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一般流程
1. 用聚乙烯亚胺或多聚赖氨酸涂覆盖玻片,在室温下放置 1 小时。
2. 用无菌水充分漂洗盖玻片 3 次,每次 1 小时。
3. 充分干燥盖玻片,在紫外光下灭菌至少4小时候
4. 使细胞在玻璃盖玻片上生长,或制备细胞分裂素或涂片制备物。
5. 用磷酸盐缓冲液(公共广播公司)推荐使用1×PBS 0.1%吐温20作为洗涤缓冲液。
固定
中国:
1. 室温下,在 100% 甲醇(-20 ℃ 冷冻)中孵育细胞 5 分钟。
2.添加4%的聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBS),pH值7.4
用冰PBS咖啡馆
批准(可选步骤)
在抗原修复缓冲液对细胞进行加热处理后,有些抗体的效果会更好。查看产品信息,了解每种一抗的使用建议。
1. 将抗原修复缓冲液(100 mM Tris,5%[w/v],pH 9.5)预计95℃具体方法为:将装有缓冲液的盖玻片染色缸置于水浴锅中,水浴锅的温度设为 95 ℃。
2. 用小型宽头镊子小心将盖玻片置于盖玻片染色缸内的抗原修复缓冲液中,记下长有细胞的盖玻片面。
3. 在 95 ℃ 下加热盖玻片 10 分钟。
4. 从抗原修复缓冲液中取出盖玻片,浸入 6 孔组织培养板内的公共广播系统溶液中,保持长有细胞的一面朝上。
5.PBS(公共广播电视台)
通透
如果靶蛋白位于细胞内,对细胞进行通透处理尤为关键。用丙酮固定的样品不需要进行通透处理。
1.PBS(0.1–0.25%Triton X-100或100μM Digitonin或0.5%Saponin)渗渗渗渗渗渗渗渗渗渗渗渗渗渗渗Triton®声波风廓线仪X-100会破坏细胞膜,因此不适用于细胞膜抗原。
2. 确定每种目标蛋白的Triton X-100
3.PBS(公共广播电视台)
封闭与免疫染色
1.1%BSA、22.52 mg/mL PBST(PBS+0.1%吐温20)分钟,封闭抗体的非特异性结合(可替代的封闭液包括 1%明胶或来源于产生二抗的物种的 10% 血清:查看抗体数据表了解相关建议)。
2. 室温下,用稀释抗体(1%BSA PBST中国) 1 小时,或 4 ℃ 过夜孵育。
3.中国人民银行股份有限公司
4. 室温下,用二抗(1%英国标准协会中)避光孵育细胞 1 小时。
5. 倒出二抗溶液,用中国人民银行股份有限公司
多色染色(可选步骤)
要检测同一个样品中两种或多种抗原的共同分布情况,需要使用双重免疫荧光流程。该流程可在混合物中同时进行检测,也可逐个抗原依次进行检测。
确保抗体来源于不同物种并且这些抗体有相应的二抗。例如,抗抗原 A类的兔抗体和抗抗原B类的鼠抗体。也可使用偶联至不同荧光团的直标一抗。
同时孵育
1用封闭液孵育细胞 30 分钟。
2. 室温下,用两种一抗(1%BSA PBST中)在湿盒中孵育细胞 1 小时,或 4 ℃ 过夜孵育。
4. 室温下,用两种二抗(血清白蛋白1%中)避光孵育细胞 1 小时。
依次孵育
1第一封闭步骤:室温下,用第一封闭液(来源于产生二抗的物种的 10% 血清)孵育细胞 30 分钟。
2. 室温下,用第一种一抗(1%BSA或1%PBST中)在湿盒中孵育细胞1、4℃(1%BSA PBST)
3. 倒出第一种一抗溶液,用PBS(公共广播电视台)
4. 室温下,用第一种二抗(1%BSA PBST中)避光孵育细胞 1 小时。
5. 第一节中国人民银行股份有限公司
6. 第二封闭步骤:室温下,用第二种血清(来源于产生二抗的物种的 10% 血清)避光孵育细胞 30 分钟。
7. 室温下,用第二种一抗(1%BSA或1%PBST中国) 1 小时,或 4 ℃ 过夜孵育。
8. 倒出第二种一抗溶液,用中国人民银行股份有限公司
9. 室温下,用第二种二抗(血清白蛋白1%中)避光孵育细胞 1 小时。倒出第二种二抗溶液,用中国人民银行股份有限公司
如需检测两种以上的抗原,其余抗体按照步骤 1–5 继续操作。
复染
1.约0.1-1μg/mL Hoechst或DAPI(DNA染色)孵育细胞 1 分钟。
2.PBS条款
封片
1. 用一滴封片介质封闭盖玻片。
2. 用指甲油密封盖玻片,避免样品变干和在显微镜下移动。
3. -20 ℃ 或 4 ℃ 下避光保存。