二维电泳差异表达蛋白质分析指南

双向电泳是指第一方向的等电聚焦电泳和第二方向的SDS-PAGE。样品的电荷和相对分子量分离两次后，就可以得到分子的等电点和相对分子质量。分离的结果不是一个带，而是一个点。根据Csrtesin坐标系，从左到右是pI的增加，从下到上是相对分子量的增加。这是所有电泳技术中分辨率最高、信息最多的技术。近年来，通过各种改进，它已成为蛋白质组研究中最有价值的核心方法。

利用双向电泳发现蛋白质差异是研究差异表达蛋白质最重要和最常用的方法之一。本实验手册重点介绍了双向电泳的主要方法、差异蛋白质的分析方法和参数的优化。

掌握双向电泳分析差异表达蛋白质的基本原理和主要步骤，掌握双向电泳的操作方法和ImageMaster分析软件的应用。

第一方向等电聚焦：等电聚焦是在凝胶柱中加入一种称为两性电解质载体的物质，使凝胶柱在电场中形成稳定、连续、线性的pH梯度。从电泳的角度来看，蛋白质最重要的特征是其带电行为。它们在不同的pH环境中携带不同数量的正电荷或负电荷。只有在一定的pH值下，蛋白质的净电荷才为零，而这个pH值就是蛋白质的等电点（pl）。在电场中，蛋白质分子在pH环境中以大于其等电点的阴离子形式移动到正极，在pH环境下以小于其等电点值的阳离子形式移动到负极。如果含有各种等电点的蛋白质混合样品在pH梯度环境中电泳，无论混合蛋白质分子的原始分布如何，它们都会根据各自的等电点大小聚集在pH梯度的某个位置。焦点位置蛋白质点的净电荷为零，蛋白质的等电点可以通过测量焦点位置的pH值来确定。

双向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：SDS是一种阴离子表面活性剂。当蛋白质溶液中加入足够的SDS时，可以形成蛋白质SDS复合物，从而改变蛋白质的电荷和构象。SDS降低了蛋白质分子的二硫键，使各种蛋白质-SDS复合物携带相同密度的负电荷，其数量大大超过蛋白质分子的原始电荷量，从而覆盖了不同蛋白质之间的原始自然电荷差异。就构象而言，蛋白质SDS复合体形成一个类似雪茄的长卵形条。这种蛋白质SDS复合物在凝胶中的迁移不再受蛋白质原始电荷和形状的影响，而只取决于相对分子量的大小，因此我们可以通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）来确定蛋白质的相对分子量。

1.主要仪器设备

微量吸管、垂直电泳仪、水平电泳仪、低温循环水浴、脱色摇床、扫描仪、ImageMaster 2D Platinum 5.0版软件。

2.材料

制备的蛋白质样品。

3.主要试剂^*1

（1） 裂解液^*2

（2） 水合溶液

（3） 平衡缓冲区^*5

（4） Bind-slane工作溶液^*6

（5） 盖帽琼脂糖溶液

1.样品装载。24cm胶带的装载体积约为750-1000μg蛋白质样品*7，与水合溶液混合的总体积为450μL。

2.第一方向等电聚焦^*8.设置IPGphor仪器的操作参数。工作温度为20°C，每条胶条的最大电流为50μA，并显示以下电压设置。

3.从一个方向到两个方向的平衡^*10

（1） 将橡胶条放入20mL平衡缓冲液I中（包括1%DTT^*11)密封，并在振动台上摇晃15分钟。

（2） 取出胶带，放入20mL平衡缓冲液II（含2.5%碘乙酰胺）中密封，在振动台上摇晃15分钟^*12.

