精细试剂盒对反应进行可视化，使用二氨基联苯胺作为显色剂，苏木精作为副染色剂。

4.8. TdT介导的dUTP Nick End标记（TUNEL）分析

收集转染miR-331-3p前体或NRP2 siRNA 72 h的SKG-II、HCS-2和HeLa细胞，并用富含细胞的红色保存液（BD Biosciences）固定，并按照SurePath™方法（BD bioscience）制备。用ApopTag Plus过氧化物酶原位凋亡检测试剂盒（Millipore）对制备好的载玻片进行染色。

4.9. 统计分析

使用双尾Student’st吨-测试两组之间的比较。图形数据以平均值±SEM表示第页<0.05被认为是显著的。所有实验均一式三份。

5.结论

总之，这些发现表明miR-331-3p过度表达通过调节细胞周期和凋亡抑制宫颈癌细胞增殖(图9). 我们未来的研究将检验miR-331-3p及其靶点NRP2是否是有用的临床诊断和/或预后标记物，用于组织学和细胞学检查，以及用于宫颈癌筛查和诊断的液基细胞学检查。