（3） 用新制备的电泳缓冲液冲洗胶带，将胶带边缘放在滤纸上几分钟，去除多余的液体，准备进行双向凝胶电泳。

4.双向电泳（SDS-PAGE）

双向电泳装置如下图所示，包括电源、电泳槽和循环水浴。

（1） 将配制好的粘结硅烷工作液均匀加入玻璃板中，用无尘纸均匀擦拭，一般重复擦拭三次。每次擦拭后，在下次擦拭之前将其干燥。玻璃板可以用来倒凝胶^*13在室温下干燥2h后。

（2） 填充模具^*14，如下图所示：

（3） 配制凝胶溶液^*15根据以下成分。超声波脱气5min后，加入TEMED和过硫酸铵，搅拌均匀，然后倒入胶水，用水密封。

（4） 电泳前，打开模具，用去离子水清洗玻璃板，用电泳缓冲液清洗凝胶表面3次以上。

（5） 将平衡好的胶带放在玻璃板之间的凝胶表面上，使胶带支撑膜贴在其中一块玻璃板上，用薄尺轻轻向下推IPG胶带（如下图所示），使整个胶带的下边缘与板粘合剂的上表面完全接触。确保IPG胶带和板粘合剂之间以及玻璃板和塑料支撑膜之间没有气泡。

（6） 将标准相对分子质量蛋白质溶液与相同体积的1%琼脂糖溶液混合后，加入滤纸中。固化后，将其添加到凝胶表面。

（7） 最后，用1～1.5mL含有少量溴酚蓝的0.2%琼脂糖封口液封口顶部，使IPG胶条完全覆盖，在此过程中不产生气泡。

（8） 进行双向电泳（SDS-PAGE），电泳参数设置如下：

5.凝胶染色

为了与质谱兼容，通常使用考马斯亮蓝法。

6.凝胶扫描

使用扫描仪扫描染色凝胶，并将其存储为Tif格式文件以备备份。

7.双向电泳分析

双向电泳模式分析的一般过程是获得凝胶图像。调整并校准凝胶图像。蛋白质点的识别和量化。注释蛋白质点和像素。匹配凝胶图像。分析、整合数据并报告结果。这个过程检查并分析蛋白质的双向电泳结果，以确定下一个实验的方向。应用软件为ImageMaster 2D Platinum 5.0版。

（1） 启动软件：程序→ImageMaster 2D Platinum→ImageMaster

（2） 导入凝胶图像：文件→导入→图像。所选图像格式通常为Tif或Gel格式^*17.

（3） 创建新工作区（单击)和项目（单击)^*18

（4） 将凝胶分组^*19：右键单击“凝胶”→添加新类→组（如Control和Treated）→选择组，右键单击→对导入的图像进行分组。如下图所示：对照组和治疗组。

（5） 图像调整^*20：执行视图→调整对比度→当前。要一起调整多片胶水，首先选择→凝胶→全部或Ctrl+A/B。调整一片胶水时，左键单击胶水的上边缘使其变绿。粗略调整时，可以用鼠标拖动下图中的滑块。在微调过程中，可以通过在两侧的输入框中输入准确的值来进行调整。“弯曲”用于降低背景，使观察点更容易视觉化。选择然后用胶水将图像放大。选择移动胶水位置。双击图像中的一个点，将多块胶水调整到同一位置。

（6） 点查找^*21：选择，选择图像上蛋白质点密集清晰的区域，执行编辑→斑点→自动检测→当前操作。软件将在选定区域中查找点。之后，检查自动找点的效果。根据区域情况调整找点参数。“平滑”表示蛋白质点外边缘的平滑度。该值越高，蛋白质点的外边缘越靠近圆，但如果设置得太高，程序很容易将多个点视为一个点。“最小面积”是蛋白质斑点的最小面积。面积小于该值的点将被过滤掉，该值可用于清除灰尘和其他杂点。

（7） 不同胶蛋白斑点的匹配：

① 参考胶设置^*22：执行编辑→分组→设置参考凝胶

② 蛋白点匹配：首先选择标记蛋白点^*23（Landmark）作为软件匹配不同凝胶的参考。Landmark可以选择多个。点击，用鼠标左键选择蛋白质点，然后单击“Shift+鼠标左键”选择与其他胶水上的点匹配的蛋白质点，执行编辑→注释→添加标签→Landmark→确定。选择Landmark后，执行凝胶匹配：执行编辑→对编辑→自动匹配凝胶^*24.

（8） 数据报告

① 凝胶信息：选择所有凝胶和蛋白质斑点，点击报告→凝胶报告→当前。

② 蛋白质斑点信息：选择所有凝胶和蛋白质斑点，点击报告→斑点报告→当前。

③ 观察放大倍数的变化：选择所有凝胶和蛋白质斑点，执行分析→分组报告。

④ 胶水和胶水的区别。在“组报告”对话框的右上角，从下拉框中选择“比率”，也就是说，您可以看到另一种胶水处匹配点的信号强度与参考胶水的比率。

（9） 数据输出：单击可将所有结果复制到Word、Excel、PowerPoint和其他软件.

8.差异蛋白点挖掘^*25

参照ImageMaster软件获得的差异斑点凝胶图谱，在凝胶上相应位置找到蛋白质斑点，将一个200μL的移液管尖端插入凝胶斑点位置，尖端部分被切断，然后用移液管将凝胶斑点吸入尖端，放入1.5 mL离心管中，并储存在-80°C冰箱中。

附录1等电聚焦中的常见问题和解决方案。

附录2垂直板电泳常见问题及解决方法。

1.离子是等电聚焦电泳过程中相对较大的干扰因素，会导致电流过大，在上升过程中电压达不到规定电压，导致蛋白质分离不完全。因此，在实验过程中应尽可能避免引入离子。例如，蛋白质提取方法的测定，超纯水的使用等。

2.如果二维电泳分离的蛋白质点需要质谱鉴定，应注意选择不干扰质谱的染色方法，如考马斯亮蓝法。

3.重复性是双向电泳中需要注意的问题之一，因此在操作过程中应保持试剂、操作过程、实验条件和样品制备方法的一致性，以确保双向电泳的重复性，并获得可靠的结果。

*1主要试剂仅为电泳所需的试剂。

*2这里只列出了一种常见的裂解液。在实验过程中，可以根据样品要求选择其他合适的裂解液。

*3 DTT和IPG缓冲液需要在使用前新鲜制备和添加。

*4根据不同pH值范围的胶带选择合适的IPG缓冲液，使用浓度参考具体操作说明。

*5使用前，将DTT添加至最终浓度1%，或将碘乙酰胺添加至第一次和第二次平衡的最终浓度2.5%。

*6溶液应在通风橱中制备。此4mL可涂上玻璃板三次。

*7本节以24cm胶带为例进行讨论。样品装载量可以根据染色方法来确定。

*电泳主要基于伏特-小时（Vh）。不同长度和不同pH范围的板条的电压设置有不同的参考值，可以根据操作手册进行设置（本节用于24cm长板条的参数设置）。

*9此步骤达到55000 Vh后，继续下一步或终止等电聚焦。

*10平衡的目的是使蛋白质分子与SDS充分相互作用，以确保第二方向的顺利迁移。

*11使用前应将DTT和碘乙酰胺添加到天平缓冲存储器中。

*12注意平衡时间。如果时间太短，将影响蛋白质从IPG转移到SDS的效率。如果时间过长，等电聚焦带会扩散。

*13建议在通风柜中执行此步骤。

*14填满胶水的模具可以一次制备6片凝胶。

*15这种凝胶的浓度为12.5%。

*16普通扫描仪保存的图像大多为Tif格式，台风9400扫描仪保存的图片大多为凝胶格式。

*17根据样品命名。

*18分为对照组和治疗组，每组样品应保证至少重复3次进行统计分析。

*19使凝胶上的蛋白质斑点易于观察和发现，而不改变蛋白质斑点的真实信号值。

*20软件自动找到的点有时会导致错误，例如两点被误认为一点，或一点被误认为两点，或漏掉一些点。这些错误可以通过手动更正来解决。

*21设置参考胶水。一般来说，图像清晰，有许多蛋白质斑点。

*22通常，在几块胶水中相对清晰并能准确找到匹配点的点被设置为Landmark。

*23如果自动匹配有问题，可以执行手动校正。可以执行以下操作：剪切、展开、合并、添加和删除。

*24为了避免操作过程中可能产生的污染，此操作需要在清洁的环境中进行。将考马斯亮蓝染色的凝胶放入超纯水中，戴上口罩、帽子和一次性塑料手套。

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